KR100942065B1 - 열성 치사 유전자형 개체 감별용 유전자 마커 및 이를포함하는 감별 방법 - Google Patents
열성 치사 유전자형 개체 감별용 유전자 마커 및 이를포함하는 감별 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100942065B1 KR100942065B1 KR1020070115083A KR20070115083A KR100942065B1 KR 100942065 B1 KR100942065 B1 KR 100942065B1 KR 1020070115083 A KR1020070115083 A KR 1020070115083A KR 20070115083 A KR20070115083 A KR 20070115083A KR 100942065 B1 KR100942065 B1 KR 100942065B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- flounder
- genotype
- seq
- gene
- recessive lethal
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 열성 치사 유전자형 넙치 감별용 유전자 마커에 관한 것으로, 구체적으로 넙치 변태시기에 치사를 유도하는 넙치 열성 치사 유전자, 열성 치사 유전자형을 갖는 개체 감별용 유전자 마커 및 상기 유전자 마커를 이용한 상기 열성 치사 유전자형을 갖는 개체의 감별방법에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 마커를 이용하여 넙치의 변태시기에 치사를 유도하는 유전자형을 갖는 개체의 감별에 유용하게 사용하여 보다 정확하고 효율적인 분자육종을 가능하게 할 수 있다.
넙치, 열성 치사 유전자, 유전자 마커, 변태
Description
본 발명은 열성 치사 유전자형 넙치 감별용 유전자 마커에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 넙치 변태시기에 치사를 유도하는 넙치 열성 치사 유전자, 치사 유전자형을 갖는 개체 감별용 유전자 마커 및 상기 유전자 마커를 이용한 상기 열성 치사 유전자형을 갖는 개체의 감별방법에 관한 것이다.
1. 넙치 품종 개량
경제적 또는 생물학적으로 중요한 형질들의 발현에 관여하는 게놈 내의 특정부위에 대한 유전자 마커(genetic marker)들을 확보하기 위한 작업은 연관유전자지도 작성뿐만 아니라 수산생물의 개량 면에서도 중요하다. 즉 이러한 마커에 의한 감별을 통해 생물의 사육 초기 단계 내지 최종단계에서 발견될 특성을 미리 선발할 수 있어 품종개량에 응용되고 있다.
넙치(Paralichthys olivaceus)는 우리나라 총 어류 양식생산량의 절반 정도 를 차지하는 주요 어종으로 양식어민의 소득원이 되고 있으나, 발생 초기 변태과정을 거치면서 생존율이 저하되는 현상을 나타낸다. 그러나 상기 생존율 저하되는 현상에 관련한 유전자형을 발굴하여, 발생 초기에 치사하는 유전자형을 포함하는 개체를 감별함으로써 넙치 품종개량에 활용될 수 있다.
2. 부수체 마커
부수체(Microsatellite)는 DNA 염기 서열 중에서 반복되는 서열로, 1 내지 7 bp까지의 반복되는 DNA 서열로 존재하고 모노뉴클레오티드(mononucleotide; AAA등), 디뉴클레오티드(dinucleotide; CA, TA, CG 등), 트리뉴클레오티드(trinucleotide; CTG, CGG 등), 테트라뉴클레오티드(tetranucleotide; TAAA 등), 펜타뉴클레오티드(pentanucleotide) 등의 종류가 다양하다. 부수체는 특정 염색체의 제한된 영역에 대한 지도 작성 또는 어떤 유전병의 원인유전자 해석을 위한 유전자형 검사에 사용될 수 있는데, 상기 부수체의 특정 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용함으로써 가능하다. 유전자형 검사에 이용되는 부수체의 부위는 정해져 있으며 이를 부수체 마커(Microsatellite marker)라고 한다. 다양한 다형성 DNA 마커 중에서 간단한 PCR의 방법으로 많은 대립유전자에 대해 검사할 수 있는 부수체 마커를 많이 이용하는 추세이다. 현재 사람의 전체 게놈에서 3000개 이상의 부수체 마커가 분리 및 등록돼있고, 모든 부수체 마커의 정보는 인터넷상의 GDB, CHLC, OMIM 및 Genethon 등에서 얻을 수 있다.
2. 분리비 변형 현상
일반적으로 유전자형은 멘델 유전 법칙에 의해 유전자형이 분리되는데, 특정 유전자형이 제거되거나 분리비에서 벗어날 수 있는 현상이 일부 관찰되기도 한다. 이러한 분리비 변형(Segregation ratio distortion) 현상은 유해한 유전자형에 의해 일부 특정 유전자형이 완전히 제거되는 현상에 의해 발생할 수 있음이 보고된바 있다. 특정 유전자형의 분리비 변형 현상은 상기 유전자형의 유전자 마커를 이용함으로써 감수분열 드라이브(meiotic drive; Ruvinsky A., Mamm . Genome, 6:315-320, 1995), 유전자 각인(genomic imprinting; Solter D., Annu . Rev . Genet ., 22:127-146, 1988) 또는 배아 발생기에 유해한 영향을 주는 유전자 좌(Lie O.A. et al ., Anim . Biotechnol, 5:33-45, 1994; Renard J.-P. et al ., Development, 120:797-802, 1994; Weichenhan D. et al ., Genet . Res ., 68:125-129, 1996; Stizinger S.M. et al ., Mol . Gen . Genet ., 261:142-151, 1999) 등의 확인에 사용되어 왔다. 즉, 생물이 생존을 위한 발생이 계속되지 못하여 특정 발생단계에서 사망함으로 인한 유전자형 분리비 변형 현상이 확인되었고(Uenishi H. et al ., Plant and Animal Genome VIII. The international Conference on the Status of Plant and Animal Research, January 9-12, 2000, San Diego, CA, p.152, 2000; Yasue H, Plant and Animal Genome VIII. The international Conference on the Status of Plant and Animal Research, January 9-12, 2000, San Diego, CA, p.45, 2000), 틸라피아(tilapia; 키크릿과의 민물고기)의 자성발생 계통(meiogynogenetic line)의 4 세대로부터 부화기에서 유해한 형질과 관련된 세 개의 부수체 자 리(microsatellite loci)가 보고되어 있다(Palti Y. et al ., Aquaculture, 206:151-164, 2002).
이에 본 발명자들은 역교배에 의한 근친 가계를 대상으로 부수체 마커를 이용하여 염기 서열을 분석함으로써, 분리비 변형 현상을 나타내는 유전자형 및 유전자 마커를 발굴하고, 상기 유전자형이 실제로 넙치 발생 초기 변태과정을 거치면서 치사에 의한 분리비 변형 현상을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 넙치 발생 초기 변태시기에서 치사를 유도하는 유전자형을 갖는 개체 감별용 유전자 마커를 발굴하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 넙치 열성 치사 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 넙치 열성 치사 유전자를 포함하는 열성 치사 유전자형을 갖는 어류 감별용 유전자 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 열성 치사 유전자 또는 그의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하는 열성 치사 유전자형을 갖는 어류를 감별하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 열성 치사 유전자형을 갖는 개체 감별용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 넙치 열성 치사 유전자를 제공한 다.
본 발명의 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드는 넙치로부터 수득한 DNA를 부수체(Microsatellite) 마커(이하, MS 마커) Poli9-58TUF의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 함으로써 수득할 수 있다. 상기 MS 마커 Poli9-58TUF 프라이머 쌍의 정방향 프라이머는 서열번호 1(유전자 번호 GeneBank accession no. AB086483: aacaaacctc cacctgacaa caggt)로 기재되고, 역방향 프라이머는 서열번호 2(유전자 번호 GeneBank accession no. AB086484: gttgcttagc aacatccaag cattc)로 기재되어 본 발명에 포함되어 있다. 상기 MS 마커 Poli9-58TUF 프라이머의 서열정보가 이미 공지된 것이나, 증폭되는 Poli9-58TUF 마커의 서열이나 기능은 밝혀진 바 없고, 본 발명에서 그 기능을 새로이 밝혀 치사 유전자(lethal gene, LTG) 마커로 재명명하였다. PCR의 산물의 크기(bp의 크기)는 100 bp 내지 200 bp로 다양할 수 있으나, 본 발명의 넙치 열성 치사 유전자는 131 bp 크기의 PCR 산물로 특징지어지는 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 넙치 열성 치사 유전자는 넙치 발생초기 넙치 치사와 연관되어 있다. 상기 열성 치사 유전자는 넙치 부화 후 21 내지 41일에 넙치의 치사를 유도하고, 특히 넙치의 발생 초기 변태시기에 넙치의 치사를 유도한다. 일반적으로 수온 19 내지 20℃일 경우 넙치의 변태 시기는 수정 후 23일에서 30일 정도로 알려져 있다.
부수체 마커(이하, MS 마커)를 이용하여 유전자형을 분석함으로써 분리비 변형 현상을 나타내는 넙치 치사와 관련된 유전자형을 발굴하고자 하였다. 우선, 유 전자형 분리비 변형 현상을 관찰하기에 유리한 근친 가계(가계 1 내지 4) 생산을 위한 역교배를 수행하였고(도 1 참조), 발생 초기에 각 개체별로 DNA를 추출한 뒤(표 1 참조), 4 가지 MS 마커 Poli9-58TUF, Poli47TUF, Poli104MHFS 및 Poli24MHFS 프라이머를 이용해 PCR을 수행하였다. 그 결과, 4 가지 MS 마커에 의한 유전자형 분리 형태가 표 2와 같이 나타내었고, 특히, MS 마커 Poli9-58TUF의 경우에서는 총 132 개체에 대해 25 개의 대립형이 조사되었는데(도 3 참조), 131 유전자형에 대해 분리비 변형 현상이 관찰되었다. 그러나 나머지 마커에 대해서는 어떠한 유전자형에서도 분리비 변형 현상이 나타나지 않았다. 일반적으로 멘델 유전법칙을 따를 경우 131 유전자형을 부모 양쪽에 모두 가지고 있는 이형접합체(heterozygote)의 교배에서 131 유전자에 대한 동형접합체(homozygote)는 25% 내외의 확률로 발견되어야 하는데, 본 발명에 사용된 가계에서는 131 유전자형에 대한 동형접합체는 전혀 관찰되지 않았고 다른 유전자형과 이질 접합체(heterozygote)인 개체는 예측치만큼 생존하여 관찰되었다. 즉, MS 마커 Poli9-58TUF 유전자 영역에 생물 존재에 적합하지 않은 열성 유전자가 존재한다는 가정을 세울 수 있었다.
이어서, 열성 효모 치사 유전자와 연관 가능성이 큰 MS 마커 Poli9-58TUF 에 의한 131 유전자형(131/131)을 갖는 개체를 생산하였고(가계 5 및 가계 6), 상기 유전자형의 넙치 발생 시기별(표 4 참조) 발현시기를 확인하고자 하였다. 표 3에서는 131 유전자형이 열성 치사 유전자인 것을 가정하지 않았을 때의 가능한 자손 유전자형 및 대립 형질을 나타내었고, 각각의 예상되는 발견 비율도 나타내었다. 배아와 부화 직후의 자어 개체들의 경우 131 대립형의 피크가 높게 나타난 것을 확 인함으로써(도 2 참조), 대립형 131의 동형접합체(유전자형 131/131) 개체들이 상기 시기에는 생존하고 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 각각 50 개체들을 섞어서 DNA를 추출한 후 유전자형을 분석하였기 때문에, 멘델 유전 법칙에 따른다면 대립형 131이 치사 유전자형이라는 가정되지 않았을 때에 대립형 131의 동형접합체(유전자형 131/131)의 발견 빈도는 표 3에서 예상하여 제시한 것과 같이 50%를 차지하고 나머지 2 개의 대립형이 각각 25%의 빈도를 차지하게 되었다. 이는 멘델 유전 법칙에 따라 대립형 131의 동형접합체(유전자형 131/131) 개체들이 생존하고 있음을 나타내었다. 일반적으로 유전자형 분석을 실시하면 PCR 산물의 크기가 클수록 PCR 효율이 떨어져서 게놈상에서 같은 복제 수를 갖는다고 해도 PCR 산물의 복제 수가 적을 수 있다. 즉, 유전자형 분석 결과 분자 크기가 큰 유전자형의 경우 대립형 피크가 낮아지는 경향을 갖으므로, 같은 양을 분석한다고 해도 뒤에 위치하는 피크가 앞에 위치하는 피크보다 낮게 나타나는 것이 일반적인 현상이다. 그러나 도 2에서 나타낸 바와 같이 대립형 131의 피크가 더 큰 값을 나타내기 때문에 대립형 131의 동형접합체(유전자형 131/131) 개체들이 생존하여 분석시 포함되어 있음을 확신할 수 있었다.
또한, 수정 후 21일부터 10일 내지 20일 간격으로 채취한 가계 5 및 가계 6의 각 개체별 유전자형 분리비를 조사한 결과가 표 5에 나타난 것과 같았다. 변태시기 이전인 +21일 단계에서는 생성된 자손의 유전자형이 멘델법칙에 따라 1:1:1:1 분리비에 의해 분리(segregation)됨을 확인하였다.
31일째 시료에서는 동형접합체(유전자형 131/131) 개체가 비이상적으로 많이 관찰되었다. 그 이유는 넙치가 변태시기를 거치면서 정상적으로 발생이 진행되는 개체들은 사육 조 바닥에 착저하는 특징에 의한 것으로 추정된다. 즉, 넙치가 바닥에 착저하면 일단 변태가 완료되어 안정적인 상태에 들었다고 볼 수 있고, 부화 후 31일째는 개체 차이에 의해 변태가 진행중인 개체는 수면에서 유영을 하게 되고 변태가 완료된 개체는 바닥에 착저하는 등 발생에 차이를 나타내게 된다. 따라서 이 시기에 수면에서 유영하는 개체들을 대상으로 시료 채취를 수행하였기 때문에 변태시기 치사 유전자에 의해 발생이 온전하게 진행되지 못하는 개체들은 바닥 저면에 착저하지 못하여 비정상적으로 수면에서 유영하였고 즉, +31일에 샘플링된 개체들에서 비정상적으로 131 대립형의 동형접합체(유전자형 131/131) 개체가 많이 존재하였던 것이다.
그러나 +41일 이후 동형접합체(유전자형 131/131) 개체 존재가 급격히 감소하여, 변태 시기 이후에는 131 대립형의 동형접합체(유전자형 131/131) 개체가 더 이상 생존하지 못하였고, 변태가 완료된 시점에서는 동형접합체(유전자형 131/131) 개체는 완전히 소멸되어 생존하지 않음을 알 수 있었다.
또한, 일반 넙치 친어 132마리 개체를 대상으로 MS 마커 Poli9-58TUF의 다양성을 조사한 결과 총 25개의 대립형이 조사되었고 이형접합체(heterozygote) 비율은 0.893(자연산 집단)과 0.743(양식산 집단)으로 높은 다양성을 보였으며 121 대립형의 동형접합체(homozygote)는 21.2%(26/132) 그리고 135 대립형의 동형접합체는 2.3%(3/132)로 관찰되었으나(도 3 참조), 131 대립형의 동형접합체(유전자형 131/131) 개체는 전혀 존재하지 않았던 것은 상기 사실을 뒷받침한다고 할 수 있 다.
결과적으로, MS 마커 Poli9-58TUF에 의한 131 대립형은 열성의 유전자로서 동형접합체(유전자형 131/131) 넙치의 발생 초기 중 변태시기에서 치사를 유발하는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 넙치 열성 치사 유전자를 포함하는 열성 치사 유전자형을 갖는 어류 감별용 유전자 마커를 제공한다.
본 발명의 서열번호 3으로 기재되는 유전자 마커는 넙치로부터 수득한 DNA를 부수체(Microsatellite) 마커(이하, MS 마커) Poli9-58TUF의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 함으로써 수득할 수 있다. 상기 PCR의 산물의 크기(bp의 크기)는 100 bp 내지 200 bp로 다양할 수 있으나, 상기 유전자 마커는 서열번호 3으로 기재되는 131 bp 크기의 PCR 산물로 특징지어진다. 본 발명의 유전자 마커는 어류 양식을 위한 인공 교배시 131 대립형을 갖는 어류 감별에 사용될 수 있다. 상기 어류는 바람직하게는 넙치일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 열성 치사 유전자 또는 그의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하는 열성 치사 유전자형을 갖는 어류를 감별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 감별 법은, 더욱 상세하게는
(i) 감별하고자 하는 어류의 DNA 시료를 추출하는 단계;
(ii) 상기 각각의 DNA 시료를 서열번호 3으로 기재되는 열성 치사 유전자 또는 그의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍으로 증폭하는 단계; 및
(iii) 열성 치사 유전자 또는 그의 일부가 증폭되었는지 여부를 확인하여 열성 치사 유전자형을 갖는 개체를 결정하는 단계로 구성되어 있다.
단계(i)에서는 DNA 시료를 어류의 지느러미로부터 추출할 수 있으며, 상기 어류는 바람직하게는 넙치일 수 있다.
단계(ii)에서는 상기 프라이머 쌍은 본 발명의 서열번호 3으로 기재되는 열성 치사 유전자 또는 그 일부를 PCR에 의한 방법으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍이면 가능하고, 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍일 수 있다. PCR 산물의 형광 검출을 위해서, 상기 프라이머 쌍의 정방형 프라이머가 6-FAM, NED 또는 HEX의 형광물질로 표지 될 수 있다.
단계(iii)의 확인하는 단계에서 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 PCR 산물이 대상 개체에서도 증폭되는지 여부를 확인함으로써 131 대립형을 갖는 개체를 감별할 수 있다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 열성 치사 유전자형을 갖는 개체 감별용 키트를 제공한다.
이때, 상기 키트는 증폭반응 요소로서 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture) 및 완충용액을 추가적으로 포함할 수 있으며, 아울러, Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 열성 치사 유전자를 갖는 개체 감별용 키트는 더 나아가 PCR 결과를 확인하는데 필요한 6-FAM, NED 또는 HEX 등의 형광물질, 아가로스와 전기영동 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 증폭반응 요소가 상기 프라이머 쌍과의 사전혼합물(premix) 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 유전자 마커를 이용하여 넙치의 변태시기에 치사를 유도하는 유전자형을 갖는 개체의 감별에 유용하게 사용하여 보다 정확하고 효율적인 분자육종을 가능하게 할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
역교배
근친 가계의 유전자형 분리비 검사
<
실시예
1-1>
역교배
근친 가계의 생산
유전자형 분리비 변형 현상을 관찰하기에 유리한 근친 가계 생산을 위한 역 교배를 수행하고자 하였다.
친어(broodstock) 개체들은 물리적 개체식별(passive integrated transponder; PIT) 태그(Biomark, USA)로 표지되었다. 부화기 친어들을 인공적으로 교배하였고, 각 교배 쌍의 F1 세대 중 수컷 두 마리가 무작위로 선별되었다(CC156 및 CC106). 그리고 상기 F1 세대 수컷의 각각의 부모 세대 중 암컷(CA022 및 CJ053)과 상기 F1 세대 수컷을 역교배 함으로써 F2 세대를 생산하였다(도 1). F2 세대를 대상으로 유전자형이 분석된 시기와 분석 개체수를 표 1에 나타내었다.
| 가계 번호 | 시기(d.a.f.) ** | 분석 개체수(마리) |
| 1 (CA022 × CC156)* | 105 | 100 |
| 2 (CJ053 × CC156) | 105 | 100 |
| 3 (CJ053 × CC106) | 105 | 100 |
| 4 (CA022 × CC106) | 105 | 100 |
*(부모 세대 암컷 표기명 × F1 세대 수컷 표기명)을 표기하였다.
** 시기는 수정 후 경과일(days after fertilization; d.a.f.)로 표기하였다.
<
실시예
1-2>
역교배
근친 가계의 유전자형 분석
부수체 마커(이하, MS 마커)를 이용하여 유전자형을 분석함으로써 분리비 변형 현상을 나타내는 유전자형을 발굴하고자 하였다.
실시예 1-1의 방법으로 생산된 각각의 역교배 근친 가계 1 내지 4로부터 105 수정후 경과일(발생 초기)에 100 마리의 개체를 대상으로 유전자 분석(Genotyping)을 수행하였다. 상기 개체들의 DNA는 지느러미 시료로부터 proteinase K 처리 후 표준 페놀 추출법에 따라 추출되었다. PCR 반응은 게놈 DNA 50 ng , 10mM Tris-HCl, pH 8.8, 0.1% Trition X-100, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, dNTP 0.2 mM 씩, 프라이머 쌍 5 p㏖ 씩 및 0.5 units Taq DNA 중합효소(Promega, USA)를 포함한 10 ㎕의 반응량으로 수행되었다. 상기 프라이머 쌍은 MS 마커 Poli9-58TUF(서열번호 1 내지 2), Poli47TUF[서열번호 4(tgaccagacg cactgagttc) 내지 5(tctgcttcac tgacaaaaaa ca)], Poli104MHFS[서열번호 6(gccgctcgct gtttctctc) 내지 7(actgctcctc tttgtgtcg)] 및 Poli24MHFS[서열번호 8(ccaccttatt tttcctgctc tgta) 내지 9(tctctgtctt atcacctttc atcc)]의 프라이머로 총 4 종류로 구성되었다. 증폭반응은 PTC 200 MJ-Research thermocycler DNA engine(BIO-RAD, CA)에서 수행되었다. PCR 반응 조건은 95℃ 15 분의 초기 변성 후, 94℃ 20 초, 58 내지 62℃ 40 초 및 72℃ 1 분의 35회 반복 및 72℃ 10 분의 최종 신장 시기로 구성된다. PCR 산물의 형광 검출을 위해서, 상기 정방형 프라이머는 6-FAM, NED 또는 HEX(Applied Biosystems, USA)로 표지 되었다. MS 마커를 이용한 다형성 스크린을 위해 ABI PRISM 3100 automated DNA sequencer(Applied Biosystems, USA)가 사용되었다. 유전형은 분자 크기 마커에 따른 PCR 산물 크기에 따라 명명하였다(GENESCAN 400HD ROX, PE Applied Biosystems, USA). 유전자형은 GENESCAN(ver. 3.7)(Applied Biosystems, USA) 및 GENOTYPER(ver. 3.7)(Applied Biosystems, USA) 소프트웨어에 의해 점수화되었다.
그 결과, 4 가지 MS 마커에 의한 유전자형 분리 형태를 표 2에 나타내었고, 특히, MS 마커 Poli9-58TUF의 경우에서는 131 유전자형이 동형접합체를 나타낼 경우에 대해 분리비 변형 현상이 관찰되었다. 그러나 나머지 마커에 대해서는 어떠한 유전자형에서도 분리비 변형 현상이 나타나지 않고 멘델의 유전법칙에 의한 유전자형 분리가 관찰되었다.
| Poli9-58TUF | 암컷 | ||
| CAO22 121/131 | CJ053 131/141 | ||
| 수 컷 | CC156 131/141 | 121/131(30%) | 131/131( 0%) |
| 121/141(57%) | 131/141(79%) | ||
| 131/131( 0%) | 141/141(21%) | ||
| 131/141(13%) | |||
| CC106 121/141 | 121/121(30%) | 121/131(30%) | |
| 121/141(27%) | 121/141(25%) | ||
| 121/131(25%) | 131/141(13%) | ||
| 131/141(18%) | 141/141(27%) | ||
| Poli47TUF | 암컷 | ||
| CAO22 78/108 | CJ053 86/96 | ||
| 수 컷 | CC156 76/78 | 76/78(22%) | 76/86(28%) |
| 78/78(33%) | 76/96(24%) | ||
| 76/108(20%) | 78/86(17%) | ||
| 78/108(25%) | 78/96(31%) | ||
| CC106 80/86 | 78/80(21%) | 80/86(16%) | |
| 78/86(37%) | 80/96(29%) | ||
| 80/108(16%) | 86/86(29%) | ||
| 86/108(26%) | 86/96(26%) | ||
| Poli104MHFS | 암컷 | ||
| CAO22 210/254 | CJ053 216/254 | ||
| 수 컷 | CC156 210/216 | 210/210(32%) | 210/216(21%) |
| 210/216(30%) | 210/254(24%) | ||
| 210/254(19%) | 216/216(31%) | ||
| 216/254(19%) | 216/254(24%) | ||
| CC106 254/260 | 210/254(29%) | 216/254(19%) | |
| 210/260(24%) | 216/260(25%) | ||
| 254/254(24%) | 254/254(31%) | ||
| 254/260(23%) | 254/260(25%) | ||
| Poli24MHFS | 암컷 | ||
| CAO22 109/123 | CJ053 109/125 | ||
| 수 컷 | CC156 109/133 | 109/109(41%) | 109/109(11%) |
| 109/123(21%) | 109/125(22%) | ||
| 109/133(22%) | 109/133(33%) | ||
| 123/133(16%) | 125/133(33%) | ||
| CC106 114/125 | 109/114(40%) | 109/114(29%) | |
| 109/125(13%) | 109/125(24%) | ||
| 114/123(27%) | 114/125(29%) | ||
| 123/125(20%) | 125/125(18%) | ||
<
실시예
2> 넙치 발생 초기 치사와 연관된 열성 치사 유전자
마커
<
실시예
2-1> 인위 교배 가계 생산
열성 효모 치사 유전자와 연관 가능성이 큰 MS 마커 Poli9-58TUF 에 의한 131 유전자형(131/131)을 갖는 개체를 생산하고자 하였다.
표 3에서 나타낸 바와 같이 부모 세대의 유전자형은 121/131 × 125/131 및 131/135 × 125/131이었다. 또한, 표 3에서는 131 유전자형이 열성 치사 유전자인 것을 가정하지 않았을 때의 가능한 자손 유전자형 및 대립형을 나타내었고, 각각의 예상되는 발견 비율도 나타내었다.
| 가계 | 부모 유전자형 | 자손 유전자형 | 예상되는 유전자형 비율 | 대립형 | 예상되는 대립형 비율 |
| 5 | 121/131 × 125/131 (A / B C / B) | AC: AB: BC: BB | 1:1:1:1 | 121, 131, 125 (A : B : C) | 1:2:1 |
| 6 | 131/135 × 125/131 (B / D C / B) | BC: BB: DC: BD | 1:1:1:1 | 125, 131, 135 (C : B : D) | 1:2:1 |
<
실시예
2-2> 열성 치사 유전자의 발현시기
넙치 발생 시기별 열성 효모 치사 유전자와 연관 가능성이 큰 MS 마커 Poli9-58TUF 에 의한 131 유전자형(131/131)의 발현시기를 확인하고자 하였다.
표 4에서 나타낸 바와 같이, 배아와 부화 직후의 자어 개체들과 수정 후 21일, 31일, 41일 및 61일의 개체들에 대해 시료 채취 방법과 분석 방법을 달리하였다. 배아와 부화 직후의 자어 개체들의 경우, 개체별 DNA 추출이 용이하지 못하기 때문에 DNA를 공동 채취하는 DNA pooling 방법을 이용하여 대립형 비율을 분석함으로써 간접적으로 확인하였다. MS 마커 Poli9-58TUF 프라이머 쌍을 이용한 PCR 및 분석 수행은 실시예 1-2의 방법과 동일하게 수행되었다.
| 시기 (d.a.f) | 시료 채취 | 분석 방법 | 비고 |
| 배아(Embryo) | 50 개체 혼합 후 공동의 전체 DNA 채취 | 대립형 비율 | - |
| 부화 직후 자어(Hatching) | 50 개체 혼합 후 공동의 전체 DNA 채취 | 대립형 비율 | - |
| + 21 일 | 개체별 DNA 시료 채취(50개체) | 유전자형 비율 | - 변태전 - 생물먹이공급 |
| + 31 일 | 개체별 DNA 시료 채취(50개체) | 유전자형 비율 | - 변태기 - 배합사료전환기 |
| + 41 일 | 개체별 DNA 시료 채취(50개체) | 유전자형 비율 | - 변태후 - 배합사료공급 |
| + 61 일 | 개체별 DNA 시료 채취(50개체) | 유전자형 비율 | - 변태후 - 배합사료공급 |
도 2에서 나타낸 바와 같이 배아와 부화 직후의 자어 개체들의 경우 131 대립형의 피크가 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 그러나 수정 후 21일부터 10일 내지 20일 간격으로 채취한 가계 5 및 가계 6의 각 개체별 유전자형 분리비를 조사한 결과(표 5 참조), 변태시기 이후 +31일째 이후 동형접합체(유전자형 131/131) 개체가 완전히 도태되어 생물 사육 조에 존재하지 않음을 확인하였다.
31일째 시료에서는 동형접합체(유전자형 131/131) 개체가 비이상적으로 많이 관찰되었는데(표 5), 변태가 완료된 개체는 사육 조 바닥에 착저하는 특징을 지니고 개체 차이에 의한 변태 시기의 차이에 의한 현상에 의한 시료 채취 상의 문제에 기인한 것으로 추정된다.
또한, 일반 넙치 친어 132마리 개체를 대상으로 MS 마커 Poli9-58TUF의 다양성을 조사한 결과 총 25개의 대립형이 조사되었고 이형접합체(heterozygote) 비율은 0.893(자연산 집단)과 0.743(양식산 집단)으로 높은 다양성을 보였으며 121 대립형의 동형접합체(homozygote)는 21.2%(26/132) 그리고 135 대립형의 동형접합체는 2.3%(3/132)로 관찰되었으나(도 3), 131 대립형의 동형접합체(유전자형 131/131) 개체는 전혀 존재하지 않았던 것은 상기 사실을 뒷받침한다고 할 수 있다.
| 시기 (d.a.f) | 가계 5에서의 유전자형 | 가계 6에서의 유전자형 | ||||||
| 121/125 | 121/131 | 125/131 | 131/131 | 125/135 | 131/131 | 125/131 | 131/135 | |
| +21 | 25 | 30 | 25 | 20 | 31 | 12 | 35 | 22 |
| +31 | 26 | 12 | 14 | 48 | 16 | 56 | 10 | 18 |
| +41 | 48 | 25 | 27 | 0 | 40 | 6 | 34 | 20 |
| +61 | 38 | 30 | 32 | 0 | 42 | 0 | 24 | 32 |
결과적으로, MS 마커 Poli9-58TUF에 의한 131 대립형은 열성의 유전자로서 동형접합체(유전자형 131/131) 개체에서 넙치의 발생 초기 중 변태시기에서 치사를 유발하는 것을 알 수 있었다.
도 1은 역교배에 의한 근친 가계 생산도를 나타낸다.
도 2는 넙치 배아와 부화 직후의 자어 개체들을 대상으로 본 발명의 LTG 마커에 의한 대립형의 유전자 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 MS 마커 Poli9-58TUF에 의한 유전자형 분리 형태를 나타낸 도이다.
<110> National Fisheries Research and Development Institute
<120> Genetic marker for discrimination of individuals which comprise
lethal genotype associated with mortality and method comprising thereof
<130> 7P-07-77
<160> 9
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Poli9-58TUF Forward primer
<400> 1
aacaaacctc cacctgacaa caggt 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Poli9-58TUF reverse primer
<400> 2
gttgcttagc aacatccaag cattc 25
<210> 3
<211> 130
<212> DNA
<213> Paralichthys olivaceus LTG
<400> 3
aacaaacctc cacctgacaa caggtgagac acacacacac gcacacacac acacacacac 60
acacacacac aaccgctcca tgcggctggt gtggctcggg catcagaatg cttggatgtt 120
gctaagcaac 130
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Poli47TUF forward primer
<400> 4
tgaccagacg cactgagttc 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Poli47TUF reverse primer
<400> 5
tctgcttcac tgacaaaaaa ca 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Poli104MHFS forward primer
<400> 6
gccgctcgct gtttctctc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Poli104MHFS reverse primer
<400> 7
actgctcctc tttgtgtcg 19
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Poli24MHFS forward primer
<400> 8
ccaccttatt tttcctgctc tgta 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Poli24MHFS reverse primer
<400> 9
tctctgtctt atcacctttc atcc 24
Claims (8)
- 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 넙치(Paralichthys olivaceus) 열성 치사 유전자.
- 제 1항에 있어서, 상기 열성 치사 유전자는 MS(microsatellite marker; 부수체) 마커인, 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 Poli9-58TUF 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 넙치 열성 치사 유전자.
- 제 1항에 있어서, 상기 열성 치사 유전자는 넙치 부화 후 21 내지 41일에 치사를 유도하는 것을 특징으로 하는 넙치 열성 치사 유전자.
- 제 1항의 유전자를 포함하는 열성 치사 유전자형을 갖는 넙치(Paralichthys olivaceus) 감별용 유전자 마커.
- 삭제
- (i) 감별하고자 하는 넙치(Paralichthys olivaceus)의 DNA 시료를 추출하는 단계;(ii) 상기 각각의 DNA 시료를 서열번호 3으로 기재되는 열성 치사 유전자 또는 그의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍으로 증폭하는 단계; 및(iii) 열성 치사 유전자 또는 그의 일부가 증폭되는지 여부를 확인하여 열성 치사 유전자형을 갖는 개체를 결정하는 단계를 포함하는 열성 치사 유전자형을 갖는 넙치를 감별하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 단계 (ii)의 프라이머 쌍은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 정방향 프라이머와 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열번호 1과 서열번호 2로 기재되는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 열성 치사 유전자형을 갖는 넙치(Paralichthys olivaceus) 감별용 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070115083A KR100942065B1 (ko) | 2007-11-12 | 2007-11-12 | 열성 치사 유전자형 개체 감별용 유전자 마커 및 이를포함하는 감별 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070115083A KR100942065B1 (ko) | 2007-11-12 | 2007-11-12 | 열성 치사 유전자형 개체 감별용 유전자 마커 및 이를포함하는 감별 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090048954A KR20090048954A (ko) | 2009-05-15 |
| KR100942065B1 true KR100942065B1 (ko) | 2010-02-17 |
Family
ID=40857837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020070115083A KR100942065B1 (ko) | 2007-11-12 | 2007-11-12 | 열성 치사 유전자형 개체 감별용 유전자 마커 및 이를포함하는 감별 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100942065B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102077917B1 (ko) * | 2018-05-29 | 2020-02-17 | 주식회사 불루젠코리아 | 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법 |
-
2007
- 2007-11-12 KR KR1020070115083A patent/KR100942065B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Anim. Genet., Vol. 31, No. 1, pp. 72~73 (2000). |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20090048954A (ko) | 2009-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| de Leon et al. | The application of microsatellite markers to breeding programmes in the sea bass, Dicentrarchus labrax | |
| Coimbra et al. | A genetic linkage map of the Japanese flounder, Paralichthys olivaceus | |
| Kitahara et al. | Polymorphic microsatellite DNA markers in the Asiatic black bear Ursus thibetanus | |
| KR100960878B1 (ko) | 넙치 미세위성마커를 이용한 개체식별 및 친자확인 방법 | |
| Li et al. | Allelic transmission of microsatellites and application to kinship analysis in newly hatched Pacific abalone larvae | |
| CN113881785B (zh) | 用于凡纳滨对虾多性状育种的snp位点引物组合及应用 | |
| JP6877680B2 (ja) | 成長性遺伝形質を有するアカマダラハタの識別方法 | |
| Agbebi et al. | Preliminary characterization of genetic strains in clariid species, Clarias gariepinus and Heterobranchus bidorsalis using microsatellite markers | |
| KR101499689B1 (ko) | 넙치 암수 구분 단일염기다형성 마커 | |
| Brown | Genetic management and selective breeding in farmed populations of gilthead seabream (Sparus aurata) | |
| KR101845027B1 (ko) | 전복류의 종구별, 유전자 다양성 또는 세대 간 연관관계 분석용 마이크로새틀라이트 마커군 및 이를 이용한 분석방법 | |
| KR102311743B1 (ko) | 유전자 마커를 이용한 참전복 삼배체 판별방법 | |
| Li et al. | Microsatellite analysis of gynogenetic families in the Pacific oyster, Crassostrea gigas | |
| KR102064039B1 (ko) | 붉바리 개체 식별 및 친자 확인 위한 미세위성 마커 | |
| Kocher et al. | Genome mapping and genomics in fishes and aquatic animals | |
| CN109439771B (zh) | 一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法 | |
| Alcaide et al. | Extra-pair paternity in the Lesser Kestrel Falco naumanni: a re-evaluation using microsatellite markers | |
| Sanz et al. | Microsatellites as a good approach for detecting triploidy in brown trout hatchery stocks | |
| Zhan et al. | Inheritance pattern of EST-SSRs in self-fertilized larvae of the bay scallop Argopecten irradians | |
| KR100942065B1 (ko) | 열성 치사 유전자형 개체 감별용 유전자 마커 및 이를포함하는 감별 방법 | |
| Wu et al. | Isolation of microsatellite markers in Astatoreochromis alluaudi and their cross-species amplifications in other African cichlids | |
| Kang et al. | Microsatellite analysis as a tool for discriminating an interfamily hybrid between olive flounder and starry flounder | |
| CN113846172B (zh) | 凡纳滨对虾耐亚硝酸盐性状相关的snp分子标记及其应用 | |
| JP4992087B2 (ja) | ヒラメ類の遺伝的性判別方法並びに遺伝的性判別用キット | |
| Tatarenkov et al. | Genetic monogamy in the channel catfish, Ictalurus punctatus, a species with uniparental nest guarding |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |