JP4822210B2 - 白化異常が発生しやすいヒラメを判別する判別法、及び、この判別法に用いられるポリメラーゼ連鎖反応用プライマー - Google Patents
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Description
ヒラメの白化異常には、種苗生産時の餌料や栄養、飼育環境等の様々な原因が考えられ、有効な防除策についての研究が進められてきた。
ところが、近年、ヒラメの白化には複数の遺伝子の関与が示唆されており、また、白化しやすい系統、白化し難い系統の存在も知られている。即ち、ヒラメの養殖を効率的に行うには、遺伝的に白化しやすい系統を予め排除しておくことが重要である。
しかし、白化に関連する遺伝子については、未だ具体的に解明されていなかった。
作出した戻し交配集団、その両親及び祖父母に対してDNAマーカーを用いたQTL解析を行った結果、発明者らが既に見出していたヒラメの遺伝子連鎖地図{M.M.Coimbra、東京水産大学博士学位論文(2001);Aquaculture(2003)}と照らし合わせると、このヒラメ遺伝子連鎖地図における遺伝子連鎖群(LG)5のマーカー座Poli215TUFに白化関連遺伝子があることがわかった。
そして、LG5のマーカー座Poli215TUFに関する特定のプライマーを用いて、ヒラメのゲノムDNAにPCR法を行い、得られたPCR産物にゲル電気泳動法を施すことにより、白化しやすい個体を判別することができる。
本発明の白化異常が発生しやすいヒラメを判別する判別法に用いられるPCR用プライマーは、次の(1)のオリゴヌクレオチドから成る。
(1)5’−GAATGAGTGACTGTCAATGTGTTTTTG−3’(配列番号1)の内、連続する少なくとも15個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び、5’−AATGACAAAATGAAGTCCTGCATGC−3’(配列番号2)の内、連続する少なくとも15個の塩基から成るオリゴヌクレオチド。
以下、本発明の実施例について詳細に説明する。
解析家系として、白化個体出現率の高い系統(KP−C)と、白化個体出現率の低い系統(KP−A)を用いて戻し交配家系を作出した。これらの系統は、表現型に基づいた選別によって、神奈川県水産総合技術センターにおいて継代飼育されてきた。
1998年から2003年まで、毎年KP−C及びKP−Aのヒラメをそれぞれ100〜200匹飼育し、KP−C及びKP−Aにおける白化出現率を調べた。その結果を表1に示す。
KP−Cの平均白化個体出現率は77.8%であり、KP−Aの平均白化個体出現率は19.1%であって、白化異常には遺伝性のあることがはっきりした。
KP−CAAの受精卵を100L水槽に収容し、70Lの海水で平均水温15.5℃において止水飼育した。受精3日後、500L水槽に移し、15.5℃〜22.5℃の範囲で流水飼育した。孵化後25日目までは、餌料としてワムシを与え、15日目から60日目までは、アルテミアを加え、30日以降は市販の配合飼料を与えた。
孵化後3ヶ月目に、以下のようにしてKP−CAA238個体の白化面積占有率を算出した。
始めに、ヒラメの有眼側体表面を実体顕微鏡に取付けたデジタルカメラで撮影し、その画像をコンピュータに取り込んで、画像解析ソフトを用いて各個体毎に次のような画像解析を行った。
背鰭、尻鰭、尾鰭は、肉眼で白化の有無を判別するのが困難なため、全体像から鰭を含まない部分を切り取り、有眼側体表面積と白化部分の面積を測定し、白化面積占有率(白化部分の面積/有眼側体表面積×100)を算出した。
KP−CAA集団について、算出した白化面積占有率の分布を図1に示す。
z=(白化面積占有率−白化面積占有率の平均値)/標準偏差を求め、z<0の個体を非白化個体とし、z>0の個体を白化個体とすると、KP−CAA集団において、非白化固体は157匹、白化個体は81匹であった。
祖父母であるKP−C及びKP−A、F1のKP−CA、KP−CAAの全てのヒラメに対し、次のようにしてPCRプライマーを用いてPCR法を行い、得られたPCR産物にゲル電気泳動法を施し、その遺伝子型を確認した。
尾鰭を1cm角の大きさで採取し、100mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8.0)、100mM EDTA、1.0%SDS、100μg/ml Proteinase Kを含む消化溶液を600μL加え、37℃で一晩静置した。
さらに、フェノール/クロロホルム(1:1)抽出を1回行った後、エタノール沈殿にて染色体DNAを析出させた。回収したDNAは70%エタノールで洗浄、乾燥後、TE溶液(0.01M Tris−HCl pH7.4、2.5mM EDTA pH8.0)50μLに溶解した。
F:5’−GAATGAGTGACTGTCAATGTGTTTTTG−3’(配列番号1)
R:5’−AATGACAAAATGAAGTCCTGCATGC−3’(配列番号2)
の一組のプライマーを合成し、2.5pmol Fプライマーと[γ-33P]ATP、T4 polynucleotide kinaseによって標識した0.17pmol Rプライマー、0.175mM each dNTP、20mM Tris−HCl(pH8.4)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、1%BSA、0.25 U Taq DNA polymerase(Takara Bio)、50ngのテンプレートDNAを含む11μlの溶液で、Gene Amp PCR system 9600 thermal cycler(Perkin−Elmer)にて、PCR法を行った。
反応後、等量のLoading dye(95% formamide,10mM EDTA,0.05% bromophenol blue and xylene cyanol)とよく攪拌し、PCR産物を熱変性によって1本鎖にし、6%アクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。
その後、1時間乾燥させたゲルを、Imaging Plate(IP)に3〜12時間感光させ、放射線の感光像が記憶されたIPをBio-imaging Analyzer(BAS1000,Fuji Photo Films)で読み取り、コンピュータで映像化した。
その結果を図2及び図3に示す。
さらに、KP−CAAにおいて、白化の発生と、101bpのバンドの有無との関係を調べ、その結果を表4に示す。
即ち、101bpにバンドが確認された群では、101bpにバンドが確認されなかった群に比べて、明らかに白化個体出現率が高かった。
101bpにバンドがある非白化個体と、101bpにバンドの無い白化個体の合計は82匹であり、Lod Score=82log(82/238)+(238−82)log(1−82/238)+238log0.5=5.08となる。
即ち、このバンドと白化との間に連鎖関係があることは、1/105.08の危険率で確実であり、本実施例のプライマーを用いたPCR産物に101bpのバンドがあるヒラメは、白化異常が発生しやすいヒラメであるといえる。
また、配列番号2と配列番号3で表されるプライマーにより増幅される101bpのバンドを持つ個体の50.4%は、白化占有率が低い(通常)個体であるが、次世代に白化個体を出現させる可能性がある個体と考えられる。
Claims (2)
- 5’−GAATGAGTGACTGTCAATGTGTTTTTG−3’(配列番号1)の内、連続する少なくとも15個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び、5’−AATGACAAAATGAAGTCCTGCATGC−3’(配列番号2)の内、連続する少なくとも15個の塩基から成るオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ヒラメのゲノムDNAにポリメラーゼ連鎖反応法を行い、得られた産物にゲル電気泳動法を施して101bpのバンドの有無を確認し、101bpのバンドがあるヒラメは白化異常が発生しやすいヒラメであると判別する判別法。
- 下記(1)のオリゴヌクレオチドから成る、請求項1記載の判別法に用いるポリメラーゼ連鎖反応用プライマー。
(1)5’−GAATGAGTGACTGTCAATGTGTTTTTG−3’(配列番号1)の内、連続する少なくとも15個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び、5’−AATGACAAAATGAAGTCCTGCATGC−3’(配列番号2)の内、連続する少なくとも15個の塩基から成るオリゴヌクレオチド。
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