CN114196775A

CN114196775A - 提高油菜油酸含量的分子标记引物、引物组及其在育种中的应用

Info

Publication number: CN114196775A
Application number: CN202111497490.7A
Authority: CN
Inventors: 刘佳; 胡琼; 杨雨婷; 于文凯; 梅德圣; 徐崟海; 李超; 王会; 汪文祥; 成洪涛
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2021-12-09
Filing date: 2021-12-09
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-12-09
Also published as: CN114196775B

Abstract

本发明属于分子遗传育种领域，公开了提高油菜油酸含量的分子标记引物、引物组及其在育种中的应用。本发明和油菜油酸含量显著相关的SNP6355位于A08染色体BnFAE1.A08基因翻译起始位置（ATG）后的6355bp的位置，另一个显著位点小片段插入InDel6位于C03染色体BnFAE1.C03基因翻译起始位置（ATG）后的6bp的位置，另外1个较小效应显著位点O9.A05，位于A05染色体的23102798bp，利用该三个分子标记联合对289份油菜资源进行高油酸筛选，最终筛选出的样本的油酸平均含量达到71.87%。开发与利用油菜油酸含量显著相关的变异位点KASP标记，对于加快高油酸油菜育种提供了一种新的方法，在实际育种过程中具有重要的理论意义和实践指导意义。

Description

提高油菜油酸含量的分子标记引物、引物组及其在育种中的应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，涉及提高油菜油酸含量的分子标记引物、引物组及其在育种中的应用。

技术背景

油菜是世界上主要的大宗油料作物，菜籽油也被国际普遍认为脂肪酸组成合理的健康食用油，菜籽中的芥酸，硫代葡萄糖苷会降低油脂品质，油酸(普通油菜种子中油酸含量为17-65％)等不饱和脂肪酸含量促进营养和健康。虽然油菜驯化时间相对其他粮食作物较短，但通过育种家的大力遗传改良，推广栽培“双低油菜”，降低了菜籽和油中的硫苷和芥酸。随着人民生活水平的提高，对健康食用油要求标准也相应提高，更健康的高油酸能有效预防心脑血管等疾病，高油酸油菜是现阶段育种家的主要选育对象。因此，研究快速、有效的油菜油酸性状分子育种技术，对于分子辅助油菜油酸性状的遗传改良具有十分重要的生产意义。

研究表明，在无芥酸油菜中控制油酸含量的主效QTL位于A09染色体(Zhao Q,WuJ,Cai G,et al.A novel quantitative trait locus on chromosome A9 controllingoleic acid content in Brassica napus.Plant biotechnology journal,2019,17(12):2313-2324.)，而在有芥酸油菜中，控制油酸的主效QTL被定位到A08和C03染色体上，并与FAE1基因紧密相关(ZHANG J F,Cun-Kou Q I,Hui-Ming P U,et al.QTL identificationfor fatty acid co ntent in rapeseed(Brassica napus L.).Acta AgronomicaSinica,2008,34(1):54-60.)。另外已有很多研究利用FAD2基因开发标记去鉴定高油酸品种，FAD2存在两个拷贝，大部分标记是通过和FAD2基因设计的。最近一项研究利用BnaA.FAD2.A本身478位C/T的差异，开发了一个KASP标记用于高油酸材料选育。针对FAE1基因开发的分子标记主要用于鉴定芥酸含量，之前有专利在A08染色体上(包含了FAE1基因)开发了一组分子标记用于选育高芥酸油菜，也有专利根据FAE1基因的T1366和G1369之间4个碱基的缺失，设计标记用于鉴定芥酸含量。然而，在含有芥酸的品种中，FAE1和油酸含量也是紧密相关的，FAE1酶的差异导致油酸不能向芥酸转化，从而增加油酸的含量，之前的研究对FAE1和油酸含量之间的标记开发关注较少。

在本发明中，根据二代重测序数据进行关联分析的结果显示，在两个FAE1基因上均发现了极其显著的新油酸差异位点。并且在FAE1基因上设计标记不会因为染色体发生交换而产生假阳性。在A5染色体上发现了一个新微效位点，能够在FAE1的基础上进一步提高油酸含量。目前，针对FAE1基因设计的分子标记很少，针对含有芥酸的油菜，油菜油酸品种选择更全面，更具普遍性。

发明内容

本发明的目的在于提供了与油菜油酸含量相关的分子标记，所述的分子标记为一段DN A片段，其序列为SEQ ID NO.9所示。

本发明的另一个目的在于提供检测油菜A05染色体23102798bp位置碱基的引物在高油酸甘蓝型油菜筛选中的应用。

本发明还有一个目的在于提供筛选高油酸甘蓝型油菜的分子标记引物组合，所述的引物组合包括：检测油菜A08染色体BnFAE1.A08基因翻译起始位置(ATG)后第6355bp碱基的引物、检测油菜C03染色体BnFAE1.C03基因翻译起始位置(ATG)后第7bp碱基的引物和检测油菜A05染色体第23102798bp碱基的引物。

本发明的最后一个目的在于提供分子标记引物组合在筛选高油酸甘蓝型油菜中的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

甘蓝型油菜高油酸性状关联的分子标记的筛选：

(1)从997份油菜种质资源中选出具有代表性的289份(Xuan L,Yan T,Lu L,etal.Genome-wide association study reveals new genes involved in leaf trichomeformation in polyploid oilseed rape(Brassica napus L.).Plant,cell&environment,2020,43(3):675-691.)，组成了微核心种质资源，进行10×重测序，经过变异检测后获得全基因组的高密度的SNP和InDel标记。

(2)采用近红外仪Foss2500检测，分析油菜种子光谱数据后，通过已建立的模型评估得出油酸含量，使用Emmax软件的混合线性模型(MLM)对基因型数据和表型数据进行GWAS分析，在两个环境中(浙江和湖北)间均能检测到三个主效位点。GWAS分析检测到与油菜油酸含量显著关联的主效位点有2个，分别位于A08和C03号染色体上(图1)，较小效应位点有1个，位于A05染色体上。

SNP6355位于A08染色体BnFAE1.A08基因(BnaA08g11130D)翻译起始位置(AT G)后的6355bp的位置，属于非同义变异，碱基从“T”变为“C”会导致编码后的蛋白质中该位置的异亮氨酸变成苏氨酸，表型解释率达到45.01％。

针对该分子标记设计的KASP引物为：KASP标记上游引物HEX1序列为5’-GAAGG TCGGAGTCAACGGATTGTGTTTCGGCAAAAGCCTTAAAT-3’；

KASP标记上游引物FAM1序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGTTTCGGCAAAAGCCTTAAAC-3’；

KASP标记下游引物R1序列为5’-GAGAATCTGCTCGCTCATGGGA-3’。

InDel6位于C03染色体BnFAE1.C03基因(BnaC03g65980D)翻译起始位置(ATG)后的6bp的位置，变异位点插入了两个碱基“TT，”表型解释率达到43.52％。

针对该分子标记设计的KASP引物为：KASP标记上游引物HEX2序列为5’-GAAGG TC GGAGTCAACGGATTAGTGTTCCCAAGGACTATTTGG-3’；

KASP标记上游引物FAM2序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTGTTCCCAAGGACTATTTGT-3’；

KASP标记下游引物R2序列为5’-AGAGGCATCAAGATCAACGTTAC-3’。

O9.A05在中双11基因组A05染色体上(参考基因组：Chen X,Tong C,Zhang X,etal.A high-quality Brassica napus genome reveals expansion of transposableelements,su bgenome evolution and disease resistance.Plant biotechnologyjournal,2021,19(3):615-630.)23102798bp位置“AA”等位变异。

针对该分子标记设计的KASP引物为：KASP标记上游引物HEX3序列为5’-GAAGG TC GGAGTCAACGGATTCCATGTAACCATTCAAGTATA-3’；

KASP标记上游引物FAM3序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCATGTAACCATTCAAGTATG-3’；

KASP标记下游引物R3序列为5’-ATCCGGAAGGATCTGACTCGAAT-3’。

本发明的保护内容还包括：

提供检测油菜A05染色体23102798bp位置碱基的引物在高油酸甘蓝型油菜筛选中的应用。

SNP6355分子标记引物、InDel6分子标记引物和O9.A05分子标记引物在甘蓝型油菜高油酸含量筛选中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明油菜显著关联到的主效变异位点SNP6355和InDel6，是从微核心种质资源，进行10×重测序，经过变异检测后获得全基因组的高密度的SNP和InDel标记，再用近红外仪Foss2500检测并评估出油酸含量进行全基因组关联分析得到的，在2个环境中(浙江和湖北)均能检测到与油菜油酸含量显著关联的SNP和InDel，BnFAE1.A08上主效变异位点SNP6355表型解释率为45.01％，BnFAE1.C03上主效变异InDel6表型解释率为43.52％，筛选出的油菜油酸平均含量可达64.82％。本发明油菜显著关联到的较小效应变异位点O9.A05，是基于两个主效位点筛选出的品种进行较小效应位点的分析，在中双11基因组A05染色体上23102798bp位置“AA”等位变异能将油酸平均含量上升到71.87％。

(2)本发明鉴定了2个油菜油酸含量的主效变异位点和1个促进高油酸的较小效应变异位点，开发的KASP分子标记鞥直接对突变位点进行特异性的区分和检测，这一套KAS P分子标记具有良好的应用价值，可实现对油菜高油酸品种进行选择和分子辅助育种。

(3)利用KASP分析标记引物在荧光定量PCR仪上对30份油菜材料进行扩增并进行基因分型，结果表明：这一套分子标记引物均可以清楚的将两种基因型分开，如果是SNP6355标记，靠近Y轴远离X轴的圆点为携带T等位变异位点，基因型为TT；靠近X轴远离Y轴的圆点为携带C等位变异位点，基因型为CC。如果是InDel6标记，靠近Y轴远离X轴的圆点为携带G等位变异位点，基因型为GG；靠近X轴远离Y轴的圆点为携带T等位变异位点，基因型为TT。如果是O9.A05标记，靠近Y轴远离X轴的圆点为携带A等位变异位点，基因型为AA；靠近X轴远离Y轴的圆点为携带G等位变异位点，基因型为GG。在289份油菜中，有114份油菜2个主效位点基因型为TT和GG的油菜平均油酸含量为64.82％，有22份主效位点基因型为TT和TT的油菜平均油酸含量为52.77％，有3份主效位点基因型为CC和GG的平均油酸含量为35.56％，有56份主效位点基因型为CC和TT的平均油酸含量为19.19％；在两个主效位点基因组为TT和GG的材料中，较小效应位点为AA时，油菜平均油酸含量可上升到71.87％。当三种分子标记引物基因分型均靠近Y轴远离X轴油酸平均含量最高，筛选的效果最好。

附图说明

图1油菜油酸GWAS结果的曼哈顿图；

其中：红色实线代表显著阈值，-log(p-value)≥5。

图2为三个KASP标记对289份样品进行联合筛选后的油菜油酸的平均含量；

结果显示：对BnFAE1.A08的SNP6355和BnFAE1.C03的InDel6固定选择后，进一步对O9.A05进行选择AA基因型，油酸含量可以平均达到71.87％。

图3为本发明筛选的三个KASP标记对不同油菜品种基因分型；

靠近原点的黑色空心菱形代表无模板DNA的空白对照；靠近Y轴的蓝色方块和靠近X轴的红色圆点分别代表携带高油酸变异位点的油菜品种和携带低油酸变异位点的油菜品种。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明，所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：

三个与油菜油酸含量性状关联的分子标记的获得：

如图2所示，在289份样品中，对BnFAE1.A08的SNP6355和BnFAE1.C03的InDel6进行高油酸标记选择后，进一步对O9.A05进行选择AA基因型，最后筛选出的样本的油酸含量可以平均达到71.87％。

实施例2：

KASP标记特异引物的开发

针对SNP6355分子标记，根据Seq ID NO.1序列设计三条引物，上游引物HEX1(SeqID NO.2)、上游引物FAM1(Seq ID NO.3)和下游引物R1(Seq ID NO.4)，其中HEX1和FAM1分别包含HEX和FAM荧光接头序列(下划线)，序列如下：

KASP标记上游引物HEX1序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGTTTCGGCAAAAGCCTTAAAT-3’；

KASP标记下游引物R1序列为5’-GAGAATCTGCTCGCTCATGGGA-3’。

利用该引物，携带HEX引物基因型检测出来为TT的材料油酸偏高，携带FAM引物基因型检测出来为CC的材料偏低。

针对InDel6分子标记，根据Seq ID NO.5序列设计三个引物，上游引物HEX2(SeqID NO.6)、上游引物FAM2(Seq ID NO.7)和下游引物R2(Seq ID NO.8)，其中HEX2和FAM2分别包含HEX和FAM荧光接头序列(下划线)，序列如下：

KASP标记上游引物HEX2序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTGTTCCCAAGGACTATTTGG-3’；

KASP标记下游引物R2序列为5’-AGAGGCATCAAGATCAACGTTAC-3’。

利用该引物，携带HEX引物基因型检测出来为GG的材料油酸偏高，携带FAM引物基因型检测出来为TT的材料偏低。

针对O9.A05分子标记，根据Seq ID NO.9序列设计三个引物，上游引物HEX3(SeqID NO.10)、上游引物FAM3(Seq ID NO.11)和下游引物R3(Seq ID NO.12)，其中HEX3和FAM3分别包含HEX和FAM荧光接头序列(下划线)，序列如下：

KASP标记上游引物HEX3序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCATGTAACCATTCAAGTATA-3’；

KASP标记下游引物R3序列为5’-ATCCGGAAGGATCTGACTCGAAT-3’。

利用该引物，携带HEX引物基因型检测出来为AA的材料油酸偏高，携带FAM引物基因型检测出来为GG的材料偏低。

实施例3：

本发明筛选出的分子标记设计的引物在油菜油酸含量筛选育种中的应用：

从289份材料油菜核心种质中随机选取30份材料，提取五叶期样品叶片的基因组DN A，以基因组DNA为模板，采用KASP标记专用引物在进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增是在ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行，PCR结束后该仪器根据荧光信号可进行基因分型。所述的扩增体系均为10μl反应体系：油菜样品DNA模板，60ng/μl，1.5μl；2×KASPMastermix5μl；KASP AssayMix，HEX:FAM:R＝1:1:2，1.4μl；水2.2μl。反应条件包括94℃预变性15min；94℃变性20sec，61～55℃退火60sec，每一个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20sec，55℃退火60sec，30个循环。

反应完成后，Bio-radCFX96Touch荧光定量PCR仪会直接对PCR反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形，3对分子标记引物均可清楚的将两种基因型分开。

结果如图3所示：

SNP6355标记，靠近Y轴远离X轴的圆点为携带T等位变异位点，基因型为TT，检测出18份，油酸平均含量为53.83％；靠近X轴远离Y轴的圆点为携带C等位变异位点，基因型为CC，检测出9份，油酸平均含量为25.80％。

InDel6标记，靠近Y轴远离X轴的圆点为携带G等位变异位点，基因型为GG，检测出12份，油酸平均含量为60.04％；靠近X轴远离Y轴的圆点为携带T等位变异位点，基因型为TT，检测出17份，油酸平均含量为36.45％。

O9.A05标记，靠近靠近Y轴远离X轴的圆点为携带A等位变异位点，基因型为AA，检测出21份，油酸平均含量为42.08％；靠近X轴远离Y轴的圆点为携带G等位变异位点，基因型为GG，检测出2份，油酸平均含量为76.72％。

在上述在30份油菜中，有10份油菜2个主效位点基因型为TT和GG的油菜平均油酸含量为57.94％，有7份主效位点基因型为TT和TT的油菜平均油酸含量为45.73％，有8份主效位点基因型为CC和TT的平均油酸含量为20.28％；在两个主效位点基因组为TT和GG的材料中，较小效应位点O9.A05标记为AA的仅有一份，该份油菜油酸含量为77.94％。当三种分子标记引物基因分型均靠近Y轴远离X轴油酸平均含量最高，筛选的效果最好。即，当上述三种分子标记联合使用时，筛选出的油菜含量最高。

序列表

<110> 中国农业科学研究院油料作物研究所

<120> 提高油菜油酸含量的分子标记引物、引物组及其在育种中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttcggcaaa agccttaaat tcttctccag ctcgtcgatc accgctctac ctcccgcgtg 60

tatacagaaa tgatcaaacg caagcttgaa atccggcatg taaggcttca tcttcttctt 120

agcattaaac agtttattca caagataagt cgcaaagaag agaatctgct cgctcatgg 179

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tgtgtttcgg caaaagcctt aaat 44

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc tgtgtttcgg caaaagcctt aaac 44

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagaatctgc tcgctcatgg ga 22

<210> 5

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtgttccca aggactattt ggaagctttg acattgttta gagccaccca aactgcactg 60

ttacacttaa agcctgaccc taaagcaatc tgccaaactt tattaccttt cttcatcctt 120

ccttttgctt ctatgtatgc caactcatac catattgagc tagatgaagt gtttccaaat 180

ctatgtaacg ttgatcttga tgcctct 207

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat tagtgttccc aaggactatt tgg 43

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaggtgacc aagttcatgc tagtgttccc aaggactatt tgt 43

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agaggcatca agatcaacgt tac 23

<210> 9

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccatgtaacc attcaagtat aaattttttt atatcgagtt ttttgagttt taaaattaaa 60

aattaaactc tattcgaata ttataaattt tcagacggga ttcgagtcag atccttccgg 120

at 122

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaggtcgga gtcaacggat tccatgtaac cattcaagta ta 42

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaggtgacc aagttcatgc tccatgtaac cattcaagta tg 42

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atccggaagg atctgactcg aat 23

Claims

1.与甘蓝型油菜油酸含量相关的分子标记，所述的分子标记为DNA片段，其序列为SEQID NO.9所示。

2.检测油菜A05染色体23102798bp位置碱基的引物在高油酸甘蓝型油菜筛选中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的引物为：KASP标记上游引物HEX3序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCATGTAACCATTCAAGTATA-3’；KASP标记上游引物FAM3序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCATGTAACCATTCAAGTATG-3’；KASP标记下游引物R3序列为5’-ATCCGGAAGGATCTGACTCGAAT-3’。

4.筛选高油酸甘蓝型油菜的分子标记引物组合，所述的引物组合包括：检测油菜A08染色体BnFAE1.A08基因翻译起始位置后第6355bp碱基的引物、检测油菜C03染色体BnFAE1.C03基因翻译起始位置后第7bp碱基的引物和检测油菜A05染色体第23102798bp碱基的引物。

5.权利要求3所述的分子标记引物组合在筛选高油酸甘蓝型油菜中的应用。

6.根据权利要求4所述的引物组合，所述的引物组合为：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGTTTCGGCAAAAGCCTTAAAT-3’、5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGTTTCGGCAAAAGCCTTAAAC-3’和5’-GAGAATCTGCTCGCTCATGGGA-3’；

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTGTTCCCAAGGACTATTTGG-3’、5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTGTTCCCAAGGACTATTTGT-3’和5’-AGAGGCATCAAGATCAACGTTAC-3’；

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCATGTAACCATTCAAGTATA-3’、5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCATGTAACCATTCAAGTATG-3’和5’-ATCCGGAAGGATCTGACTCGAAT-3’。