CN117512185A - 一种与油菜秸秆木质素含量关联分子标记组合及应用 - Google Patents
一种与油菜秸秆木质素含量关联分子标记组合及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117512185A CN117512185A CN202311658040.0A CN202311658040A CN117512185A CN 117512185 A CN117512185 A CN 117512185A CN 202311658040 A CN202311658040 A CN 202311658040A CN 117512185 A CN117512185 A CN 117512185A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rape
- lignin content
- straw
- lignin
- genotype
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 title claims abstract description 75
- 239000010902 straw Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title abstract description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 17
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 13
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 13
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 claims description 10
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims description 7
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 claims description 7
- 101100230900 Arabidopsis thaliana HEXO1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101100412393 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) REG1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000918264 Homo sapiens Exonuclease 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101100127690 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FAA2 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 abstract description 5
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 13
- 239000002585 base Substances 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 6
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 6
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 5
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 5
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 5
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- OOCCDEMITAIZTP-QPJJXVBHSA-N (E)-cinnamyl alcohol Chemical compound OC\C=C\C1=CC=CC=C1 OOCCDEMITAIZTP-QPJJXVBHSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- JMFRWRFFLBVWSI-NSCUHMNNSA-N coniferol Chemical compound COC1=CC(\C=C\CO)=CC=C1O JMFRWRFFLBVWSI-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- LZFOPEXOUVTGJS-ONEGZZNKSA-N trans-sinapyl alcohol Chemical compound COC1=CC(\C=C\CO)=CC(OC)=C1O LZFOPEXOUVTGJS-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008027 Akebia quinata Species 0.000 description 1
- 235000007756 Akebia quinata Nutrition 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000209763 Avena sativa Species 0.000 description 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- OOCCDEMITAIZTP-UHFFFAOYSA-N allylic benzylic alcohol Natural products OCC=CC1=CC=CC=C1 OOCCDEMITAIZTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- LZFOPEXOUVTGJS-UHFFFAOYSA-N cis-sinapyl alcohol Natural products COC1=CC(C=CCO)=CC(OC)=C1O LZFOPEXOUVTGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940119526 coniferyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229930014251 monolignol Natural products 0.000 description 1
- 125000002293 monolignol group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
- A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于植物遗传育种技术领域，提供了一种与油菜秸秆木质素含量关联分子标记组合及应用。本发明提供QTL区域位于油菜的C9染色体上两个区域，QTL位点qBnADL.C09.1下SNP6020的AA或AG基因型、qBnADL.C09.2下SNP54552的AA或AC基因型的秸秆，木质素含量明显高于其他基因型。通过对这些QTL区域进行单倍型鉴定，即可预测油菜秸秆木质素水平。因此，基于油菜品种（系）的单倍型情况选择合适的分子基因型或转基因手段，实现改良油菜秸秆中木质素的含量，从而改良油菜田间倒伏现状，增强油菜的抗病性，进一步提高油菜产量。
Description
技术领域
本发明属于植物遗传育种技术领域，尤其涉及一种与油菜秸秆木质素含量关联分子标记组合及应用。
技术背景
油菜是一种重要的油料作物，其在世界范围内都有较为广泛的种植。油菜的倒伏会使油菜的产量和含油量都大幅下降，而在油菜的开花期倒伏则减产更为严重，可达46％，倒伏的程度越高，对产量和含油量的影响越大,而且秸秆的倒伏比根部导致的减产更多。目前油菜的田间倒伏已经成为油菜减产的重要因素，有多个研究证实，作物中茎秆部分木质素的含量与作物的倒伏具有相关性。在小麦、大豆、燕麦等作物的研究中，茎秆中木质素的含量会与作物的抗倒伏性具有显著的正相关。木质素、半纤维素、纤维素都是细胞壁的主要成分，这些纤维组分在作物生长的各个阶段和作物的不同位置具有不同作用效果。木质素是肉桂醇、松柏醇、芥子醇单体的高聚合物，可以沉积在植物组织的细胞壁中，增强植物的茎杆强度，而茎的强度是植物抗倒伏的重要指标，木质化是植物适应陆地生存的重要手段之一。尽管植物中壁聚合物的特性大致相同，但是不同木质素单体的比例也会使得作物的抗倒伏能力发生变化。通过施用有机碳和硅提高木质素相关合成酶的活性，使得木质素的含量上升，增强了油菜的抗倒伏能力。因此，研究可以调节油菜秸秆木质素合成的相关基因，对研究油菜的抗倒性有重要的意义。
木质素在生物能源生产中的负面作用主要体现在以下几个方面：1.阻碍糖化过程：木质素可以阻碍生物质的糖化过程，使得从生物质中提取可发酵的糖变得困难。这是因为木质素会包裹住纤维素和半纤维素，阻止酶的作用。2.降低热值：木质素的存在会降低生物质的热值，因为木质素的热值通常低于纤维素和半纤维素。3.增加预处理成本：为了克服木质素带来的问题，需要进行预处理步骤，如蒸汽爆破、酸处理或碱处理等，这会增加生物能源生产的成本。4.环境问题：木质素的分解可能会产生一些有害物质，如酚类化合物，这些物质可能对环境造成影响。因此，降低油菜秸秆中的木质素含量，可以有利于油菜秸秆的降解，跟有利于作为生物质利用。
近年来，随着油菜分子生物学的迅速发展，许多控制油菜产量性状的QTL已被定位，但目前油菜秸秆利用及其生物质组成的遗传基础几乎为空白，通过油菜单倍型选择相应的遗传改良方面研究更少。通过研究油菜中影响秸秆木质素含量的基因，可以实现对油菜秸秆中的木质素含量进行调控，从而实现改良油菜的抗倒伏能力或者提高秸秆中生物质的转化效率。筛选影响油菜秸秆木质素的基因，为改良油菜性状提供新的思路。
发明内容
本发明的目的在于提供了检测甘蓝型油菜ZS11.V0参考基因组C09染色体的54552506位碱基的试剂在甘蓝型油菜秸秆木质素含量育种中的应用。
本发明的另一个目的在于提供了检测甘蓝型油菜ZS11.V0参考基因组C09染色体的6020367位碱基和54552506位碱基的试剂在甘蓝型油菜秸秆木质素含量育种中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人通过124份油菜品系的自然群体来进行关联分析，利用挑选出的SNP和INDEL位点作为基因型数据，使用三个环境下秸秆木质素含量计算他们的育种值BLUP作为其表型数据，使用了Q+K的混合线性模型进行全基因组关联分析，使用-log10P>6作为阙值，确定了2个QTL位点，分别将其命名为qBnADL.C09.1和qBnADL.C09.2，效应值分别为6.73和6.96，针对这两个位点，对比找到两个SNP分子标记SNP6020和SNP54552，其中SNP6020位于甘蓝型油菜ZS11.V0参考基因组C09染色体的6020367位碱基，SNP54552位于甘蓝型油菜ZS11.V0参考基因组C09染色体的54552506位碱基。
本发明的保护范围包括：
检测甘蓝型油菜ZS11.V0参考基因组C09染色体的54552506位碱基的试剂在甘蓝型油菜秸秆木质素含量育种中的应用；
以上所述的应用，优选的，所述的试剂为引物，利用本领域的常规技术，均能针对该碱基设计出检测引物。
优选的，针对SNP54552分子标记设计的KASP引物为：
KASP标记上游引物HEX2序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAAACAACGAACAAATG CTG-3’；
KASP标记上游引物FAM2序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACCAAACAACGAACAAAT GCTT-3’；
KASP标记下游引物R2序列为5’-TGGTAATAATCCTTATATAGTTATGGTTGA-3’。
检测甘蓝型油菜ZS11.V0参考基因组C09染色体的6020367位碱基和54552506位碱基的试剂在甘蓝型油菜秸秆木质素含量育种中的应用；
以上所述的应用，优选的，所述的试剂为引物，利用本领域的常规技术，均能针对该碱基设计出检测引物。
优选的，本发明中针对SNP54552分子标记设计的KASP引物与上述相同；
优选的，针对SNP6020分子标记设计的KASP引物为：
KASP标记上游引物HEX1序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTACAGTGCGCTAGTCAAACGA-3’；
KASP标记上游引物FAM1序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTGCGCTAGTCGGACGG-3’；
KASP标记下游引物R1序列为5’-TTTTTGGTAAATCGCTAGGCTC-3’。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供了由两个SNP位点组成的油菜秸秆木质素含量水平高低选育的组合，可以定向选择秸秆木质素含量水平高或低的油菜资源或品系。油菜育种家比较秸秆木质素含量高或低的品种或品系，发现秸秆木质素含量高的油菜，抗倒性好，抗病性显著提升。本发明旨在以油菜秸秆木质素含量水平为测定和衡量指标，为选育秸秆木质素含量高的品种或品系提供技术支持，为研究油菜理想株型提供方法，进而最终提高油菜的经济产量。
(2)本发明利用优选标志物可在油菜生育早期鉴定出符合育种目标的油菜种质，对油菜秸秆木质素含量高低的早期预测和筛选具有重要意义，也有利于提高育种效率，加快育种进程。
附图说明
图1为本发明实施例1自然群体材料在三个环境下的秸秆木质素含量分布图。
图2为本发明实施例1中基于Tasselv5.0混合线性模型(MLM)的油菜秸秆木质素含量在基因组上关联位点的曼哈顿图，阈值为-Log10P>6。
图3为本发明实施例1中秸秆木质素含量等位变异与表型显著性统计图；
其中：表型关联两个SNP等位变异与木质素含量的网箱图，有显著性统计；(*:P<0.05；**:P<0.01)。
图4为为本发明实施例1中自然群体124份材料根据两个SNP开发的KASP标记分型结果；
图中绿蓝为两种等位基因型，红色为杂合基因型，黑色为未检出，灰色为阴性对照水。
具体实施方式
下列实例将进一步说明发明的具体步骤以及特征，该等实例仅为示例而用，并非对本发明的限制。本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。本发明中涉及到的试剂和材料非特殊说明均为市售。在本发明实施例中，除特别说明，参考的基因组为中双11参考基因组ZS11.v0版本，https://yanglab.hzau.edu.cn/BnIR/germplasm_info？id＝ZS11.v0。
实施例1：
与油菜秸秆木质素含量关联分子标记的发掘：
1.秸秆木质素测定
本实验采用了124份油菜品系的自然群体来进行关联分析，这些品系主要来自中国长江流域油菜主栽区的品种和品系，以及少量来自澳大利亚和欧洲的资源材料(表1)。实验材料种植在湖北省阳逻、安徽省六安和贵州省遵义三个环境，所有实验种植管理均按照当地的田间管理和栽培条件进行。每个小区包含三行，每行18株，每个小区共54株。行与行之间的间距为33厘米，每行内植株之间的间距为11厘米，种植密度为每公顷270,000株。木质素的测定时期为油菜成熟期，分别取油菜的秸秆和根颈部组织，在60℃烘箱中进行烘干处理，之后将其研磨至粉状，使用FOSS NIR Systems 2500型近红外光谱分析仪收集了其近红外光谱数据(陈雪萍，2018)，通过已构建好的化学测定-近红外模型进行木质素含量的测定分析。
在本发明中，将油菜秸秆木质素含量≥13％，定义为高水平；将油菜秸秆木质素含量≤10％，为定义低水平。
表1：124份油菜种质材料的情况
注：所有材料信息以论文形式已公开公布，详见Liu et al.,2016。
Liu et al.,2016相关信息：Liu J#,Wang J#,Wang H,Wang WX,Mei DS,Zhou RJ,Cheng HT,Yang J,Raman H*,Hu Q*.Multigenic control of pod shatteringresistance in Chinese rapeseed ger mplasm revealed by genome-wide associationand linkage analyses.Frontiers in Plant Science,2016,7:1058。
如图1所示，群体种木质素含量的变化是连续的，基本符合正态分布，说明影响油菜种木质素含量的性状可能是数量性状。且两个性状的遗传力较高，基因型效应影响较大。计算发现三个环境下的环境效应对木质素含量的影响较为显著，因此我们对三个环境下的木质素含量进行了最佳线性无偏的计算，对多个环境的性状进行了整合处理，去除了环境效应，得到了个体稳定遗传的表型。
2、群体变异数据获取
将124份品系的二代测序数据mapping到参考基因组上，获得了群体变异文件。使用GATK软件对群体变异文件进行过滤，参数设置为QD<2.0、FS>50、MQ<20、MQ Ran k Sum>-12.5、Read Pos Rank Sum>-8.0，并提取出其中的SNP和INDEL信息，保存成VCF格式的文件。后续使用Plink软件进行质量控制，以次要等位基因频率大于0.05和缺失数据小于10％作为群体变异数据的过滤标准，从变异文件中筛选出6730436个SNP和InD el进行后续分析。
3、全基因组关联分析
使用faststrature软件进行计算群体的种群结构，尝试k＝1到10的不同值，并使用shell命令行查看CV error，选取最小的CV error的群体结构文件作为GWAS分析的群体结构。使用emmax进行混合线性模型(mlm)分析，评估SNP与相应性状的相关性，使用emma x生成亲缘关系矩阵(kinship)，将群体结构和亲缘关系矩阵加入到模型中，以消除由亲缘关系引起的假阳性。使用R3.3.3.中的CMplot包来绘制曼哈顿图和QQ图，以展示GWAS分析的结果。
利用挑选出的SNP和INDEL位点作为基因型数据，使用三个环境下秸秆木质素含量计算他们的育种值BLUP作为其表型数据，使用了Q+K的混合线性模型进行全基因组关联分析，得到的结果展示如图2所示。我们使用-log10P>6作为阙值，确定了2个QTL位点，分别将其命名为qBnADL.C09.1和qBnADL.C09.2(表2，图2)，其中根据秸秆木质素定位到的QTL为qBnADL.C09.1、qBnADL.C09.2，位于油菜的C09染色体上，peak位点的效应值可达到6.73和6.96，使用-log10P>4确定了效应区间的范围，区间分别为5926615-6399213和54552293-56304260。
表2：GWAS定位油菜木质素含量QTL区间信息
4、单倍型分析
比对中双11参考基因组(ZS11.v0，https://yanglab.hzau.edu.cn/BnIR/germplasm_info？id＝ZS11.v0)，提取两个peak位点SNP(分别位于油菜基因组C9上6020367bp和54552506bp)的序列等位变异情况(表3)，结合群体材料的木质素blup值进行联合分析，寻求优势等位基因。分析与秸秆木质素相关的两个QTL位点的信息，qBnADL.C09.1处SNP6020有三种基因型，使用T检验后发现AA与GG的效应是极显著的(表4，图3)，GG与AG之间的效应也是极显著的，而AA与AG的效应为显著，在qBnADL.C09.1处AA和AG基因型的木质素含量较高，为优势基因型(AA基因型的序列为SEQ ID NO.1所示)。而在qBnADL.C09.2处SNP54552存在三种基因型CC、AC和AA，发现CC与AC的效应是极显著的，CC与AA之间的效应也是显著的，而AC与AA的效应为不显著，其中AA和AC基因型的木质素含量较高(AA基因型的序列为SEQ ID NO.4所示)。
检测甘蓝型油菜ZS11.V0参考基因组C09染色体的6020367号碱基，如果显示基因型为AA或AG，则是茎秆中木质素较高的基因型。如果显示是GG，则是茎秆中木质素含量较低的材料。检测油菜ZS11.V0参考基因组C09染色体的54552506号碱基，如果基因型为AA或AC，则属于木质素含量较高的材料，如果基因型为CC，则属于木质素含量较低的材料。
表3：候选位点附近的序列
表4：四个木质素含量效应QTL的峰值位点变异的显著性T检验
由表4也可知，验证群体中该位点不同等位基因间秸秆木质素含量存在差异，说明该位点真实有效，可用于秸秆木质素含量的分子标记辅助选择。
针对上述两个分子标记，设计了6条检测引物用于KASP分型：
KASP标记特异引物的开发
针对SNP6020分子标记，根据Seq ID NO.1和2序列设计三条引物，上游引物HEX1(Seq ID NO.5)、上游引物FAM1(Seq ID NO.6)和下游引物R1(Seq ID NO.7)，其中HEX1和FAM1分别包含HEX和FAM荧光接头序列(下划线)，序列如下：
KASP标记上游引物HEX1序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTACAGTGCGCTAGTCAAACGA-3’；
KASP标记上游引物FAM1序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTGCGCTAGTCGGACGG-3’；
KASP标记下游引物R1序列为5’-TTTTTGGTAAATCGCTAGGCTC-3’。
利用该引物，基因型检测出来为AA或AG的材料木质素含量偏高，基因型检测出来为GG的材料偏低(图4)。
针对SNP54552分子标记，根据Seq ID NO.3和4序列设计三个引物，上游引物HEX2(Seq ID NO.8)、上游引物FAM2(Seq ID NO.9)和下游引物R2(Seq ID NO.10)，其中HEX2和FAM2分别包含HEX和FAM荧光接头序列(下划线)，序列如下：
KASP标记上游引物HEX2序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAAACAACGAACAAATG CTG-3’；
KASP标记上游引物FAM2序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACCAAACAACGAACAAAT GCTT-3’；
KASP标记下游引物R2序列为5’-TGGTAATAATCCTTATATAGTTATGGTTGA-3’。
利用该引物，基因型检测出来为AA或AC的材料木质素含量偏高，基因型检测出来为CC的材料偏低(图4)。
实施例2：
油菜秸秆木质素含量关联分子标记组合在甘蓝型油菜木质素含量育种中的应用
本实验选取另一组油菜品种(系)进行种植(材料来源见参考文献Xuan et al.,2020.Genome-wide-association study reveals new genes involved in leaftrichome formation in polyploidoilseed rape(Brassica napus).Plant Cell andEnvironment 43:675-691)，种植地点在2020年湖北省阳逻试验基地，所有实验种植管理均按照当地的田间管理和栽培条件进行。每个小区包含三行，每行18株，每个小区共54株。行与行之间的间距为33厘米，每行内植株之间的间距为11厘米，种植密度为每公顷270,000株。木质素的测定时期为油菜成熟期，取油菜的秸秆，在60℃烘箱中进行烘干处理，之后将其研磨至粉状，使用FOSS NIR Systems 2500型近红外光谱分析仪收集了其近红外光谱数据(陈雪萍，2018)，通过已构建好的化学测定-近红外模型进行木质素含量的测定分析。
分别提取289份油菜核心种质五叶期叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用KASP标记专用引物在进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增是在ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行，PCR结束后该仪器根据荧光信号可进行基因分型。所述的扩增体系均为10μl反应体系：油菜样品DNA模板，60ng/μl，1μl；2×KASPMastermix5μl；KASPAssayMix，HEX:FAM:R＝2:2:5，0.14μl；水4μl。反应条件包括94℃预变性15min；94℃变性20sec，61～55℃退火60sec，每一个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20sec，55℃退火60sec，26个循环。
反应完成后，Bio-radCFX96Touch荧光定量PCR仪可以直接对PCR反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形，2对标记引物均可清楚的将两种基因型分开。
SNP6020标记，靠近Y轴远离X轴的绿圆点为携带A等位变异位点，基因型为AA；靠近X轴远离Y轴的蓝圆点为携带G等位变异位点，基因型为GG；中间红圆点为杂合基因型AG；灰色圆点为对照。
SNP54552标记，靠近Y轴远离X轴的绿圆点为携带C等位变异位点，基因型为CC；靠近X轴远离Y轴的蓝圆点为携带A等位变异位点，基因型为AA；中间红圆点为杂合基因型AC；灰色圆点为对照。
2、另一组油菜重测序基因组原始数据已公开从网上获得，可在GSA(https://ngdc.cnc b.ac.cn/gsa/)网站下载，项目编号为PRJNA476657，二代测序数据mapping到参考基因组上，获得了群体变异文件。群体变异检测过程同实例1中第2部分内容完全一致。
结果如下：根据其中两个位点SNP6020和SNP54552高含量单倍型结果qBnADL.C09.1(A/A或A/G)和qBnADL.C09.2(A/A或A/C)鉴定出品种(系)(表5)，木质素含量也高于低含量单倍型qBnADL.C09.1(G/G)和qBnADL.C09.2(C/C)的品种(系)
表5：关联位点基因型鉴定出秸秆木质素含量差异品种(系)(展示的是部分极端材料结果)
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.检测甘蓝型油菜ZS11.V0参考基因组C09染色体的54552506位碱基的试剂在甘蓝型油菜秸秆木质素含量育种中的应用。
2.检测甘蓝型油菜ZS11.V0参考基因组C09染色体的6020367位碱基和54552506位碱基的试剂在甘蓝型油菜秸秆木质素含量育种中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，所述的试剂为引物。
4.根据权利要求1所述的应用，所述的试剂为KASP引物，为：
上游引物HEX2：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAAACAACGAACAAATGCTG-3’；
上游引物FAM2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACCAAACAACGAACAAATGCTT-3’；
下游引物R2：5’-TGGTAATAATCCTTATATAGTTATGGTTGA-3’。
5. 根据权利要求2所述的应用，所述的试剂为KASP引物，为：
上游引物HEX1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTACAGTGCGCTAGTCAAACGA-3’、
上游引物FAM1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTGCGCTAGTCGGACGG-3’、
下游引物R1：5’-TTTTTGGTAAATCGCTAGGCTC-3’；
和
上游引物HEX2：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAAACAACGAACAAATGCTG-3’、
上游引物FAM2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACCAAACAACGAACAAATGCTT-3’、
下游引物R2：5’-TGGTAATAATCCTTATATAGTTATGGTTGA-3’。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311658040.0A CN117512185A (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 一种与油菜秸秆木质素含量关联分子标记组合及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311658040.0A CN117512185A (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 一种与油菜秸秆木质素含量关联分子标记组合及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117512185A true CN117512185A (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=89754937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311658040.0A Pending CN117512185A (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 一种与油菜秸秆木质素含量关联分子标记组合及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117512185A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021226806A1 (zh) * | 2020-05-11 | 2021-11-18 | 武汉双绿源创芯科技研究院有限公司 | 甘蓝型油菜高密度全基因组snp芯片及其应用 |
| CN114196775A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-03-18 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 提高油菜油酸含量的分子标记引物、引物组及其在育种中的应用 |
| CN116024369A (zh) * | 2022-10-31 | 2023-04-28 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种与油菜秸秆半纤维素含量关联的snp分子标记组合及其应用 |
-
2023
- 2023-12-06 CN CN202311658040.0A patent/CN117512185A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021226806A1 (zh) * | 2020-05-11 | 2021-11-18 | 武汉双绿源创芯科技研究院有限公司 | 甘蓝型油菜高密度全基因组snp芯片及其应用 |
| CN114196775A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-03-18 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 提高油菜油酸含量的分子标记引物、引物组及其在育种中的应用 |
| CN116024369A (zh) * | 2022-10-31 | 2023-04-28 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种与油菜秸秆半纤维素含量关联的snp分子标记组合及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xin et al. | Applying genotyping (TILLING) and phenotyping analyses to elucidate gene function in a chemically induced sorghum mutant population | |
| CN112080582B (zh) | 一种与小麦穗长主效qtl位点紧密连锁的kasp分子标记及其应用 | |
| CN110656198B (zh) | 与小麦株高相关的kasp引物组及其应用 | |
| Kumar et al. | Designing a mini-core collection effectively representing 3004 diverse rice accessions | |
| CN106048042A (zh) | 用于鉴定桃果实肉色性状的单核苷酸多态性标记位点、引物、试剂盒及应用 | |
| CN108504773B (zh) | 甘蓝型油菜粒重和角果长度主效qtl位点的分子标记及其应用 | |
| CN111979345A (zh) | 盐胁迫条件下小麦生物量和产量相关kasp标记的开发及应用 | |
| CN109762812A (zh) | 小麦生长势相关snp及其作为靶点在鉴定小麦生长势性状中的应用 | |
| CN111778352B (zh) | 与小麦粒重相关的kasp引物组及其应用 | |
| CN109295248A (zh) | 用于检测控制玉米茎秆强度主效qtl连锁的分子标记的引物、试剂盒、检测方法及应用 | |
| CN107177667B (zh) | 小麦穗密度qtl连锁的hrm分子标记及其应用 | |
| CN109762926B (zh) | 一种与油菜角果数关联的分子标记引物及应用 | |
| CN107446997A (zh) | 与陆地棉纤维细度关联的snp分子标记及其应用 | |
| CN108179220B (zh) | 小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记及其应用 | |
| CN116024369B (zh) | 一种与油菜秸秆半纤维素含量关联的snp分子标记组合及其应用 | |
| CN111763762A (zh) | 一组与小麦粒重相关的kasp引物组及其应用 | |
| CN109055593B (zh) | 提高棉花衣分的snp标记以及高产棉的鉴定和育种方法 | |
| CN117512185A (zh) | 一种与油菜秸秆木质素含量关联分子标记组合及应用 | |
| CN111607659B (zh) | 与苎麻原麻半纤维素含量关联的snp分子标记及其应用 | |
| CN111100946B (zh) | 一种油菜粒重性状主效基因位点的分子标记引物及应用 | |
| CN106636406A (zh) | 与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207及其应用 | |
| CN108588242B (zh) | 一种长牡蛎ahr基因的snp位点 | |
| CN112342309B (zh) | 棉花花基斑性状相关snp分子标记及其应用 | |
| CN111118196B (zh) | 一种油菜粒重性状主效基因位点的分子标记cnu288引物及应用 | |
| CN116694655B (zh) | 一个陆地棉油分蛋白品质关联的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶基因的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |