CN104073486B - 一种与大口黑鲈快速生长相关的snp位点及其鉴定方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与大口黑鲈快速生长相关的SNP位点及其鉴定方法和应用。所述SNP位点位于大口黑鲈组织蛋白酶B基因序列的第234个碱基处，该SNP位点的等位基因为C和G，有CC、CG和GG三种基因型，所述大口黑鲈组织蛋白酶B基因序列如SEQ？ID？NO.1所示。所述SNP位点可应用于快速生长大口黑鲈亲本的筛选。

Description

一种与大口黑鲈快速生长相关的SNP位点及其鉴定方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种与大口黑鲈快速生长相关的SNP标记及其鉴定方法和应用。

背景技术

大口黑鲈(MicropterussalmoidesL.)，俗名加州鲈，原产于北美洲，具有生长快、耐低温、肉质鲜美和易捕捞等特点，是重要的淡水养殖鱼类之一。1983年从台湾引种到广东省，现在全国大部分地区均有养殖。然而，目前我国养殖的大口黑鲈是由野生种家养驯化而成的，缺少定向选育，在亲本留种时经常选择个体小，性成熟早的个体作为亲本，致使我国大口黑鲈种质的下降，主要表现在生长速度下降、性成熟年龄普遍提前、饵料转化效率低、抗病力也大幅下降，其中，生长速度关系到大口黑鲈产量的高低，养殖效益的大小。大口黑鲈小型化的趋势直接制约着大口黑鲈养殖业的发展。因此，改良大口黑鲈生长速度的工作势在必行。

挑选优质亲鱼是提高养殖鱼类生长速度的主要方法之一，其目的是为了改变养殖群体的遗传结构，使后代获得更快的生长速度、更好的抗病能力的遗传特点。在生产中，其传统方法是挑选个体较大、身体健壮的鱼作为留种亲本，即根据表型来决定亲鱼是否留种。这种方法方便、快捷、简单，但受人为因素影响很大，加上大口黑鲈属于肉食性为主的鱼类，掠食性强，饵料不足是会互相残食，致使其生长悬殊较大。如此可见，仅从表型判断大口黑鲈亲本质量往往达不到理想的效果。随着分子生物学和遗传学的发展，已涌现出很多种遗传标记，如AFLP、RAPD、SSR、SNP等标记，其中，SNP标记因分布广泛，适宜高通量自动化分析，遗传稳定，日益成为遗传育种研究中首选的遗传标记。若这些遗传标记能与生产性状相关联在一起，即可实现从DNA水平上进行选择育种，克服了传统方法受人为因素影响大的不利因素，提高了选择的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，从而缩短育种周期，加快育种进程。通过发现与大口黑鲈快速生长有关的基因，大大提高快长亲本的筛选效果。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种与大口黑鲈快速生长相关的SNP标记及其应用。

本发明的另一个目的在于提供一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种与大口黑鲈快速生长相关的SNP位点，其位于大口黑鲈组织蛋白酶B基因序列的第234个碱基处，该SNP位点的等位基因为C和G，有CC、CG和GG三种基因型，所述大口黑鲈组织蛋白酶B基因序列如SEQIDNO.1所示。

上述的SNP位点在筛选快速生长大口黑鲈亲本中的应用。

一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，包括如下步骤：检测大口黑鲈亲本中的SEQIDNO.1所示的序列，选择序列如SEQIDNO.1所示的纯合体作为亲本。

具体包括如下步骤：

1)从待测亲本中剪取鳍条样品，提取DNA；

2)以提取得到的DNA为模板，利用引物P1和P2进行初次PCR扩增，得到初次PCR产物，

P1：5′-TGAGTCATATGAAAGCATTAC-3′(SEQIDNO.2)，

P2：5′-ACACTTTGTGTATGCAGGCTG-3′(SEQIDNO.3)；

3)取纯化的PCR产物用引物P3进行延伸，并在测序仪上检测，确定待测亲本是否为SEQIDNO.1所示序列的纯合体，

P3：5′-TTTTTTATGCATTGGGGTGTGTCTCCAC-3′(SEQIDNO.4)。

优选的，步骤3)的具体操作为：使用Snapshot方法用初次获得PCR产物为模板，使引物延伸一个碱基在多态位点终止，在测序仪上检测，根据峰的颜色可知多肽位点的碱基是否为GG，来确定待测亲本是否为SEQIDNO.1所示序列的纯合体。

初次PCR扩增的反应体系为：

扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸30s，24个循环；72℃延伸3min。

引物延伸的反应体系为：

延伸条件为：96℃预变性1min；96℃变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，30个循环。

申请人研究发现，在大口黑鲈组织蛋白酶B(cathepsinB，CTSB)序列的C+598G位置发现一个SNP，使组成的氨基酸由甘氨酸(Gly)变为精氨酸(Arg)，经过Snapshot方法分型发现存在等位基因G和等位基因C，组成三种基因型GG、GC和CC。在检测的随机群体实验中发现，这个SNP对体质量和全长性状有显著影响，其基因型GG的个体的生长性状明显优于基因型为CC的个体。因此，根据大口黑鲈组织蛋白酶B基因列设计引物，建立了有效地鉴定具有优良生长性状且遗传稳定的亲本。利用本方法将生产中CC和GC基因型大口黑鲈亲本去除，保留GG基因型的大口黑鲈亲本，便可快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈的品种。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点，且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。

本发明的方法，大大降低了大口黑鲈亲本筛选的盲目性，可以快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈个体。

通过Snapshot分析，既保证了检测结果的可靠性，无需繁琐操作进行测序分析，提高了处理效率和精确性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例

申请人研究发现，在大口黑鲈组织蛋白酶B(cathepsinB，CTSB)序列的C+598G位置发现一个SNP，使组成的氨基酸由甘氨酸(Gly)变为精氨酸(Arg)，经过Snapshot方法分型发现存在等位基因G和等位基因C，组成三种基因型GG、GC和CC。等位基因G的序列如SEQIDNO:1所示，SEQIDNO:1所示序列的第234bp的C/G突变，当为G碱基时即得到等位基因G。

本实验用于关联分析的样本数为165尾的随机群体M为同一批繁殖、同池养殖，且采样时间一致，因此在建立模型时不考虑时间、环境及人工饲养条件的差异。不同基因型个体间生长性状的多重比较结果见表2，关联分析结果表明，SNP所构成的基因型对体质量性状有显著影响(P<0.05)，基因型为GG的个体的生长性状明显优于基因型为CC的个体。

表1大口黑鲈HBP基因SNP不同基因型在随机群体中频率分布

表2不同基因型个体间生长性状的多重比较

注：表中数值为平均值±标准误差，同一列不同上标字母表示差异显著(P<0.05)。

从以上数据可知，如SEQIDNO:1所示的基因与大口黑鲈的生长性能密切相关。通过检测大口黑鲈亲本是否为GG纯合体，即可快速、准确地筛选出所需要的亲本。

具体检测方法：

(一)引物序列：

根据大口黑鲈组织蛋白酶B基因序列设计了一对引物进行PCR扩增，设计并合成的引物如下：

P1：5′-TGAGTCATATGAAAGCATTAC-3′(SEQIDNO.2)

P2：5′-ACACTTTGTGTATGCAGGCTG-3′(SEQIDNO.3)

引物预期扩增1条DNA带，大小323bp。

(二)样品处理(碱裂解法)：

1、剪取待检测鳍条10-20mg，装入干净的EP管中；

2、加入180μL的50mmol/LNaOH溶液，水浴20min(常温)，期间震荡数次；

3、加入20μL的1mol/LTris-HCL溶液(PH＝8.0)，充分涡旋震荡；

4、将样品管放入离心机12000rpm离心10min，吸取上清液，备用。

(三)引物P1、P2的PCR体系：

初次PCR扩增的反应体系和扩增条件为：

(四)引物P1、P2的PCR扩增程序：

(五)对纯化的PCR产物进行单碱基延伸，反应体系为：

延伸引物序列为：P3：5′-TTTTTTATGCATTGGGGTGTGTCTCCAC-3′(SEQIDNO.4)。

延伸条件为：

(六)在测序仪上，对延伸产物大小及峰的颜色进行检测，确定待测亲本的组织蛋白酶B基因的序列的是否为SEQIDNO.1所示序列的纯合体。

取1μl延伸产物，加8μl上样loading，95℃变性3min，立即冰水浴。

本检测方法大约可以在10个小时内操作完成，并且可以同时对多个样本进行检测，能为接下来要进行的大口黑鲈优良品种选育和鉴定提供快速准确的检测结果。我们通过对优势等位基因的鉴定，是在DNA水平上对大口黑鲈种质质量的评估，目的性更强。用该方法检测一个样品所需的成本大约为3元，成本较低，适合推广使用。

<110>中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120>一种与大口黑鲈快速生长相关的SNP位点及其鉴定方法和应用

<130>

<160>4

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>322

<212>DNA

<213>大口黑鲈(MicropterussalmoidesL.)

<400>1

tgagtcatatgaaagcattacaattaaacaaaactgaagatcatgtcaaaatgttcagtg60

ttaaattcaatttctcctatatggcaaatattggtgagcatgactcaacgctcattgtta120

gcatgcttaatcccttatttatgagagatggaacttaccaaagtgcttgtcctgtttgta180

gctgggtgtgtatccagcttcacactcgttgatgcattggggtgtgtctccacgctctcc240

agtgcaggagggtctgctgccattcacatggtgctcacagggagggatggtgtagggacg300

acagcctgcatacacaaagtgt322

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgagtcatatgaaagcattac21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

acactttgtgtatgcaggctg21

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ttttttatgcattggggtgtgtctccac28

Claims (6)

1.一种与大口黑鲈快速生长相关的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.权利要求1所述的SNP分子标记在筛选快速生长大口黑鲈亲本中的应用。

3.一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，包括如下步骤：检测大口黑鲈亲本中的SEQIDNO.1所示的序列，选择序列如SEQIDNO.1所示的纯合体作为亲本。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）从待测亲本中剪取鳍条样品，提取DNA；

2）以提取得到的DNA为模板，利用引物P1和P2进行初次PCR扩增，得到初次PCR产物，

P1：5'-TGAGTCATATGAAAGCATTAC-3'，

P2：5'-ACACTTTGTGTATGCAGGCTG-3'；

3）取纯化的PCR产物用引物P3进行延伸，并在测序仪上检测，确定待测亲本是否为SEQIDNO.1所示序列的纯合体，

P3：5'-TTTTTTATGCATTGGGGTGTGTCTCCAC-3'。

5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，使用Snapshot方法用初次获得PCR产物为模板，使引物延伸一个碱基在多态位点终止，在测序仪上检测，根据峰的颜色可知多态位点的碱基是否为GG，来确定待测亲本是否为SEQIDNO.1所示序列的纯合体。

6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，引物延伸的反应体系为：

纯化PCR产物2μl

SnapshotMix试剂1μl

延伸引物2μl

水补至6μl

延伸条件为：96℃预变性1min；96℃变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，30个循环。