CN102242121B - 大口黑鲈快速生长基因及亲本筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大口黑鲈快速生长基因及亲本筛选方法，生长基因其序列如SEQIDNO.1所示。该基因对大口黑鲈的体重、体长、全长、体高、体宽有显著影响。通过检测这一基因在大口黑鲈中是否为纯合，可以快速、准确地筛选出生长性状优异的亲本。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点，且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因，特别涉及一种与大口黑鲈快速生长有关的基因。本发明还涉及使用该基因进行快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法。
背景技术
大口黑鲈(Micropterus salmoides L.)，俗名加州鲈，原产于北美洲，具有生长快、耐低温、肉质鲜美和易捕捞等特点，是重要的淡水养殖鱼类之一。1983年从台湾引种到广东省，现在全国大部分地区均有养殖。然而，目前我国养殖的大口黑鲈是由野生种家养驯化而成的，缺少定向选育，在亲本留种时经常选择个体小，性成熟早的个体作为亲本，致使我国大口黑鲈种质的下降，主要表现在生长速度下降、性成熟年龄普遍提前、饵料转化效率低、抗病力也大幅下降，其中，生长速度关系到大口黑鲈产量的高低，养殖效益的大小。大口黑鲈小型化的趋势直接制约着大口黑鲈养殖业的发展。因此，改良大口黑鲈生长速度的工作势在必行。
挑选优质亲鱼是提高养殖鱼类生长速度的主要方法之一，其目的是为了改变养殖群体的遗传结构，使后代获得更快的生长速度、更好的抗病能力的遗传特点。在生产中，其传统方法是挑选个体较大、身体健壮的鱼作为留种亲本，即根据表型来决定亲鱼是否留种。这种方法方便、快捷、简单，但受人为因素影响很大，加上大口黑鲈属于肉食性为主的鱼类，掠食性强，饵料不足是会互相残食，致使其生长悬殊较大。如此可见，仅从表型判断大口黑鲈亲本质量往往达不到理想的效果。随着分子生物学和遗传学的发展，已涌现出很多种遗传标记，如AFLP、RAPD、SSR、SNP等标记，其中，SNP标记因分布广泛，适宜高通量自动化分析，遗传稳定，日益成为遗传育种研究中首选的遗传标记。若这些遗传标记能与生产性状相关联在一起，即可实现从DNA水平上进行选择育种，克服了传统方法受人为因素影响大的不利因素，提高了选择的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，从而缩短育种周期，加快育种进程。但是，现在未发现与大口黑鲈快速生长有关的基因，这大大影响亲本的筛选效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与大口黑鲈快速生长有关的基因。
本发明的另一个目的在于提供一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法。
本发明所采取的技术方案是：
大口黑鲈垂体特异性转录因子启动子，其序列如SEQ ID NO.1所示。
一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，包括以下步骤：检测大口黑鲈亲本中的大口黑鲈垂体特异性转录因子启动子的序列，选择序列如SEQ ID NO.1所示的纯合体作为亲本。
包括如下步骤：
1) 从待测亲本中剪取鳍条样品，提取DNA；
2) 以提取得到的DNA为模板，
P1：5’-GCAGAGCCCAAGACAAACAC-3’ （SEQ ID NO.2）
P2：5’-ATGAGGATTGGCAAGGGTGAGTCT-3’ （SEQ ID NO.3）
为引物，进行初次PCR扩增，得到初次PCR产物；
3) 以初次PCR产物为模板，
P3：5’-GATAAAGTAAGACTAAACACAAGC-3’ （SEQ ID NO.4）
P4：5’-CATTCTTCTCAGGCCCCGCT-3’ （SEQ ID NO.5）
为引物，进行二次PCR扩增 ，得到二次PCR产物；
4) 对二次PCR产物进行分析，确定待测亲本的垂体特异性转录因子启动子的是否为SEQ ID NO.1所示序列的纯合体。
使用内切酶BsrBⅠ对二次PCR产物进行单酶切，之后对酶切产物进行电泳分析确定待测亲本的启动子的是否为SEQ ID NO.1所示序列的纯合体。
初次PCR扩增的反应体系为：
ddH2O： 14.8μL；
10×buffer ： 2.0 μL；
MgCl2（25 mmol/L）： 0.8 μL；
dNTP（10 μmol/L）： 0.4 μL；
上下游引物（20 μmol/L）各： 0.4 μL；
DNA模板 1.0 μL；
Taq酶（5U/μL） 0.2 μL。
初次PCR扩增的程序为：94℃预变性 4 min；94℃变性30秒，53℃退火90秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸 10 min。
二次PCR扩增的反应体系为：
ddH2O： 14.8μL，
10×buffer ： 2.0 μL，
MgCl2（25 mmol/L）： 0.8 μL；
dNTP（10 μmol/L）： 0.4 μL；
上下游引物（20 μmol/L）各： 0.4 μL；
初次PCR扩增产物： 1.0 μL；
Taq酶（5U/μL） 0.2 μL。
二次PCR扩增的程序为：94℃预变性 4 min；94℃变性30秒，50℃退火15秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸 10 min。
申请人研究发现，在大口黑鲈垂体特异性转录因子 (pituitary specific transcription factor1, POU1F1)启动子序列的-183位置发现一个SNP，用限制性内切酶BsrBⅠ酶切后有210bp和187bp两条带，定为等位基因A和B。在检测的随机群体实验中发现，这个SNP对体重、体长、全长、体高、体宽有显著影响，其基因型AA和AB的个体的生长性状明显优于基因型为BB的个体。因此，根据大口黑鲈POU1F1启动子序列设计引物，建立了有效地鉴定具有优良生长性状且遗传稳定的亲本。利用本方法将生产中BB和AB基因型大口黑鲈亲本去除，保留AA基因型的大口黑鲈亲本，便可快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈的品种。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点，且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。
本发明的方法，大大降低了大口黑鲈亲本筛选的盲目性，可以快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈品种。
通过酶切之后分析，既保证了检测结果的可靠性，无需使用专用仪器对PCR产物进行测序分析，提高了处理效率。
具体实施方式
研究发现，在大口黑鲈垂体特异性转录因子 (pituitary specific transcription factor1, POU1F1)启动子序列的-183位置发现一个SNP，用限制性内切酶BsrBⅠ酶切后有210bp和187bp两条带，定为等位基因A和B。等位基因A的序列如SEQ ID NO:1所示， SEQ ID NO:1所示序列的第-183bp的T突变为G即得到等位基因B。
本实验用于关联分析的样本数为126的随机群体M为同一批繁殖、同池养殖，且采样时间一致，因此在建立模型时不考虑时间、环境及人工饲养条件的差异。不同基因型个体间生长性状的多重比较结果见表3-3，关联分析结果表明，两个SNPs所构成的单倍型对体重、体长、全长、体高、体宽有显著影响（P<0.05），基因型为AA和AB的个体的生长性状明显优于基因型为BB的个体。
在随机群体N的293尾个体中的检测结果见表3-4，不同基因型个体间生长性状的多重比较结果见表3-5。关联分析结果表明，基因型为AA型和AB型的个体在体重、头长、尾柄高方面均显著高于BB型个体（P<0.05），体长、全长、体高和尾柄长方面的差异不显著，但仍有优于基因型为BB的个体的趋势，基因型为AB型和AA型的个体之间在上述各生长性状上没有明显差异。
从以上数据可知，如SEQ ID NO:1所示的基因与大口黑鲈的生长性能密切相关。通过检测大口黑鲈亲本是否为AA纯合体，即可快速、准确地筛选出所需要的亲本。
具体检测方法：
(一) 引物序列：
根据大口黑鲈POU1F1启动子序列设计了两对引物进行巢式PCR扩增，设计并合成的引物如下：
P1：5’-GCAGAGCCCAAGACAAACAC-3’ （SEQ ID NO.2 ）
P2：5’-ATGAGGATTGGCAAGGGTGAGTCT-3’ （SEQ ID NO.3 ）
P3：5’-GATAAAGTAAGACTAAACACAAGC-3’ （SEQ ID NO.4 ）
P4：5’-CATTCTTCTCAGGCCCCGCT-3’ （SEQ ID NO.5 ）
引物P1和P2预期扩增1条DNA带，大小1400bp；引物P3和P4预期扩增1条DNA带，大小210 bp。
(二) 样品处理（碱裂解法）：
1、 剪取待检测鳍条10-20 mg，装入干净的EP管中；
2、加入180 μL的50 mmol/L NaOH溶液，水浴20 min，期间震荡数次；
3、加入20 μL的1mol/L Tris-HCL溶液（PH=8.0），充分涡旋震荡；
4、将样品管放入离心机12000 rpm离心10 min，吸取上清液，备用。
(三) 引物P1、P2的PCR体系：
ddH2O： 14.8μL，
10×buffer ： 2.0 μL，
MgCl2（25 mmol/L）： 0.8 μL；
dNTP（10 μmol/L）： 0.4 μL；
上下游引物（20 μmol/L）各： 0.4 μL；
样品处理后的上清液 1.0 μL；
Taq酶 0.2 μL
(四) 引物P1、P2的PCR扩增程序：
94℃预变性 4 min；94℃变性30秒，53℃退火90秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸 10 min。
(五) 引物P3、P4的PCR体系：
ddH2O： 14.8μL，
10×buffer ： 2.0 μL，
MgCl2（25 mmol/L）： 0.8 μL；
dNTP（10 μmol/L）： 0.4 μL；
上下游引物（20 μmol/L）各： 0.4 μL；
引物P1、P2的PCR扩增产物： 1.0 μL；
Taq酶 0.2 μL
(六) 引物P3、P4的PCR扩增程序：
94℃预变性 4 min；94℃变性30秒，50℃退火15秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸 10 min。
(七) 酶切体系（用BsrBⅠ对引物P3、P4的PCR扩增产物进行单酶切）：
ddH2O： 5.75 μL
10×FastDigest Buffer： 0.5 μL
PCR DNA： 1.0 μL
内切酶BsrBⅠ： 0.25 μL
酶切结果预期获得2条DNA带，大小分别是210bp和192bp。
(八) 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：
1) 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制（35ml）
H2O 22.259 ml
30﹪聚丙烯酰胺溶液 9.33 ml
10×TBE 3.27ml
20﹪AP（过硫酸铵） 0.117 ml
TEMED 0.024ml
配制方法：
①玻璃板的清洗：用水沾上洗剂把玻璃板擦洗干净后，再用超纯水冲洗，晾干备用。
②凝胶的灌制：先将固定好的玻璃架倾斜，将凝胶沿着梳子插槽边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，然后立即插上梳子，让凝胶溢出，这样可以避免产生气泡。在胶液和梳子接触面加少量单蒸水，以免空气氧化胶液表面。等待胶液凝聚时，仔细观察有无漏胶或气泡产生。一般在灌胶后4-6min即开始凝聚，室温25℃左右20min便可以聚合完全。如室温较低时，聚合时间相应延长。
2) 上样与凝胶电泳
扩增产物与上样缓冲液按体积比3:1混匀后，用毛细管进样器吸取4μL混合物上样，在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压230V，电泳1-2 h。
(九) 硝酸银染色
1) 电泳完毕将胶取出，放于盛有单蒸水的塑料容器（面积比胶稍大）中轻轻漂洗10s，去掉蒸馏水；
2) 加入1%的AgNO3溶液，在脱色摇床上轻摇3～4 min，倒掉AgNO3溶液；用蒸馏水漂洗两次，每次不超过10s，倒掉蒸馏水；
3) 快速加入显色液（NaOH 10g，Na2CO3 0.2g，HCHO 2ml，加蒸馏水定容至500ml）50ml，振荡30s后倒去；
4) 加入500mL显色液。一般3min内，带型显现；
5) 待带型清晰时，将胶取出放于凝胶成相系统拍照，并进行条带分析。
本检测方法大约可以在7个小时内操作完成，能为接下来要进行的大口黑鲈优良品种选育和鉴定提供快速准确的检测结果。我们通过对优势等位基因的鉴定，是在DNA水平上对大口黑鲈种质质量的评估，目的性更强。用该方法检测一个样品所需的成本大约为2元，成本较低，适合推广使用。
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 大口黑鲈快速生长基因及亲本筛选方法
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1629
<212> DNA
<213> 大口黑鲈(Micropterus salmoides L.)
<400> 1
actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtaaaa caattaacat gtgaccctgc 60
aactgagtga atctataaac tcagcaacca aaaatctgtt ttgtggagag acattgtcaa 120
aagtgcatct agtccatatt tacactgcat gcttaaacgt gtcaaatcgt gcctgccacc 180
cacaagctat tttccacctg ctgcccacct acatcaacaa tagcaaagca gagcccaaga 240
caaacacaaa cagacacaac agagcgcaca tggtggccac gctcctcaga ttaaccttta 300
tcctccctga tgagacctgt tgtctttacc tggagcactc tgcactcaac acaatatgga 360
ctccaaaccg aaacaatgtt aaccttttct tccactcact ttgagataag gctacacaag 420
tttttggttg tgggctaaag ggatagggtt aaagcggtgc cctgacctcc tggtgatcta 480
tccaccaaaa aacatccaat ttacacctaa acgctcttgc aagacaactc aatgtccgtg 540
gtaaaacaag tgtgattttc caagtcaagt ttagcattgg tcgggggtac acatatgcaa 600
aacaaagcag aacaattggt ttgagattat ttgtggcaac actttatgcc aaaccatgtt 660
atctatcaaa agaaacaaag tctttgttgc tttaatgagc atcctaaatg ttcactttac 720
tttcccatag caactacatc acaaccctgc aatcaaggag aaggacagag agatagcgag 780
agagggtgag gagaggaagg gatcgggttt ctcagtaccc taatcctgga tttggaaacg 840
ggatgaggag aacgcagcta aggacaagca caagtaataa cagcactgac atgggtttgg 900
taggtggggg tgagcagctt gatgggaaat agggggcctc ataggtcgag agaggggtgg 960
ttagttgtag gtgggtggga tataaatacc tgcagtagac aagggctgca aattgctgag 1020
ggtatgacag acactggtta cctgcatcta taatagagaa aaagagacag ggatatgcat 1080
tgcagaggcc cagtagtata ccagtggtag taacttgaac ctgaagctca tcattattca 1140
tctctgggag tcttgactga gggtgcagat gtgcctaaaa atgggagaat tctagctgaa 1200
gtgctgacag tcttttctct ttgagaaaaa aggtaactta tcacagtttc ctacctgaat 1260
attcccaagt gactgaagtg agaactacgc ttgactgagc cagggaaaaa aggacaagaa 1320
aagaagacaa taccagaggt gaaagaagac aagacgcagc agggagaaag acaaggcaga 1380
acaagagaag gccaaagaag acgagacaga gacagaaggc gagataaagt aagactaaac 1440
acaagataca agaaaggaag gcgaggaaac agatatcaag agggcaagac aagaaaagac 1500
agaggacaag gaaagcaaca atgggagaca agaccaaata aagcaagaga ggaaagaaaa 1560
ggaaccagtt aaaggatcac gtcaaccttc agtgtacgat aaggaccatc cgagaggggc 1620
ctgagaaga 1629
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
gcagagccca agacaaacac 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
atgaggattg gcaagggtga gtct 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
gataaagtaa gactaaacac aagc 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
cattcttctc aggccccgct 20
Claims (7)
1.一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，包括以下步骤：检测大口黑鲈亲本中的SEQ ID NO:1所示的序列，选择序列如SEQ ID NO.1所示的纯合体作为亲本。
2.根据权利要求1所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，包括如下步骤：
从待测亲本中剪取鳍条样品，提取DNA；
以提取得到的DNA为模板，
P1：5’-GCAGAGCCCAAGACAAACAC-3’ （SEQ ID NO.2）
P2：5’-ATGAGGATTGGCAAGGGTGAGTCT-3’ （SEQ ID NO.3）
为引物，进行初次PCR扩增，得到初次PCR产物；
以初次PCR产物为模板，
P3：5’-GATAAAGTAAGACTAAACACAAGC-3’ （SEQ ID NO.4）
P4：5’-CATTCTTCTCAGGCCCCGCT-3’ （SEQ ID NO.5）
为引物，进行二次PCR扩增 ，得到二次PCR产物；
对二次PCR产物进行分析，确定待测亲本是否为含SEQ ID NO.1所示序列的纯合体。
3.根据权利要求2所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于：使用内切酶BsrBⅠ对二次PCR产物进行单酶切，之后对酶切产物进行电泳分析，根据电泳产物是否存在210bp条带来确定待测亲本是否为含SEQ ID NO.1所示序列的纯合体。
4.根据权利要求2所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于：初次PCR扩增的反应体系为：
ddH2O： 14.8μL；
10×buffer ： 2.0 μL；
MgCl2（25 mmol/L）： 0.8 μL；
dNTP（10 μmol/L）： 0.4 μL；
上下游引物（20 μmol/L）各： 0.4 μL；
DNA模板 1.0 μL；
Taq酶（5U/μL） 0.2 μL。
5.根据权利要求2或4所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于：初次PCR扩增的程序为：94℃预变性 4 min；94℃变性30秒，53℃退火90秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸 10 min。
6.根据权利要求2所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于：二次PCR扩增的反应体系为：
ddH2O： 14.8μL，
10×buffer ： 2.0 μL，
MgCl2（25 mmol/L）： 0.8 μL；
dNTP（10 μmol/L）： 0.4 μL；
上下游引物（20 μmol/L）各： 0.4 μL；
初次PCR扩增产物： 1.0 μL；
Taq酶（5U/μL） 0.2 μL。
7.根据权利要求2或6所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于：二次PCR扩增的程序为：94℃预变性 4 min；94℃变性30秒，50℃退火15秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸 10 min。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121114 Termination date: 20140525 |