CN103131769A

CN103131769A - 一种鉴定卵形鲳鲹的分子生物学方法

Info

Publication number: CN103131769A
Application number: CN201110397476XA
Authority: CN
Inventors: 袁万安; 于晓军; 游翠红
Original assignee: Shantou University Medical College
Current assignee: Shantou University Medical College
Priority date: 2011-12-02
Filing date: 2011-12-02
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明涉及一种鉴定卵形鲳鲹的分子生物学方法，该方法的主要步骤为：设计鲈形目鱼类的通用引物对；用通用引物对对常见珍稀鲈形目鱼类的DNA样本进行扩增测序；依据测序结果选出每种常见珍稀鲈形目鱼类独有的DNA片段；从该DNA片段中筛选出卵形鲳鲹的一条特异引物；用通用引物对中的一条引物与卵形鲳鲹的特异引物配对构成卵形鲳鲹的特异引物对；用该引物对对常见珍稀鲈形目鱼类的样本进行扩增；依据产物的电泳条带得到卵形鲳鲹的鉴定标准电泳条带；将通用引物对和卵形鲳鲹的一条特异引物相混合，构成混合引物；采用混合引物对需要鉴别的鱼类DNA样本进行扩增；依据产物的电泳条带与鉴定标准电泳条带比对，得到样本的种属鉴别结果。

Description

一种鉴定卵形鲳鲹的分子生物学方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定常见珍稀鲈形目鱼类的方法，特别涉及一种鉴定卵形鲳鲹的分子生物学方法。

背景技术

保护生物多样性，就是保护人类自己。由于水体生态环境的特殊性和大多数水产动物一直是人们捕捉的对象，鱼类生物多样性比陆生动物多样性显得更为脆弱，承受的压力更大。保护好鱼类种质资源，就是保护人类生存所必须的水产动物蛋白的生产源泉。鱼类资源是一种可更新的资源，只要利用得当，就可取之不尽，经久不衰，但如果酷捕滥捕，也可发生资源枯竭或个体变小、质量降低。捕捞并不是一个消极因素，只要捕捞合理，它可使鱼类种群产生最大的生产量，人们可获得最大持续量。全世界约有10亿人以鱼类为主要的蛋白质来源，但同农作物及畜禽类不同的是，目前，人类所消费的鱼类数量的80％以上依然来自天然捕捞产品。在全世界水产动物，如鱼类中，只有少数种类已用于养殖，极大多数种类的养殖潜力尚待评估。据初步统计，仅中国，由于工农业生产的迅猛发展以及生活水平提高后对水产品需求的剧增，水域生态系统处于持续增长的压力之下，处于濒危状态和受到严重威胁的鱼类有97种。

由于鱼类分布范围广泛，地理差异，生态环境的不同，使得各个地区的种类不同。由于人们的生活水平的提高，对鱼产品的需求猛增，于是产生了对鱼类的过渡捕捞，乱捕乱捞时有发生，再加上人们为了满足各种需要而对鱼类生态环境造成的破坏，使许多鱼种濒临灭绝。虽然我们采取了一些措施，例如每年设立禁鱼期，发布鱼类保护白皮书，但由于没有强有力的执法队伍，主要是缺乏快速、准确、经济、易于操作的鱼类鉴别方法，所以远远达不到预期目的。

目前，常用的鱼类鉴别方法主要是沿用传统的形态学鉴别法，根据鱼体各部位的形态特征，步骤繁多、操作繁琐、工作量大、专业性强。其致命的弱点是要求鱼体结构完整，各个部位特征发育完全，肉眼可以观察鉴别。这在幼小鱼体、鱼体破碎或腐败等情况下，难以进行鉴定，易于出错。近年来国内外许多实验室开始采用线粒体DNA分型、限制性长度多态性、同工酶电泳、随机引物扩增多态性(RAPD)技术进行鱼类鉴别，但这些方便普遍同样具有繁琐费时、费力、费钱，不利于操作，可重复性差，误差大等弊端。

发明内容

本发明的目的是提供一种耗费时间少、易于实验室操作、方便直观的鉴定常见珍稀鲈形目类中卵形鲳鲹的分子生物学方法。

该方法包括两大步骤：(1)确定卵形鲳鲹的特异引物；(2)卵形鲳鲹种类的鉴定。

步骤(1)又包括下面几个步骤：

1.1设计并筛选出一对鲈形目鱼类的核糖体5.8SrRNA和28SrRNA基因间的转录间隔子DNA片段的特异引物对作为鲈形目鱼类通用引物对，该引物对为：正向引物5′-gtcgatgaagaacgcagcta-3′，反向引物5′-gtcttctttccccgctgatt-3′；

1.2用步骤1.1得到的通用引物对，对鲈形目中常见珍稀鱼类的DNA模板样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

1.3将步骤1.2得到的常见珍稀鲈形目鱼类的PCR扩增产物进行克隆测序，根据测序结果选出每种常见珍稀鲈形目鱼类与其它常见珍稀鲈形目鱼类有差异的DNA片段；

1.4从步骤1.3中所选出DNA片段区域内，为卵形鲳鲹设计并筛选出一条特异引物，该特异引物为：5′-tatcccggtaccggtctcga-3′；

1.5用步骤1.1所得到的鱼类通用引物对中的一条引物与步骤1.4得到的卵形鲳鲹的特异引物配对，构成卵形鲳鲹的特异引物对；

1.6用步骤1.5所得到的卵形鲳鲹的特异引物对对鲈形目中常见珍稀鱼类的DNA模板样本进行PCR扩增；

1.7将步骤1.6所得到的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，从卵形鲳鲹的DNA模板样本中扩增得到的产物电泳后能得到显著的条带，而对其它常见珍稀鲈形目鱼类的DNA模板样本扩增产物电泳后则没有明显的条带产生，从而得到卵形鲳鲹的鉴定标准电泳条带。

步骤(2)又包括下面几个步骤：

2.1将步骤1.1中所得的通用引物对和步骤1.4中得到的卵形鲳鲹的特异引物相混合，构成混合引物；

2.2采用步骤2.1所得到的混合引物，对需要鉴别的鱼类DNA样本进行PCR扩增；

2.3将步骤2.2所得到的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，如需要鉴别的鱼类为卵形鲳鲹，则电泳结果会得到两条条带，一条是通用引物扩增产物，一条是卵形鲳鲹特异引物扩增产物；而其它鲈形目鱼类样本只有一条由通用引物对扩增产物的带，非鲈形目鱼类样本则没有电泳条带。

在所述步骤1.2中，对鲈形目中常见的珍稀鱼类的DNA模板分别进行PCR扩增时，鲈形目中常见的珍稀鱼类是指：短尾大眼鲷、真鲷、平鲷、黑鲷、黄鳍鲷、银鲳、卵形鲳鲹、日本金线鱼、金线鱼、花鲈、鳜鱼、大黄鱼、赤点石斑鱼、细鳞三梭鱼、尖吻鲈、发光鲷、长尾大眼鲷、军曹鱼、蓝圆鲹、乌鲳、短体银鲈等。

在所述步骤1.2、1.6和2.2中，所说的鱼类的DNA样本可以按以下常规方法进行提取：a、取鱼类新鲜组织，如鱼的肌肉、鱼鳞、鱼鳍、鱼卵、鱼血、鱼类粘液等，置于1.5ml的离心管消化过夜，用酚-氯法提取DNA；b、鱼类烘干或晒干制品，鱼类罐头制品，可以直接取样，同新鲜组织一样提取DNA；c、对于用95％酒精保存的鱼类组织样本，需用双蒸水浸泡过夜，再用酚-氯法提取DNA。

在所述步骤1.2、1.6和2.2中，对鱼类DNA样本进行PCR扩增时，PCR反应体系中的各种成份及其浓度如下：DNA样本(3μl)，DDH₂O(22.0μl)，dNTP(200μM)，10×缓冲液(3.6μl)，市售Taq酶(3U)，MgCl₂(2.25mM)，其中各类引物的添加量均为40nM。整个复合扩增循环参数如下：94℃预变性6分钟，94℃变性30秒，64℃复性60秒，72℃延伸60秒，循环次数34次；72℃延伸10分钟。

在所述步骤1.7和2.3中进行琼脂糖凝胶电泳时，将样本扩增产物3μl、分子量马克2μl以及凝胶载样缓冲液2μl加入到10ml的2％的琼脂糖凝胶溶液(每100ml琼脂糖凝胶溶液中加入10u的11‰的溴乙淀)处理30-40分钟。

本发明所述的一种鉴别卵形鲳鲹的分子生物学方法，利用鲈形目鱼类编码rRNA基因序列的保守性以及转录间隔子种间的变异，设计出通用引物和种属特异引物，最终建立了一种快速、准确、经济、直观、易于操作的鉴别方法。其中，确定卵形鲳鲹特异引物的操作只需在前期工作中进行并得到其电泳鉴别标准即可，在实际检测过程中，只需进行鱼类DNA样本的鉴定操作。

本方法的最大优点是能够对采用鱼类形态学等其它方法无法鉴别的鱼类卵子、鱼类粘液或者鱼类的分割样本进行有效并快速地加以鉴别。同时，本方法的样本需要量小，通过一片鱼鳞、一滴粘液或者是粘液斑痕就能确定鱼类种属。这种检测能够帮助实现对鱼类产卵场准确定位，迅速统计鱼类种群的大小。本方法还为打击非法捕捞、非法经营、非法走私提供了有力的技术保障。此外，对那些鱼类分类不是很擅长的非鱼类分类专业人员来说，本方法也极具实用价值。

本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。

具体实施方式

筛选一对鲈形目鱼类的核糖体5.8SrRNA和28SrRNA基因间的转录间隔子DNA片段的特异引物对，作为鲈形目鱼类通用引物对，该引物对为：正向引物：5′-gtcgatgaagaacgcagcta-3′；反向引物：5′-gtcttctttccccgctgatt-3′-。

取鲈形目中常见珍稀鱼类短尾大眼鲷、真鲷、平鲷、黑鲷、黄鳍鲷、银鲳、卵形鲳鲹、日本金线鱼、金线鱼、花鲈、鳜鱼、大黄鱼、赤点石斑鱼、细鳞三梭鱼、尖吻鲈、发光鲷、长尾大眼鲷、军曹鱼、蓝圆鲹、乌鲳、短体银鲈等鱼的新鲜肌肉3mg，消化过夜，用酚-氯法提取，酒精沉淀，自然风干，双蒸水溶解保存在-20℃备用。

采用前述筛选出来的通用引物对，对制备得到的各种鲈形目常见珍稀鱼类的DNA模板样本进行PCR扩增。PCR反应体系中的各种成份及其浓度如下：DNA样本(3μl)，DDH₂O(22.0μl)，dNTP(200μM)，10×缓冲液(3.6μl)，市售Taq酶(3U)，MgCl₂(2.25mM)，其中通用引物对的添加量分别为40nM。整个复合扩增循环参数如下：94℃预变性6分钟，94℃变性30秒，64℃复性60秒，72℃延伸60秒，循环次数34次；72℃延伸10分钟。扩增完毕后，将PCR扩增产物进行克隆测序，根据测序结果选出各种常见珍稀鲈形目鱼类与其它常见珍稀鲈形目鱼类有差异的DNA片段，从所选出DNA片段区域内，为卵形鲳鲹设计并筛选出一条特异引物，该特异引物为：5′-tatcccggtaccggtctcga-3′。

用鲈形目鱼类通用引物对中的一条引物5′-gtcgatgaagaacgcagcta-3′分别与卵形鲳鲹的特异引物5′-tatcccggtaccggtctcga-3′配对构成卵形鲳鲹的特异引物对，用该特异引物对对鲈形目中常见珍稀鱼类的DNA模板样本进行PCR扩增，PCR反应体系中的各种成份及其浓度如下：DNA样本(3μl)，DDH₂O(22.0μl)，dNTP(200μM)，10×缓冲液(3.6μl)，市售Taq酶(3U)，MgCl₂(2.25mM)，其中通用引物和特异引物的添加量均为40nM。整个复合扩增循环参数如下：94℃预变性6分钟，94℃变性30秒，64℃复性60秒，72℃延伸60秒，循环次数34次；72℃延伸10分钟。该特异性引物能从其相应的卵形鲳鲹的DNA模板样本中扩增出产物并得到显著的条带，而对其它鲈形目鱼类的DNA扩增反应结果则没有明显的条带产生，从而得到卵形鲳鲹的鉴定标准电泳条带。

将前述通用引物对和卵形鲳鲹的一条特异引物相混合，构成混合引物，用混合引物对需要鉴别的鱼类DNA样本进行PCR扩增，PCR反应体系中的各种成份及其浓度如下：DNA样本(3μl)，DDH₂O(22.0μl)，dNTP(200μM)，10×缓冲液(3.6μl)，市售Taq酶(3U)，MgCl₂(2.25mM)，其中各类引物的添加量均为40nM。整个复合扩增循环参数如下：94℃预变性6分钟，94℃变性30秒，64℃复性60秒，72℃延伸60秒，循环次数34次；7℃延伸10分钟。

将得到的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，将样本扩增产物3μl、分子量马克2μl以及凝胶载样缓冲液2μl加入到10ml的2％的琼脂糖凝胶溶液(每100ml琼脂糖凝胶溶液中加入10u的11‰的溴乙淀)处理30-40分钟。如需要鉴别的鱼类为卵形鲳鲹，则电泳结果会得到两条条带，一条是鲈形目鱼类通用引物对的扩增产物，一条是种属特异引物的扩增产物；如鉴别的样本为其它鲈形目鱼类样本则只有一条由通用引物对扩增产物的电泳条带，非鲈形目鱼类样本没有电泳条带。

Claims

1.一种鉴定卵形鲳鲹的分子生物学方法，其特征在于它包括两大步骤：(1)确定卵形鲳鲹的特异引物；(2)卵形鲳鲹种类的鉴定。

步骤(1)又包括下面几个步骤：

步骤(2)又包括下面几个步骤：

2.依据权利要求1中所述的一种鉴定卵形鲳鲹的分子生物学方法，其特征在于在所述步骤1.2中，对鲈形目中常见的珍稀鱼类的DNA模板分别进行PCR扩增时，鲈形目中常见的珍稀鱼类是指：短尾大眼鲷、真鲷、平鲷、黑鲷、黄鳍鲷、银鲳、卵形鲳鲹、日本金线鱼、金线鱼、花鲈、鳜鱼、大黄鱼、赤点石斑鱼、细鳞三梭鱼、尖吻鲈、发光鲷、长尾大眼鲷、军曹鱼、蓝圆鲹、乌鲳、短体银鲈等。

3.依据权利要求1中所述的一种鉴定卵形鲳鲹的分子生物学方法，其特征在于步骤1.2、1.6和2.2中，提取鱼类样本的DNA时，可以按以下常规方法进行提取：a、取鱼类新鲜组织，如鱼的肌肉、鱼鳞、鱼鳍、鱼卵、鱼血、鱼类粘液等，置于1.5ml的离心管消化过夜，用酚-氯法提取DNA；b、鱼类烘干或晒干制品，鱼类罐头制品，可以直接取样，同新鲜组织一样提取DNA；c、对于用95％酒精保存的鱼类组织样本，需用双蒸水浸泡过夜，再用酚-氯法提取DNA。

4.依据权利要求1中所述的一种鉴定卵形鲳鲹的分子生物学方法，其特征在于在步骤1.2、1.6和2.2中，对鱼类DNA样本进行PCR扩增时，PCR反应体系中的各种成份及其浓度如下：DNA样本(3μl)，DDH₂O(22.0μl)，dNTP(200μM)，10×缓冲液(3.6μl)，市售Taq酶(3U)，MgCl₂(2.25mM)，其中各类引物的添加量均为40nM。整个复合扩增循环参数如下：94℃预变性6分钟，94℃变性30秒，64℃复性60秒，72℃延伸60秒，循环次数34次；72℃延伸10分钟。

5.依据权利要求1中所述的一种鉴定卵形鲳鲹的分子生物学方法，其特征在于在步骤1.7和2.3中，进行琼脂糖凝胶时，将样本扩增产物3μl、分子量马克2μl以及凝胶载样缓冲液2μl加入到10ml的2％的琼脂糖凝胶溶液(每100ml琼脂糖凝胶溶液中加入10u的11‰的溴乙淀)处理30-40分钟。