CN103789301B

CN103789301B - 三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物及筛选方法

Info

Publication number: CN103789301B
Application number: CN201310224738.1A
Authority: CN
Inventors: 王日昕; 徐田军; 任丽平
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2033-06-05
Also published as: CN103789301A

Abstract

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物及筛选方法，所述微卫星标记的特异引物的核苷酸序列分别为SEQ？ID？NO.1至SEQ？ID？NO.6所示。本发明建立了一种筛选方式，可方便快捷的用于做三疣梭子蟹种质资源和遗传多样性的分析，进一步用于三疣梭子蟹的群体遗传学、种质资源鉴定、遗传图谱的构建和分子育种等。

Description

三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物及筛选方法

技术领域

本发明属于分子标记技术与应用领域，具体涉及一组三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）微卫星标记的特异性引物及筛选方法，可用于三疣梭子蟹多态性检测和遗传结构分析等领域。

背景技术

三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus），属于节肢动物门（Arthropoda），软甲纲（Malacostraca），十足目（Decapoda），梭子蟹科（Portunidae），梭子蟹属（Portunus）。俗名梭子蟹、海蟹或大蟹。三疣梭子蟹广泛分布在中国南北沿海，肉多，味鲜美，脂膏肥满，营养丰富而且生长迅速，养殖利润丰厚，是大型海洋经济蟹类，是沿海重要的渔业资源。开展三疣梭子蟹种质鉴定和遗传结构分析工作，对于三疣梭子蟹的养殖亲本选择、优良品种和家系培育、种资资源的保护具有重要的应用价值。

微卫星标记（Microsatellite）是一种新兴的DNA标记技术，DNA标记技术能够用来作为指纹鉴定或者区分基因组中某种差异特征的DNA段。在基因组水平上，由于DNA核苷酸碱基的突变造成不同的生物个体之间存在着一定的差异，进而造成许多基因组DNA序列的多态性，也就证明了这些序列在不同的个体之间是有差别的。微卫星标记的实质就是基因组中大量存在的短串联重复序列。可以通过已得到的基因序列寻找微卫星序列，然后在微卫星序列的上下游设计特异性引物，这些特异性微卫星引物可以通过PCR技术扩增出微卫星标记条带，通过电泳成像技术对这些条带进行分析。以这些重复序列作为遗传标记的工具，可以进行遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传连锁图谱的构建等一系列工作。

现在微卫星分子已经广泛应用于海洋生物的群体遗传多态性分析、系谱认证、遗传图谱构建等工作中。鉴于微卫星分子标记技术在遗传结构分析中的广泛应用，开发三疣梭子蟹微卫星分子标记具有重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明旨在提供三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物，以及利用该特异性引物进行三疣梭子蟹微卫星标记筛选的方法。

为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：

发明人首先提供了三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物，分别为：

Potr-4:F:ATGTCCATCGCTTCTAATCA(SEQIDNO.1)，

R:CGACTCTCTCTCTCTCTCCTGT(SEQIDNO.2)；

Potr-20:F:CGCCTCTCTCTCTCTCTCAG(SEQIDNO.3)，

R:AAAGGTTATGAAGGGCAGAATC(SEQIDNO.4）；

Potr-28:F:CGGAAACTAACCAACTTACCTAC(SEQIDNO.5)，

R:AGAAAGATAGTGACTTGGTAGCA(SEQIDNO.6）。

采集三疣梭子蟹活体，提取基因组DNA，通过5′锚定PCR技术获得片段大小在300-800bp的含有微卫星重复序列的基因片段，将获得的目的基因片段与载体进行连接反应后转入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，进行克隆后测序。利用TandemRepeatFinder(TRF)软件，参数设计如下：按A、T、G、C排列组合的重复单元为2-6个核苷酸，且其最低重复次数分别为6、5、4、3、3，微卫星核心序列的最小长度为12bp，以此标准查找分析所得的序列，获得含有微卫星重复的序列。

利用引物设计软件PrimerPremier5.0在微卫星两端的侧翼序列设计特异性引物。对于三疣梭子蟹微含有微卫星的片段进行引物设计，其引物设计参数为：(1)引物长度为18-25bp；(2)GC含量大于40%；(3)退火温度大于40℃，且正反引物退火温度相差不超过5℃；(4)预期的PCR产物长度为100-300bp；(5)尽量避免二级结构。

本发明还提供了一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，首先使用5′锚定PCR技术扩增基因组DNA获得片段大小在300-800bp之间的DNA片段，将得到的DNA片段与载体连接后转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞内，进行克隆后测序；利用TandemRepeatFinder(TRF)软件，参数设计如下：按A、T、G、C排列组合的重复单元为2-6个核苷酸，且其最低重复次数分别为7、5、4、3、3，微卫星核心序列的最小长度为14bp，以此标准查找分析所得的序列，获得含有微卫星重复的序列；然后再根据微卫星标记重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物使之成为可用于检测每个个体微卫星标记的特异性引物；最后对利用这些特异性引物检测得到的微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到多态性良好的微卫星特异分子标记，所筛选到的微卫星标记的特异性引物分别为：

Potr-4:F:ATGTCCATCGCTTCTAATCA(SEQIDNO.1)，

R:CGACTCTCTCTCTCTCTCCTGT(SEQIDNO.2)；

Potr-20:F:CGCCTCTCTCTCTCTCTCAG(SEQIDNO.3)，

R:AAAGGTTATGAAGGGCAGAATC(SEQIDNO.4）；

Potr-28:F:CGGAAACTAACCAACTTACCTAC(SEQIDNO.5)，

R:AGAAAGATAGTGACTTGGTAGCA(SEQIDNO.6）。

作为优选方案，根据本发明所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，其中，所述的特异性引物对三疣梭子蟹进行PCR扩增，其中：扩增体系为：总体积20μl，其中含有1×PCRbuffer，0.2mMdNTP，1UTaq聚合酶，模板量为50-100ng；PCR反应程序为：95℃变性5分钟之后进入循环，95℃变性30秒，退火温度退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环，最终72℃延伸5分钟，各个引物的最佳退火温度在预期退火温度上下10℃之间进行优化，直至预期产物清晰单一。

作为优选方案，根据本发明所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，其中，所述的特异性引物对三疣梭子蟹进行PCR扩增，PCR产物的检测方法如下：扩增得到的产物在用1.5%的琼脂糖凝胶电泳(电压5-10V/cm，15-20分钟)检测扩增特异性后，再用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，然后再用硝酸银染色方法进行检测，分析确定不同个体的微卫星标记的基因型。作为更优选，所述的变性聚丙烯凝胶电泳主要工艺参数为：恒压1000-1500V、功率200W，电泳1-2个小时。

本发明中，筛选获得重复性好、稳定的多态丰富的微卫星标记，其步骤是根据上述筛选方法利用上述特异性引物在至少两个个体中检测到微卫星标记的不同基因型，继续用大量个体检测其重复性和稳定性，同时得到大量个体微卫星标记的基因型信息。

本发明的优点是：

本发明可方便快捷的用于做三疣梭子蟹种质资源和遗传多样性的分析，进一步用于三疣梭子蟹的群体遗传学、种质资源鉴定、遗传图谱的构建和分子育种等。

附图说明

图1是三疣梭子蟹微卫星标记Potr-4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；

图2是三疣梭子蟹微卫星标记Potr-20变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；

图3是三疣梭子蟹微卫星标记Potr-28变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。

主要材料、试剂和仪器设备：眼科剪，镊子，1.5ml离心管，微量移液器、微量移液器枪头。脱氧核糖核苷酸dNTP，热聚合Taq酶，小型离心机（Qspin^TM，BAYGENE），涡旋振荡器（QL-866型，QILINEBEIER），pH计(MettlerToledo320PHMeter)、高压蒸气灭菌锅（SANYO）、电泳仪（DYY-6C型，北京六一）、电泳仪（DYY-12C型，北京六一）、DNA序列分析电泳仪（DYCZ-20C型，北京六一）、调速多用振荡器（HY-2型，上海国华）、水浴锅（上海精宏）、凝胶成像系统(Bio-RadGD2000)、PCR仪(ABIVeriti96wellThermalCycler)。

实验样本三疣梭子蟹采集于浙江省海洋水产研究所。

本发明实施例所用的常规药品苯酚氯仿抽提液（25:24:1），甲醛，氢氧化钠（分析纯），硝酸银，氯化钠（分析纯），尿素，丙烯酰胺，甲叉，Tris-碱，硼酸，乙二胺四乙酸（EDTA），过硫酸铵，十二烷基硫酸钠（SDS），无水乙醇购自国药集团琼脂糖，溴化乙锭，去离子甲酰胺，TEMED，蛋白酶K等购自Takara公司，脱氧核糖核苷酸dNTP，热聚合Taq酶购自TIANGEN公司，质粒文库测序由华大基因公司完成，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等作者的分子克隆实验室手册（NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989）中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1

1、微卫星位点的获得

采集三疣梭子蟹活体提取其基因组DNA，通过5′锚定PCR技术，将基因组DNA切割成含有微卫星序列的在300-800bp之间的小片段，将这些小片段进行纯化，然后将纯化后的小片段与载体连接后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行克隆测序。

2、微卫星序列的筛选

利用微卫星检测软件TandemRepeatFinder(TRF)对步骤1得到的序列进行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复次数依次大于7，5，4，3，3次的微卫星片段进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的序列。利用引物设计软件PrimerPremier5.0在微卫星两端的侧翼序列设计特异性引物。

3、微卫星标记引物的设计

在微卫星重复区的侧翼序列利用软件PrimerPremier5.0设计引物，引物要求满足以下条件：（1）引物长度为18-25bp；（2）GC含量大于40%；（3）退火温度大于40℃，且正反引物退火温度相差不超过5℃；（4）预期的PCR产物长度为100-300bp；（5）尽量避免二级结构。

4、引物的优化

各引物的最佳退火温度在预期退火温度上下浮动10℃之间进行优化，直至预期目的产物能被清晰稳定的扩增。PCR扩增的反应程序为：95℃变性5分钟之后进入循环，95℃变性30秒，退火温度退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环，最终72℃延伸5分钟。反应体系为：总体积20μl，其中含有1×PCRbuffer，0.2μMdNTP，1UTaq聚合酶，模板量为50-100ng。模板是随机的两个三疣梭子蟹个体的DNA混合池。扩增得到的产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选择单一或杂带少、特异性产物量较高的温度作为最佳退火温度。

5、微卫星位点的确定

根据步骤4中优化的退火温度选取30个个体检测这些微卫星标记的多态性。PCR反应程序为：95℃变性5分钟之后进入循环，95℃变性30秒，退火温度退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环，最终72℃延伸5分钟。反应体系为：总体积20μl，其中含有1×PCRbuffer，0.2μMdNTP，1UTaq聚合酶，模板量为50-100ng。PCR扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒压1000-1500V，功率200W，电泳1-2个小时，硝酸银染色系统进行检测，干燥后分析确定多态性，最后筛选出3个三疣梭子蟹微卫星标记，这些标记的具体信息如表1。

表1.筛选所得的3个三疣梭子蟹的微卫星标记

实施例2

1、提取三疣梭子蟹的DNA

具体步骤如下：(1)剪取少量三疣梭子蟹肌肉组织30-100mg，加入300μl裂解液（含0.2MNaCl，0.02MTris-HCl(pH8.0)，1%SDS和0.05MEDTA），剪刀剪碎后加入终浓度20mg/ml的蛋白酶K，55℃水浴裂解数小时至溶液清澈；(2)完全裂解后加300μl苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）反复颠倒抽提10-15分钟，10000-12000转/分钟离心10分钟，吸取上清；(3)重复步骤（2）3-4次至上清澄清；(4)加两倍体积冰乙醇沉淀DNA，10000-12000转/分钟离心10分钟，弃上清；(5)75%乙醇洗涤沉淀1-2次，晾干，使乙醇完全挥发，用50-100μlTE或灭菌的去离子水溶解DNA，1%的琼脂糖凝胶电泳检测后于-20℃保存备用。

2、PCR扩增

各微卫星标记特异性引物的最佳退火温度如表1所示，PCR反应体系为：总体积20μl，其中含有1×PCRbuffer（内含1.5mMMg²⁺），0.2μMdNTP，1UTaq聚合酶，模板量为50-100ng。反应程序为：95℃变性5分钟之后进入循环，95℃变性30秒，退火温度退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环，最终72℃延伸5分钟。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳-EB染色系统进行检测特异性。

3、电泳检测

经琼脂糖凝胶电泳检测(电压5-10V/cm，15-20分钟)，特异扩增的PCR产物加入等体积变性剂（含98%去离子甲酰胺，10mMEDTA，0.25%溴酚蓝和0.25%二甲苯青），95℃变性8分钟后快速冷却，用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒压1000-1500V，功率200W，电泳1-2个小时后进行染色和显色，首先用70%的乙醇固定10分钟，水洗10分钟，硝酸银溶液染色30分钟，水洗10秒，20%的NaOH显色液显色10分钟，水洗10分钟。

干燥后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图1至图3所示。

尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。

SEQUENCELISTING

<110>浙江海洋学院

<120>三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物及筛选方法

<130>Z130849

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgtccatcgcttctaatca20

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cgactctctctctctctcctgt22

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgcctctctctctctctcag20

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aaaggttatgaagggcagaatc22

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cggaaactaaccaacttacctac23

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

agaaagatagtgacttggtagca23

Claims

1.三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物，其特征是所述的特异性引物分别为：

Potr-4:F:ATGTCCATCGCTTCTAATCA(SEQIDNO.1)，

R:CGACTCTCTCTCTCTCTCCTGT(SEQIDNO.2)；

Potr-20:F:CGCCTCTCTCTCTCTCTCAG(SEQIDNO.3)，

R:AAAGGTTATGAAGGGCAGAATC(SEQIDNO.4）；

Potr-28:F:CGGAAACTAACCAACTTACCTAC(SEQIDNO.5)，

R:AGAAAGATAGTGACTTGGTAGCA(SEQIDNO.6）。

2.一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，其特征是首先使用5′锚定PCR技术扩增基因组DNA获得片段大小在300-800bp之间的DNA片段，将得到的DNA片段与载体连接后转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞内，进行克隆后测序；利用TandemRepeatFinder软件，参数设计如下：按A、T、G、C排列组合的重复单元为2-6个核苷酸，且其最低重复次数分别为7、5、4、3、3，微卫星核心序列的最小长度为14bp，以此标准查找分析所得的序列，获得含有微卫星重复的序列；然后再根据微卫星标记重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物使之成为可用于检测每个个体微卫星标记的特异性引物；最后对利用这些特异性引物检测得到的微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到多态性良好的微卫星特异分子标记，所筛选到的微卫星标记的特异性引物分别为：

Potr-4:F:ATGTCCATCGCTTCTAATCA(SEQIDNO.1)，

R:CGACTCTCTCTCTCTCTCCTGT(SEQIDNO.2)；

Potr-20:F:CGCCTCTCTCTCTCTCTCAG(SEQIDNO.3)，

R:AAAGGTTATGAAGGGCAGAATC(SEQIDNO.4）；

Potr-28:F:CGGAAACTAACCAACTTACCTAC(SEQIDNO.5)，

R:AGAAAGATAGTGACTTGGTAGCA(SEQIDNO.6），

所述的特异性引物对三疣梭子蟹进行PCR扩增，其中：扩增体系为：总体积20μl，其中含有1×PCRbuffer，0.2μMdNTP，1UTaq聚合酶，模板量为50-100ng；PCR反应程序为：95°C变性5分钟之后进入循环，95°C变性30秒，退火温度退火30秒，72°C延伸30秒，进行30个循环，最终72°C延伸5分钟，各个引物的最佳退火温度在预期退火温度上下浮动10°C之间进行优化，直至预期产物清晰单一。

3.如权利要求2所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，其特征是所述的特异性引物对三疣梭子蟹进行PCR扩增，PCR产物的检测方法如下：扩增得到的产物在用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增特异性后，再用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后再用硝酸银染色方法进行检测，分析确定不同个体的微卫星标记的基因型。

4.如权利要求3所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，其特征是所述的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳主要工艺参数为：恒压1000-1500V、功率200W，电泳1-2个小时。

5.如权利要求3所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的筛选方法，其特征是筛选获得重复性好、稳定的多态丰富的微卫星标记，其步骤是根据权利要求3中要求的筛选方法利用权利要求1中的特异性引物在至少两个个体中检测到微卫星标记的不同基因型，继续用大量个体检测其重复性和稳定性，同时得到大量个体微卫星标记的基因型信息。