CN110484629B

CN110484629B - 一种与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记、其引物及应用

Info

Publication number: CN110484629B
Application number: CN201910704471.3A
Authority: CN
Inventors: 康现江; 段保华; 管越强; 穆淑梅; 姬新东; 李泽健; 李书琴; 李彦芹
Original assignee: Hebei University
Current assignee: Hebei University
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2039-07-31
Also published as: CN110484629A

Abstract

本发明提供了一种与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记、其引物及应用，微卫星标记包括微卫星标记ZL03、ZL05、ZL06、ZL08和NC07；本发明还提供了上述的微卫星标记或其引物在三疣梭子蟹生长性状分析以及三疣梭子蟹分子育种中的应用。本发明提供的微卫星标记的引物具有PCR扩增结果稳定的特点，其微卫星标记可以用于三疣梭子蟹生长性状分析，可以辅助三疣梭子蟹分子标记育种。

Description

一种与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记、其引物及应用

技术领域

本发明涉及三疣梭子蟹生物学遗传育种领域，具体地说是一种与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记、其引物及应用。

背景技术

SSR(Simple sequencerepeat)即简单序列重复，又称为微卫星DNA(microsatelliteDNA)，在真核生物基因组中，SSR仅由几个核有酸(1-6个)组成重复单位，如((CT)n，(AC)n，(ACT)n(其中n为重复次数)等，重复次数10-20，同一类微卫星DNA可分布在整个基因组不同位置上，由于重复次数的不同，或重复程度的不完全，而形成每个座位的多态性。每类微卫星DNA两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据两端序列设计一对特异引物，扩增每个位点微卫星序列。

目前，SSR也是发展最快、应用最广的一类标记。SSR标记具有以下特点：①在真核生物基因组中广泛分布，大约每隔10-15kb就存在一个微卫星标记；②数量多，具有丰富的多态性；③具有多等位基因的特性，信息含量大；④呈共显性遗传，即能区分纯合子和杂合子；⑤等位基因的分离遵循孟德尔规律；⑥实验操作简单、结果稳定可靠；⑦基于PCR技术，可实现自动化检测；⑧具有连锁不平衡现象；⑨重复性较好。因此，微卫星标记技术目前已广泛地应用于生物DNA指纹图谱、种质资源的鉴定、遗传连锁图谱的构建、遗传多样性、等位基因变异和遗传关系及遗传结构等方面。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海洋经济蟹类，北起中国辽东半岛、南至广东沿海，以及日本、朝鲜、马来群岛、红海等海域均有分布。1981年三疣梭子蟹被列为我国海洋水产养殖对象。近年来由于过度捕捞和环境污染造成三疣梭子蟹野生资源减少，养殖过程中各种病害不断发生。目前，沿海地区工业污染导致水质变差，由此使三疣梭子蟹生存环境遭到破坏，优质亲本数量急剧减少，养殖面积大幅度下降。因此，开发针对分析三疣梭子蟹遗传结构的微卫星引物，采用分子遗传标记的手段分析三疣梭子蟹种质资源现状，研究其种群遗传学以及利用分子标记进行育种，这对了解三疣梭子蟹的遗传多样性和种群结构、有效保护三疣梭子蟹野生资源、开发良种以及保育原种，对生物多样性的保护和生物资源的可持续利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的就是提供一种与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记、其引物及应用，以提供一套三疣梭子蟹生长性状结构分析的微卫星引物，为三疣梭子蟹遗传多样性、种质资源现状的调查研究以及分子生物学育种提供依据。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记，所述三疣梭子蟹为渤海三疣梭子蟹，所述微卫星标记包括微卫星标记ZL03、ZL05、ZL06、ZL08和NC07；

所述微卫星标记ZL03与三疣梭子蟹的背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽、体厚和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.1所示；

所述微卫星标记ZL05与三疣梭子蟹的背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽、体厚和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.2所示；

所述微卫星标记ZL06与三疣梭子蟹的螯肢掌节长和螯肢长节长性状相关联，其序列如SEQ ID NO.3所示；

所述微卫星标记ZL08与三疣梭子蟹的背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽和体重性状相关联，其序列如SEQ ID NO.4所示；

所述微卫星标记NC07与三疣梭子蟹的背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽性状相关联，其序列如SEQ ID NO.5所示。

一种与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记的引物，所述三疣梭子蟹为渤海三疣梭子蟹，所述微卫星标记的引物包括5对微卫星引物，分别为：

ZL03F：序列如SEQ ID NO.6所示，ZL03R：序列如SEQ ID NO.7所示；

ZL05F：序列如SEQ ID NO.8所示，ZL05R：序列如SEQ ID NO.9所示；

ZL06F：序列如SEQ ID NO.10所示，ZL06R：序列如SEQ ID NO.11所示；

ZL08F：序列如SEQ ID NO.12所示，ZL08R：序列如SEQ ID NO.13所示；

NC07F：序列如SEQ ID NO.14所示，NC07R：序列如SEQ ID NO.15所示。

一种上述的微卫星标记或引物在三疣梭子蟹生长性状分析以及三疣梭子蟹分子育种中的应用。其采用的分析方法具体步骤包括：(a)提取待分析群体基因组DNA；(b)以所述DNA为模板，采用所述的微卫星标记引物进行微卫星标记检测：(c)进行生长性状相关分析。

在扩增待测样品时，若采用微卫星标记ZL03引物能够扩增BB(162bp，162bp)基因型，表明待测样品为与基因型BB相关联的背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽、体厚和体重均较优的三疣梭子蟹品系；若采用微卫星标记ZL05引物能够扩增AA(163bp，163bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA相关联的背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽、体厚和体重均较优的三疣梭子蟹品系；若采用微卫星标记ZL06引物能够扩增出AA(140bp，140bp)、AB(140bp，158bp)和BB(158bp，158bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB和BB相关联的前额宽、螯肢掌节长、螯肢长节长和体重均较优的三疣梭子蟹品系；若采用微卫星标记ZL08引物能够扩增出AA(120bp，120bp)、AB(120bp，128bp)和BB(128bp，128bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB和BB相关联的背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽和体重均较优三疣梭子蟹品系；若采用微卫星标记NC07引物能够扩增出AA(258bp，258bp)、AB(258bp，278bp)、AC(258bp，300bp)、BB(278bp，278bp)、BC(278bp，300bp)和CC(300bp，300bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB、AC、BB、BC和CC相关联的背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽和体重的均较优三疣梭子蟹品系。

本发明提供的微卫星标记的引物具有PCR扩增结果稳定的特点，其微卫星标记可以用于三疣梭子蟹生长性状分析，可以辅助三疣梭子蟹分子标记育种。

附图说明

图1～图5是本发明三疣梭子蟹形态参数测量部位示意图。

图6是ZL06的引物对60个三疣梭子蟹样本DNA扩增后的电泳图。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1三疣梭子蟹群体样本的来源以及生长性状表型值的测量

选取辽宁大连(DL)、辽宁葫芦岛(HLD)、河北秦皇岛(QHD)、河北黄骅养殖群体(HHYZ)、河北黄骅野生群体(HHYS)、山东东营((DY)、山东蓬莱(PL)的三疣梭子蟹鲜活样品各60只。分别对每个三疣梭子蟹样本称重和测量，测量指标包括背甲宽(BJK)、第八对棘背甲宽(BBK)、内背甲宽(NBK)、背甲底宽(BDK)、背甲长(BJC)、前额宽(QEK)、前额中间棘距离(QZJ)、前额侧棘距离(QCJ)、腹甲宽(FJK)、腹部宽(FBK)、第3步足长节长(3CC)、第4步足趾节长(4ZC)、第4步足趾节宽(4ZK)、大鳌可动指节长(KZC)、螯肢掌节长(AZC)、螯肢长节长(ACC)、螯肢掌节宽(AZK)、螯肢掌节厚(AZH)、体厚(TH)、体重(TZ)20个可量性状。三疣梭子蟹形态参数测量部位示意图如图1～图5所示。

实施例2三疣梭子蟹样本肌肉总DNA的提取

采用海洋动物基因组提取试剂盒提取肌肉总DNA，具体步骤如下：

(1)切取不多于30mg的组织材料，放入装有200μL GA缓冲液的离心管中，涡旋振荡15s。

(2)加入20μL Proteinase K(20mg/mL)溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。56℃放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内垦的水珠，再进行下一步骤。

(3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置l0min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(4)加人200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复操作步骤7。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

(11)DNA的质量检测：取2μL基因组总DNA用质量比浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，经EB染色、紫外凝胶成像系统成像后观察DNA是否降解以及是否有蛋白质残留；另外，将提取的DNA样品用Nano Drop 2000分光光度计测定其浓度，并以测得DNA浓度为参考，将基因组总DNA样品统一稀释为50ng/μL。

实施例3微卫星引物的开发

(1)三疣梭子蟹购自黄骅三疣梭子蟹原种场，在无菌条件下取其肌肉组织，提取肌肉组织总RNA，送生物公司进行转录组测序，获得转录组数据；利用MISA软件对组装得到的长度在l kb以上的unigenes进行SSR的鉴定，识别标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的精确SSR标记的最小重复数分别为9、6、5、4次，利用SSR Hunter l.3进行SSR标记的筛选，保证序列的前后侧翼有足够的长度用于设计引物。以筛选到的SSR使用Primer Permier 6进行引物设计；设计的主要参数设置为：引物长度18-25bp为最适长度，PCR产物片段长度范围90-400bp，最适退火温度为55-60℃；GC含量一般在40-60％之间，尽量避免二级结构出现。

(2)对所合成引物进行梯度PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳EB染色初步筛选，并确定每对引物的最适返火温度，选取能扩增出单一清晰条带的引物。

实施例4 SSR分子标记多态性的筛选

(1)随机选取实施例2得到的60个样本统一稀释后的基因组总DNA为模板，采用实施例3筛选出的引物对其进行PCR分型检测，其扩增体系和扩增条件如下所示，PCR扩增产物用质量比浓度为8％的聚丙烯酷肢凝胶分离，经银染染色，并记录扩增结果；通过与pBR322DNA/Msp I marker分子量标准对比估算扩增片段大小范围。

PCR扩增体系如下：

PCR反应程序如下：

(2)根据步骤(1)PCR分型检测结果及其位置确定基因型，利用Popgen32进行群体遗传分析，计算等位基因数(Number ofAllele，Na)、观测杂合度(ObservedHeterozygosity，Ho)和期望杂合度(Expected Heterozygosity，He)，用PIC-CALC软件对各微卫星位点的多态信息含量进行计算，结果见表1。

表1三疣梭子蟹微卫星标记及其扩增的相关信息

(3)各位点等位基因及其分布

实验样品共420只，位点19F检测到4个基因，位点Z30和位点Z191检测到3个等位基因，位点Z43和位点Z90检测到2个等位基因，各位点的等位基因及分布见表2。

表2微卫星的等位基因频率及分布

实施例5三疣梭子蟹生长性状显著相关的SSR分子标记在分子育种中的应用

(1)选取辽宁大连(DL)、辽宁葫芦岛(HLD)、河北秦皇岛(QHD)、河北黄骅养殖群体(HHYZ)、河北黄骅野生群体(HHYS)、山东东营((DY)、山东蓬莱(PL)的三疣梭子蟹鲜活样品各60只。分别对三疣梭子蟹进行称重和测量，测量指标有背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、前额侧棘距离、前额中间棘距离、前额宽、腹甲宽、腹部宽、第3步足长节长、第4步足趾节长、第4步足趾节宽、大鳌可动指节长、螯肢掌节厚、螯肢掌节长、螯肢掌节宽、螯肢长节长、体厚、体重20个可量性状。

(2)基因组DNA的提取：具体步骤同实施例2；

(3)利用分子标记ZL03、ZL05、ZL06、ZL08和NC07对所有7个三疣梭子蟹群体进行基因分型，部分结果如图6所示，图6为ZL06的引物对60个三疣梭子蟹样本DNA扩增后的电泳图。

(4)逐个分析标记时，剔除该位点基因型信息不全的样本，样本少于3的基因型缺少统计意义，一并去除。应用SPSS22软件，采用一般线性模型(General Linear Model，GLM)，以分于标记ZL03、ZL05、ZL06、ZL08和NC07在三疣梭子蟹中的基因分型为自变量，生长性状背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、前额侧棘距离、前额中间棘距离、前额宽、腹甲宽、腹部宽、第3步足长节长、第4步足趾节长、第4步足趾节宽、大鳌可动指节长、螯肢掌节厚、螯肢掌节长、螯肢掌节宽、螯肢长节长、体厚、体重为因变量，利用Duncan法进行标记不同基因型间的多重比较。结果如表3所示。结果表明：在位点NC07中，CD基因型个体的各性状均值显著大于其他基因型；CD基因型个体的背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、前额侧棘距离、腹甲宽、第3步足长节长、大鳌可动指节长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体重均值高于CC基因型，且基因型间差异显著。可认为等位基因D与这12个性状正相关。AA基因型个体的各性状显著大于AB和AC基因型，但基因型间差异不显著，推测等位基因A对各性状具有正效应。BC和BD基因型个体的背甲宽、第八对棘背甲宽、前额侧棘距离、腹甲宽、第3步足长节长、大鳌可动指节长、螯肢长节长、体高、体重均值显著高于BB基因型，但基因型间差异不显著，说明等位基因B对这9个性状具有负效应。

在位点Z30中，BB基因型个体各性状的均值都大于其他基因型个体，其中BB和AB基因型差异最大，且除第八对棘背甲宽性状外，其他各性状间差异性极显著，说明B基因对除第八对棘背甲宽之外的各性状具有正效应。

在位点Z43中，AB和AC基因型个体各性状的均值显著大于AA基因型个体，其中AB与AA基因型差异最大，各性状分别相差18.571mm、16.197mm、17.568mm、10.264mm、6.5mm、1.097mm、1.544mm、4.374mm、8.716mm、8.166mm、4.454mm、4.6mm、2.046mm、5.848mm、4.162mm、10.722mm、2.594mm、5.592mm、5.766mm、75.602g，且各性状间极显著相关；除螯肢掌节厚和螯肢掌节宽之外，BB基因型个体各性状的均值显著高于BC基因型个体，但性状间差异不显著；推测等位基因B对大多数性状具有正效应。Z43微卫星位点，由于其与各生长性状极显著相关，因此可以作为以生长选育为目标的有效标记。

在位点Z90中，AB基因型个体性状的均值显著大于AA基因型个体；BB基因型个体性状的均值显著大于BC基因型个体；但各性状间差异不显著，推测等位基因B与各性状正相关。

在位点Z191中，AA基因型个体的性状均值显著高于AB基因型个体，而AB基因型个体的性状均值显著高于BB基因型个体；说明AA基因对各性状起正面作用。BC基因型个体的前额宽和螯肢掌节长均值高于CC基因型个体，性状间差异显著，可以说明等位基因B对前额宽和螯肢掌节长具有正效应。

表3 5个微卫星位点不同基因型在不同表型中的多重比较

注：同一行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同一行不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

进行分子标记选择育种，若采用微卫星标记ZL03引物能够扩增BB(162bp，162bp)基因型，表明待测样品为与基因型BB相关联的背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽、体厚和体重均较优的三疣梭子蟹品系；若采用微卫星标记ZL05引物能够扩增AA(163bp，163bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA相关联的背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽、体厚和体重均较优的三疣梭子蟹品系；若采用微卫星标记ZL06引物能够扩增出AA(140bp，140bp)、AB(140bp，158bp)和BB(158bp，158bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB和BB相关联的前额宽、螯肢掌节长、螯肢长节长和体重均较优的三疣梭子蟹品系；若采用微卫星标记ZL08引物能够扩增出AA(120bp，120bp)、AB(120bp，128bp)和BB(128bp，128bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB和BB相关联的背甲宽、内背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲长、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽和体重均较优三疣梭子蟹品系；若采用微卫星标记NC07引物能够扩增出AA(258bp，258bp)、AB(258bp，278bp)、AC(258bp，300bp)、BB(278bp，278bp)、BC(278bp，300bp)和CC(300bp，300bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB、AC、BB、BC和CC相关联的背甲宽、第八对棘背甲宽、背甲底宽、腹甲宽、腹部宽和体重的均较优三疣梭子蟹品系。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北大学

<120> 一种与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记、其引物及应用

<130> 19.7.22

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 153

<212> DNA

<213> 三疣梭子蟹

<400> 1

tgtgcaccaa ctcactcgaa cacttcattt ccctcctctt tgtctgtcct aaaactgctt 60

cactgcttca gccagccttt actagtctct actctgttgt tgttgttgtt gttcctcctt 120

actcgtgccc aaagtcacaa acactcgcac cac 153

<210> 2

<211> 163

<212> DNA

<213> 三疣梭子蟹

<400> 2

agaatgttgc catggctgga acacttcaac aacgggtgca agtttgcagc cacgaatccg 60

gtggtggtgg tggtggtggt gcagagcctg ctgcatgaaa tggaggtgtc tgagtgacta 120

ctcaacactc agtctccacc tcaccaacgc actgatacag ggt 163

<210> 3

<211> 145

<212> DNA

<213> 三疣梭子蟹

<400> 3

cccgcccctg tacattttca gtgtaatttt acattgccaa attaataaac cgtatattat 60

tattattatt attattatta ttatctttat gattttacgc tgaaatcaat ttaacaaaga 120

tggccgacca ccaagcctac caaca 145

<210> 4

<211> 115

<212> DNA

<213> 三疣梭子蟹

<400> 4

gcttctgctg ctggtcctta ctagaatttg gtaagcctga caatcaatca accaaccaac 60

caaccaacca accaactaac tgcctacatc aactacatgc tcagcaatgt ctggt 115

<210> 5

<211> 272

<212> DNA

<213> 三疣梭子蟹

<400> 5

gagccataca gagcacatca ttgaaagcat ccagtttttg tttgctacat tttgtatgaa 60

gctgaattac actgcttttc atgatgcctg aagatttgga atttcagtct aatgtgattg 120

caaatcttac tttcataatt atattttccc agatatatag tatgtataca gtaagaccac 180

cggtaagatc accacaactg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtc 240

gatgtgcgtg ctcatgtatg tatgtgcgtg tg 272

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtgcaccaa ctcactcgaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtggtgcgag tgtttgtgac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agaatgttgc catggctgga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

accctgtatc agtgcgttgg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cccgcccctg tacattttca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgttggtagg cttggtggtc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcttctgctg ctggtcctta 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

accagacatt gctgagcatg 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gagccataca gagcacat 18

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cacacgcaca tacatacat 19

Claims

1.一组与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记，其特征在于，所述三疣梭子蟹为渤海三疣梭子蟹，所述微卫星标记包括微卫星标记ZL03、ZL05、ZL06、ZL08和NC07；

2.一组与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记的引物，其特征在于，所述三疣梭子蟹为渤海三疣梭子蟹，所述微卫星标记的引物包括5对微卫星引物，分别为：

ZL03F：序列如SEQ ID NO.6所示，ZL03R：序列如SEQ ID NO.7所示；

ZL05F：序列如SEQ ID NO.8所示，ZL05R：序列如SEQ ID NO.9所示；

ZL06F：序列如SEQ ID NO.10所示，ZL06R：序列如SEQ ID NO.11所示；

ZL08F：序列如SEQ ID NO.12所示，ZL08R：序列如SEQ ID NO.13所示；

NC07F：序列如SEQ ID NO.14所示，NC07R：序列如SEQ ID NO.15所示。

3.一种权利要求1所述的微卫星标记或权利要求2所述的引物在三疣梭子蟹生长性状分析中的应用。

4.一种权利要求1所述的微卫星标记或权利要求2所述的引物在三疣梭子蟹分子育种中的应用。