CN104611417A - 一种三疣梭子蟹微卫星种质鉴别技术 - Google Patents

一种三疣梭子蟹微卫星种质鉴别技术 Download PDF

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Abstract

本发明是一种三疣梭子蟹微卫星种质鉴别技术，其特征是首先提取三疣梭子蟹基因组DNA，然后建立三疣梭子蟹富含微卫星的基因组文库，再对文库进行测序获得富含微卫星的序列；挑选出基因组文库中的一个编号为SZX-18的序列，并在其序列两端设计适合PCR扩增的特异性引物，并对三疣梭子蟹基因组DNA进行PCR扩增，将获得的PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型。本发明适用于三疣梭子蟹种质资源的追踪和家系识别分析等研究。

Description

一种三疣梭子蟹微卫星种质鉴别技术
技术领域：
本发明涉及到一种三疣梭子蟹微卫星种质鉴别技术，可以应用于三疣梭子蟹种质的追踪和家系识别等领域，是一种DNA分子标记技术。
背景技术：
DNA分子标记是能够用来作为指纹鉴定或区分基因组中某种差异特征的DNA片段，这种标记在遗传学研究和生物技术应用方面越来越成为有用的工具。在基因组水平上，由于DNA上核苷酸碱基的突变造成不同的生物个体之间存在着一定的差别，进而造成许多基因组DNA序列的多态性，即这些序列在不同的个体间是有差别的。分子标记技术就是把这些差别用分子生物学方法表现出来的技术，目前主要有以下几种分子标记技术：限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP)、微卫星(Microsatellite)或简单重复序列(Simple sequence repeats，缩写SSR)、随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，缩写RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，缩写AFLP)、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，缩写SNP)技术等。其中微卫星分子标记技术(Microsatellite)是由串联重复序列组成，其核心序列为1-6个核苷酸，其中两碱基重复数目最多。微卫星分子标记技术利用PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增的原理，在核心重复序列区两端非重复序列区设计PCR扩增引物，扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，经染色处理后可以显示出扩增的结果。微卫星广泛分布于真核生物基因组中，因重复单元数目不同而呈现高度多态性，已成为非常重要的分子遗传标记之一，具有数量多、分布广且均匀、多态性丰富、分析快速方便等一系列优点，并具有重要的理论意义和深远的应用前景。该技术最早于1994年由Zietkiewicz创建。微卫星呈孟德尔共显性遗传，可以区别纯合显性个体和杂合显性个体，是家系或者个体识别以及群体遗传多态性分析的有用工具。值得一提的是，通常所说的微卫星技术是泛指一切以基因组中核心重复序列区重复序列的多态性为检测对象的技术，具体到基因组中的各个重复序列区，则每个重复序列所在的序列区被称为微卫星基因座，针对每个基因座可以开发出相应的微卫星位点 检测技术，本专利所申请的就是这样一种特定基因座的分析检测技术。
目前，海洋生物中已经广泛利用该技术进行了群体遗传多态性分析、遗传图谱构建、系谱认证等工作。在海洋水产生物三疣梭子蟹中的研究也已经有了一些报道，开发出了一些新的微卫星位点标记，并申请了一些国家发明专利，如“三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测技术”(200810017119)、“三疣梭子蟹ptssr17微卫星DNA标记的检测技术”(200810017118)。值得一提的是，三疣梭子蟹基因组中微卫星位点多达数万个，而目前已经报道的微卫星位点只是三疣梭子蟹众多微卫星位点中的很小一部分，因此会不断有新的微卫星位点被开发出来，而本专利申请的微卫星标记则属于与以上基因座位点不同的新的微卫星标记，可以用于对某一特定种质资源进行追踪和家系识别研究。
发明内容：
本发明描述了一个新的三疣梭子蟹微卫星基因座多态性检测技术，为三疣梭子蟹特定种质的追踪和家系识别分析提供了一个新的技术，主要内容为通过提取三疣梭子蟹基因组DNA，利用含有重复序列的随机引物PCR扩增基因组DNA，利用扩增产物建立基因组文库，对基因组文库进行测序，查找测序序列中含有微卫星重复序列的片段，以重复序列为核心设计微卫星扩增引物，以PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色的方法检测这些引物的扩增结果，从中挑选出一个编号为SZX-18的微卫星引物，建立一个适合于三疣梭子蟹种质资源追踪和家系识别研究的微卫星基因座检测技术。
附图说明：
附图是微卫星SZX-18种质识别图。图中显示的编号1-20为来源于不同家系的混合个体，21-30为单一家系的10个个体，M为DNA分子量标准Marker的缩写。微卫星SZX-18在1-30个个体中检测出来的基因型见表1。在编号1-20个体中，共扩增出106bp、178bp、202bp、211bp、218bp、219bp、235bp、243bp等8个等位基因，在编号21-30单一家系10个个体中共扩增出211bp、231bp 三个等位基因，而且这些等位基因在这一单个家系中的分布规律符合来源于同一家系父母本在某一等位基因座的遗传分离规律，即从中可以推断出父亲和母亲的基因型均为211/231。图中分子量Marker有三条带，最上面的条带指示的标准为250bp。
具体实施方式：
本发明可以通过以下几个操作步骤实现：
一、基因组DNA提取
(1)破碎肌肉：取100mg三疣梭子蟹附肢肌肉，剔除杂物后放入1.5ml灭菌离心管中，加入抽提缓冲液475μl，用剪刀剪碎肌肉，剪得越碎越好；
(2)蛋白酶消化：在以上溶液中加入25μl 10％SDS，再加入4μl蛋白酶K(20mg/mL)，反复倒置10次，用封口膜封住管口，在55℃水浴锅中水浴3-4小时，其中每消化1小时，轻轻摇动离心管2-3次，以便利于消化；
(3)第一次酚处理：从水浴锅中取出，去除封口膜，冷却至室温后，在eppendorf管中加入饱和酚，上下颠倒摇晃10min；
(4)第一次离心：在5℃，12000r/min，离心10min；
(5)饱和酚-氯仿处理：离心后，用去尖的200μl枪头吸取上清液，加入250μl饱和酚和250μl氯仿，上下颠倒10min；
(6)第二次离心：在5℃，12000r/min，离心10min；
(7)氯仿处理：离心后，取上清液，加入500μl氯仿，上下颠倒10min；
(8)第三次离心：在5℃，12000r/min，离心10min；
(9)DNA沉淀析出：小心吸取上清夜，加入1/25总体积的NaCl(5M)溶液，再加入2倍体积无水乙醇(预先冷冻至-20℃)，静止沉淀；
(10)风干DNA：上下颠倒沉淀液，离心，去上清，加入70％乙醇(约500μl)，静置1小时，再离心，如此反复两次，最后放于超净工作台让其自然风干，然后加入溶模板缓冲液，并把其放于-20℃冰箱中保存备用。
二、建立三疣梭子蟹微卫星富集文库：
混合3个三疣梭子蟹基因组DNA后用Sau3A I限制性内切酶酶切，电泳回收300-1000bp片段。在回收的片段上连接接头，PCR扩增后与用生物素标记的微卫星探针(AC)15、(AG)15、(AT)15、(GC)15、(ACC)15杂交；运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。将获得的序列通过PCR扩增后，连接到pGEM-T载体，转化入感受态大肠杆菌，进而得到微卫星序列富集文库。
三、微卫星引物筛选
获得微卫星富集文库后，用PCR法直接对文库进行扩增，对PCR产物进行测序，拣选测序序列中含有微卫星的序列，以微卫星序列为核心，在两侧设计引物，并把设计的引物序列送交DNA合成公司合成引物。进一步，获得引物后，利用PCR技术扩增含有10个个体的三疣梭子蟹混合基因组DNA，验证这些引物是否能够扩增出清晰、有规则的条带。在筛选的这些引物中，获得了一个编号为微卫星SZX-18引物，引物序列为正向(5’-3’)：CAAAGCGACGCAACTCATAA，反向(5’-3’)：AGGGAACACAGGACCCAAGA。
四、微卫星SZX-18的PCR条件优化
对获得的微卫星SZX-18引物进行PCR条件的优化，获得如下最佳的PCR扩增体系和扩增条件：最佳的PCR扩增体系为20μl，包含2μl 10×Reaction Buffer(with Mg2+)，1.6μl dNTP(包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各2.5mM)， 正反向引物(10μM)各2μl，1U Taq酶(BBI)，50ng给基因组DNA，用灭菌双蒸水补足20μl总体积；最佳的PCR反应条件为：首先94℃预变性4min；然后进入以下30个循环：94℃变性30s，65℃退火40s，72℃延伸45s，最后，72℃再次延伸10min，并在4℃保存备用。
五、凝胶电泳检测
采用变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳对PCR结果进行检测，具体方法如下：
(1)擦板：先用无水乙醇棉球擦胶板和平板，干燥10min，然后吸取1.2mL无水乙醇，6μl冰醋酸，6μl亲和硅烷混匀擦平板，干燥30min。
(2)擦边条：洗涤鲨鱼齿梳子，用面巾纸擦拭干净。
(3)将干燥好的胶板和平板叠放在一起，用夹子夹住两边边条使其固定，把鲨鱼齿梳子齿朝上加入两板之间。
(4)配胶：量取20mL 8.0％变性PAGE胶，10μl TEMED，200μl 10％过硫酸胺，摇晃使其混匀。
(5)注胶：用注射器将配置好的胶注入两板之间，为防止产生气泡，可用洗耳球敲打，注胶完毕后把板放平。
(6)凝胶：时间为1小时。
(7)做点样孔：在槽内加入缓冲液，轻轻取下鲨鱼齿梳子，在将其反向插入胶面1mm处即可。
(8)预电泳：以300V电压，预电泳10min。
(9)点样：在4μl PCR产物中加入4μl变性缓冲液，在PCR仪中95℃变性7min后，迅速取出放入冰水混合物中使其冷却数分钟。用10μl枪将其分别注入每个点样孔中。用4μl DNA分子量参考物DL2000和4μl溴酚蓝做为标记。
(10)电泳：300V，电泳时间为2.5h。
六、银染
利用硝酸银染色的方法使PCR产物在凝胶上显示出来，具体操作步骤如下：
(1)电泳结束后，关上电泳仪，倒掉缓冲液，取下夹子，拿下胶板，用小刀以一端启下另一块玻璃板，取出胶板。
(2)固定：把胶板放入1L固定液(100ml 10％冰乙酸，900ml双蒸水)中浸泡30min后回收固定液待用，再用双蒸水漂洗6min。
(3)染色：染色液为1L(1.5g AgNO3，3ml 37％甲醛溶液)，染色时间为30min，随后用双蒸水冲一冲。
(4)显色：把胶版放入显色液中，显色液为1L(30g Na2CO3，200μl Na2S2O3，2ml 37％甲醛溶液)，放在摇床上轻轻摇动。
(5)停显：待条带显示出来，且比较清晰时，把0.1M HCl倒入显色液中，停止显色。
七、数据分析 
取出停止显色后的胶板，用蒸馏水清洗干净后晾干。利用扫描仪扫描记录条带，利用Gel-Pro Analyzer 3.1生物软件结合DNA分子量Marker对胶板中显示的条带进行定量，确定每个条带的分子量大小。

Claims (1)

1.一种三疣梭子蟹微卫星种质鉴定技术
通过提取三疣梭子蟹基因组DNA，建立三疣梭子蟹微卫星富集文库，以及对文库的测序和PCR引物设计，获得了一对适合于三疣梭子蟹种质资源追踪和家系识别的微卫星引物，其特征在于：
正向引物序列为5’-CAAAGCGACGCAACTCATAA-3’，反向引物序列为5’-ACGCAACACAGGACCCAAGA-3’。
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