KR100376770B1

KR100376770B1 - 유전자의 변이 분석 키트

Info

Publication number: KR100376770B1
Application number: KR10-2000-0025205A
Authority: KR
Inventors: 김욱
Original assignee: 김욱
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2003-03-19
Also published as: KR20010105503A

Abstract

본 발명은 Y-STRs 분석방법에 있어서, 인간의 DNA(genomic DNA)를 정제하는 정제단계;DYS19/DYS389I/DYS389II,DYS390/DYS391/DYS393,DYS19/DYS388/DYS392의 유전자좌들이 조합으로 구성된 군으로부터 1 이상 선택된 Y-STR 유전자좌에 대한 특이적 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 이를 증폭하는 증폭단계; 및, 상기 증폭된 DNA를 allelic ladder와 비교하여 증폭된 대립유전자들을 평가하고, 이를 통해 DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는 분석단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Y-STRs 분석방법에 관한 것으로 특히 상기 분석단계가 은염색방법을 통하여 유전자형을 가시화하는 것을 특징으로 하는 Y-STRs 분석방법을 제공하며, 또한 이를 수행하기 위한 Y-STRs 분석키트를 제공한다.

Description

유전자의 변이 분석 키트{Rapid Multiplex Genotyping Kit System for the detection of Y-chromosome STRs}

본 발명은 인간의 Y 염색체에 위치하는 STRs (Short Tandem Repeats) 유전자의 변이를 경제적이고도 신속하고 정확하게 분석할 수 있는, 은염색방법을 이용한 Y-STR 분석방법 및 allelic ladder를 포함하는 분석키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 여러개의 STRs 좌위를 동시에 타이핑하기 위하여 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(PCR; Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 증폭후, 얻어진 allelic ladder와 비교분석하는 것으로 구성되는, 개인식별 및 법과학 분야에 활용되는 Y-STR분석 방법 및 키트에 관한 것이다.

최근 분자 생물학적 기법이 발전됨에 따라, 한국을 비롯한 아시아, 미국 및 유럽 대부분의 국가에서는 DNA 프로필(profile) 분석결과를 개인식별 및 법의학 분야에 적용시키고 있다. 현재 국제적으로 대부분의 경우, 상염색체 유전자 마커(marker) (STRs)를 통한 DNA 프로필 분석 방법이 주로 활용되고 있으며, 또한 이러한 상염색체 STR 분석 키트 시스템이 상업적으로 개발되어 있다.한편, Y-염색체의 NRPY (non-recombining portion of the Y-chromosome) 부위는 X-염색체와 교차되지 않기 때문에, 이 부위에 위치한 여러 유전자들의 변이를 단상형(haplotype) 상태로 비교 분석함으로써 남자와 관련된 개인식별 및 법과학 분야에 매우 유용한 수단으로써 활용될 수 있다.이와 같이 NRPY 상에 위치한 Y-STR 마커는 개인에 따라 매우 다양한 유전적 변이를 나타내기 때문에, 개인식별 및 법과학 분야에서는 Y-STRs에 관한 유전적 변이를 표준화된 기법에 의해 분석 및 판정할 필요가 있다.이에 따라 최근 자동염기서열분석기(autometic sequencer)를 이용하여 Y-STRs를 분석하는 방법이 개발되었으나, 장비의 비용이 고가임과 아울러, 각각의 Y-STR간에 간섭이 일어나서 결과가 제대로 나오지 못하는 문제점이 발생하였다.또한 아직까지 상염색체와는 달리 Y-염색체의 STR 분석키트 시스템(allelic ladders)은 개발되어 있지 않아서 본 발명자의 연구에 의하여 이를 발명하게 되었다.

상기의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 특정 Y-STR들을 조합하여 만들어진 allelic ladder를 이용하여, 종래의 Y-STR간의 간섭을 방지함과 아울러, 신속하고, 정확하게 차이점을 분석할 수 있는 은염색방법을 이용한 Y-STRs 분석방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.또한 본 발명은 상기 분석방법을 수행하기 위한, 남자와 관련된 개인식별을 위한 Y-STRs 분석키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.상기 목적 및 기타 목적들은 하기에 설명되는 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 Multiplex system 중, Triplex systemⅠ (DYS19/DYS389Ⅰ/DYS389Ⅱ)에 의해 나타난 전기영동상을 나타낸 사진이고,

도 2는 본 발명에 따른 Multiplex system 중, Triplex systemⅡ (DYS390/DYS391/DYS393)에 의해 나타난 전기영동상을 나타낸 사진이며,

도 3은 본 발명에 따른 Multiplex system 중, Triplex systemⅢ (DYS19/DYS388/DYS392)에 의해 나타난 전기영동상을 나타낸 사진이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인간의 DNA(genomic DNA)를 정제하는 정제단계;DYS19/DYS389I/DYS389II,DYS390/DYS391/DYS393,DYS19/DYS388/DYS392의 유전자좌들이 조합으로 구성된 군으로부터 1 이상 선택된 Y-STR 유전자좌에 대한 특이적 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 이를 증폭하는 증폭단계; 및, 상기 증폭된 DNA를 allelic ladder와 비교하여 증폭된 대립유전자들을 평가하고, 이를 통해 DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는 분석단계를 포함하는 것을 특징으로 상기 Y-STRs 분석방법을 제공한다.또한 본 발명은 상기 분석단계가 전기영동을 통한 은염색방법을 이용하여 유전자형을 가시화하는 것을 특징으로 하는 상기 Y-STRs분석방법을 제공한다.또한 본 발명은 Y-STRs 분석키트에 있어서,DYS19/DYS389I/DYS389II,DYS390/DYS391/DYS393,DYS19/DYS388/DYS392유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로부터 1 이상 선택된 Y-STR 유전자좌에 대한 특이적 프라이머, dNTP, 킬레이팅제, 콘트롤 DNA, allelic ladder 및 통상의 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 Y-STRs 분석키트를 제공한다.또한 본 발명은 상기 Y-STRs 분석키트의 상기 유전자좌에 대한 특이적 프라이머는 하기의 서열 쌍임을 특징으로 하는 상기 Y-STRs 분석키트를 제공한다.유전자좌가DYS19인 경우에는 상류 5'-ctactgagtttctgttatagt-3',하류 5'-atggcatgtagtgaggaca-3';유전자좌가DYS388인 경우에는 상류 5'-gtgagttagccgtttagcga-3', 하류 5'-cagatcgcaaccactgcg-3';유전자좌가DYS389I및DYS389II인 경우에는 상류 5'-ccaactctcatctgtattatctat-3', 하류 5'-tcttatctccacccaccaga-3';유전자좌가DYS390인 경우에는 상류 5'-tatattttacacatttttgggcc-3', 하류 5'-tgacagtaaaatgaacacattgc-3';유전자좌가DYS391인 경우에는 상류 5'-ctattcattcaatcatacaccca-3', 하류 5'-gattctttgtggtgggtctg-3';유전자좌가DYS392인 경우에는 상류 5'-tcattaatctagcttttaaaaacaa-3', 하류 5'-agacccagttgatgcaatgt-3';유전자좌가DYS393인 경우에는 상류 5'-gtggtcttctacttgtgtcaatac-3', 하류 5'-aactcaagtccaaaaaatgagg-3'.또한 본 발명은 상기 Y-STRs 분석키트가 전기영동을 통한 은염색방법을 통하여 유전자형들을 가시화하는 것을 특징으로 하는 Y-STRs 분석키트를 제공한다.본 발명에 사용되는 allelic ladder는 상이한 인류집단을 대상 ( 약 2,000여명)으로 8 STR 유전자좌들에서 PCR 및 염기서열 분석방법으로 확인된 모든 대립유전자(DYS19: 7 alleles,DYS388: 7 alleles,DYS389Ⅰ: 5 alleles,DYS389Ⅱ: 7 alleles,DYS390: 8 alleles,DYS391: 5 alleles,DYS392: 10 alleles,DYS393: 7 alleles) 들을 선별하여 플라스미드 벡터에 클로닝한 후, 각각의 클론(clone)으로부터 PCR 방법에 의해 이들 대립유전자를 증폭시켰다. 이후 이들 PCR 산물을 각기 분리 및 정제과정을 거침으로써 Y-STRs의 대립유전자 판정에 표준화될 수 있는 allelic ladders를 개발한 것이다.이하 본 발명을 실시예를 통하여 자세히 설명한다. 다만 본 발명의 보호범위는 하기의 실시예에 의하여 제한되어 져서는 아니될 것이다.<실시예 1> 8종의 Y-STRs의 분석키트의 준비하기 실시예 2의 분석방법은TagDNA 중합효소와 분석대상 DNA를 제외한, 각 시스템 별로 50회 PCR이 가능한 10×프라이머 쌍, Y-STR 10×완충액, 2×loading solution, positive control DNA, allelic ladder를 한 키트로 구성하여 이를 이용하였다.특히 상기 프라이머 쌍은 하기의 표 1의 Y-STR 트리플렉스 시스템에서 나타난 바와 같이 각각의 키트가 하기 3쌍의 유전자좌들에 대한 특이적 프라이머들의 조합으로 이루어지도록 하여 제조하였다.1) Y-Triplex system kit I :DYS19/DYS389Ⅰ/DYS389Ⅱ2) Y-Triplex system kit II:DYS390/DYS391/DYS3933) Y-Triplex system kit III:DYS19/DYS388/DYS392

Y-STR트리플렉스시스템	Y-STR 유전자좌	대립유전자크기 범위(bp)	반복 수	Control DNA 대립유전자 크기

키트Ⅰ	DYS389Ⅱ	355-379	23-29	27
	DYS389Ⅰ	243-259	8-12	11
	DYS19	182-206	12-18	16

키트Ⅱ	DYS390	199-227	20-27	23
	DYS391	275-291	8-12	10
	DYS393	116-140	11-17^*	13

키트Ⅲ	DYS392	236-263	7-16	11
	DYS19	182-206	13-18	16
	DYS388	125-143	11-17	13

※DYS393-16, 17 대립 유전자는 지금까지 세계적으로 보고된 바 없는 본 발명품의 한국인의 특정 대립 유전자이다.PCR 증폭은 2.5㎕의 10×PCR 완충용액, 0.2mM dNTP, 0.25 유니트의 Taq 중합효소, 1 내지 10 ng DNA 주형 및 0.015 ~0.5 mM의 각 해당 프라이머로 구성된 전체 부피가 25㎕인 반응용액에서 수행하였다. PCR 사이클은 다음과 같은 증폭 프로토콜을 채택했다.94℃에서 3분간 예열;94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 45초로 30회 반복; 및72℃에서 5분간 최종 연장.(3) 은염색방법을 이용한 분석단계상기의 과정을 통하여 증폭된 산물들은 전기영동장치를 사용하여 50W로 자일렌 시아놀 염색약(Xylene Cyanol Dye)이 겔 (20 cm ×43 cm)의 밑바닥에서 약 40mm 내지 60mm 될 때까지 전기영동을 수행하였다. 겔은 7M 우레아가 함유된 6% 아크릴아미드 겔이며 런닝버퍼 및 겔버퍼는 TBE 버퍼를 사용하였다.전기영동이 끝난 겔은 은 염색과정을 거쳐 밴드를 확인하는데 우선 10%의 에탄올로 10분 동안 수세시켰다. 그런 다음 증류수로 3회 수세한 후, 0.2% 질산은(silver nitrate)에서 20분 동안 반응시키고 증류수로 다시 한번 세척하였다. 수세된 겔은 0.28M 무수 탄산나트륨과 0.019% 포르말린 용액에서 환원시키면서 나타나는 밴드의 양상에 따라 10% 아세트산 용액으로 염색반응을 중지시켰다. 이렇게 염색된 겔은 3M 종이에 흡착시켜 겔 건조기에서 말린 후 보관하였다. 시험 결과를 도 1 내지 도 3에 도시하였다.도 1 내지 도 3에서 알 수 있는 바와 같이 샘플 DNA(1 내지 7)을 allelic ladder(L)와 비교하여 봄으로써 개인식별을 명확하게 할 수 있음을 알 수 있다.

Y-STR 마커는 개인에 따라 매우 다양한 유전적 변이를 나타내기 때문에, 특히 남자와 관련된 개인식별 및 법과학 분야에서는 Y-STRs에 관한 유전적 변이를 표준화된 기법에 의해 발명 개발될 필요가 있다. 일반적으로 강력 사건이나 성범죄가 남자에 의해 일어나는 경우가 많다고 볼 때, Y-염색체의 DNA 정보는 이러한 문제 해결에 매우 적절한 마커가 될 수 있으며, 특히 본 발명품은 남자와 여자의 세포조직이 혼합된 시료에서 남자의 DNA만을 특이적으로 분석할 수 있는 장점이 있다. 현재 국내외적으로 상염색체 유전자 마커(STRs)를 분석하는 키트 시스템은 개발 및 제품화되어 있으나, 상염색체와는 달리 아직까지 Y-염색체의 STR 분석 키트 시스템(allelic ladders)은 제품화되어 있지 않다. 따라서 개발된 본 발명품의 제품화에 따라 국내 생명공학 산업의 선진화 및 경쟁력 확보에도 기여할 것이며, 이에 따른 고용증대 및 경제적인 부가가치는 물론 분석기법의 효율성과 신뢰도를 높일 수 있을 것으로 기대된다. 또한 향후 지속적인 기술개발을 유도함으로써 Bio-chip 개발 등과 같은 보다 신속하고도 경제적인 유전자 타이핑 기법에 의해, 남북 통일을 대비한 이산가족 찾기 및 지문을 대체할 수 있는 전국민의 DNA profiling 사업의 수행을 가능하게 할 수 있다.따라서 본 발명이 제공하는 인간의 Y-STR 분석방법과 분석키트는 저렴한 비용으로 개인식별이 가능함과 아울러 특정 Y-STR들을 조합하여 만들어진 allelic ladder를 이용하여, 종래의 Y-STR간의 간섭을 방지함과 아울러, 신속하고, 정확하게 차이점을 분석할 수 있는 은염색방법을 이용한 Y-STRs 분석방법 및 이에 사용되는 분석키트를 제공하는 유용한 발명인 것이다.상기에서 본 발명은 기재된 구체예를 중심으로 상세히 설명되었지만, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

Claims

Y-STRs 분석방법에 있어서,

인간의 DNA(genomic DNA)를 정제하는 정제단계;DYS19/DYS389I/DYS389II,DYS390/DYS391/DYS393,DYS19/DYS388/DYS392의 유전자좌들이 조합으로 구성된 군으로부터 1 이상 선택된 Y-STR 유전자좌에 대한 특이적 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 이를 증폭하는 증폭단계; 및,

상기 증폭된 DNA를 allelic ladder와 비교하여 증폭된 대립유전자들을 평가하고, 이를 통해 DNA 샘플내의 분석된 유전자좌들 조합의 각각의 유전자형들을 결정하는 분석단계를 포함하는 것을 특징으로 상기 Y-STRs 분석방법.
제 1항에 있어서,

상기 분석단계는 전기영동을 통한 은염색방법을 이용하여 유전자형을 가시화하는 것을 특징으로 하는 상기 Y-STRs 분석방법.
DYS19/DYS389Ⅰ/DYS389Ⅱ, DYS390/DYS391/DYS393, DYS19/DYS388/DYS392의 유전자좌들의 조합으로 구성된 군으로 부터 1 이상 선택된 Y-STR 유전자좌에 대한 특이적 프라이머, dNTP, 킬레이팅제, 콘트롤 DNA, allelic ladder 및 통상의 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 Y-STRs 분석키트.
제 3항에 있어서,

상기 Y-STRs 분석키트의 상기 유전자좌에 대한 특이적 프라이머는 하기의 서열 쌍임을 특징으로 하는 상기 Y-STRs 분석키트:

유전자좌가DYS19인 경우에는 상류 5'-ctactgagtttctgttatagt-3',

하류 5'-atggcatgtagtgaggaca-3';

유전자좌가DYS388인 경우에는 상류 5'-gtgagttagccgtttagcga-3', 하류 5'-cagatcgcaaccactgcg-3';

유전자좌가DYS389I및DYS389II인 경우에는 상류 5'-ccaactctcatctgtattatctat-3', 하류 5'-tcttatctccacccaccaga-3';

유전자좌가DYS390인 경우에는 상류 5'-tatattttacacatttttgggcc-3', 하류 5'-tgacagtaaaatgaacacattgc-3';

유전자좌가DYS391인 경우에는 상류 5'-ctattcattcaatcatacaccca-3', 하류 5'-gattctttgtggtgggtctg-3';

유전자좌가DYS392인 경우에는 상류 5'-tcattaatctagcttttaaaaacaa-3', 하류 5'-agacccagttgatgcaatgt-3';

유전자좌가DYS393인 경우에는 상류 5'-gtggtcttctacttgtgtcaatac-3', 하류 5'-aactcaagtccaaaaaatgagg-3'.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,

상기 Y-STRs 분석 키트는 전기영동을 통한 은염색방법을 통하여 유전자형들을 가시화하는 것을 특징으로 하는 Y-STRs 분석키트.
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