CN109486964B - 用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法，属于分子生物学领域。包括提取驴的DNA并检测、确定驴的13个微卫星位点并合成微卫星引物、PCR扩增得到13条目标微卫星序列及检测结果分析步骤；所述13对微卫星引物的退火温度相差小于等于2℃；将所述13对微卫星引物合成13对荧光引物。本发明检测速度快、实验成本低、实验效率高，只需一次PCR扩增即可获得十三个微卫星位点的全部分型信息，灵敏度高，最低只需5ng DNA即可检出十三个位点的分型，是首个用于驴亲子鉴定的微卫星荧光多重PCR检测方法，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及荧光多重PCR技术和微卫星分型技术，具体为用于驴的个体识别和亲子鉴定的DNA微卫星快速检测方法。
背景技术
微卫星(Short tandem repeat,STR)，广泛的分布于动植物的基因组中，由于其具有多态性好、易于操作和呈共显性遗传等特点，广泛应用于动物的群体遗传多样性研究和鉴定个体与亲本间的亲子关系等。微卫星由核心的短片段连续重复序列和两侧保守序列组成，根据连续重复序列的碱基数目,它可分为二碱基重复、三碱基重复、四碱基重复、五碱基重复和六碱基重复微卫星。核心的连续重复序列在同一物种的不同个体间存在重复次数的差异，称为微卫星多态性。因为微卫星重复次数可以稳定的遗传给后代，所以可以通过检测同一物种大量个体多个微卫星的基因分型，对群体进行分类，并计算该物种的群体遗传多样性。微卫星也是法医个体识别鉴定和亲子鉴定的主要工具，通过检测和比对两个样本在多个微卫星位点的基因分型，可以完成个体识别和亲子鉴定。
2017年国际动物遗传学学会(International Society for Animal Genetics,ISAG)召开马属动物遗传学会议，首次确定了用于驴的个体识别及亲子鉴定的13个微卫星位点(AHT4,ASB23,HMS2,HMS3,HMS6,HMS7,HMS18,HTG7,HTG10,TKY297,TKY312,TKY337,TKY343)并推荐了引物序列。在实际操作时，我们发现部分位点的引物扩增效果不理想，而且需要单独扩增每一个位点进行13次PCR检测，这样导致检测时间长、检测效率低而检测成本高。目前，国际和国内尚无这13个微卫星位点驴13重PCR方法的发明专利。
发明内容
针对上述存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种快速检测驴13个微卫星位点的13重PCR方法。本检测方法只需一次PCR即可快速检测驴的全部13个微卫星的基因型，本检测方法检测效率高、检测成本低，适于推广应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法，包括提取驴的DNA并检测、确定驴的13对微卫星点位并合成微卫星引物、PCR扩增得到13条目标微卫星序列及检测结果分析步骤；所述驴的13对微卫星点位及产物大小范围分别为：AHT4：126-162bp，HMS7：212-220bp，HTG7：279-299bp，ASB23：361-379bp，HMS3：444-456bp，HTG10：111-133bp，TKY312：200-208bp，HMS2：308-328bp，TKY297：405-429bp，HMS6：481-497bp，HMS18：174-192bp，TKY343：256-262bp，TKY337：375-387bp；所述13对微卫星引物的退火温度相差小于等于2℃；将所述13对微卫星引物合成13对荧光引物。
优选地，所述PCR扩增得到13条目标微卫星序列，按照如下步骤进行：
驴的微卫星13重PCR扩增：使用上述合成13对荧光引物，按照各自确定的引物终浓度配成引物混合液加入反应体系，反应体系为15ul：引物混合液6ul、DNA聚合酶(2xEasyTaqPCR SuperMix,全式金生物)7.5ul、待测驴的DNA 1～50ng，加灭菌水补齐至15ul；PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，退火温度58.5℃30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸20分钟；4℃保持；通过一次PCR扩增得到13条目标微卫星序列产物。
优选地，所述13对微卫星引物序列为：
微卫星点位AHT4，引物序列F:AACCGCCTGAGCAAGGAAGT，R:GCTCCCAGAGAGTTTACCCT；产物范围126-162bp，引物终浓度63.3nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HMS7，引物序列F:GCAGTCCTGTGTACCCTTCA，R:GGTAGATACATGAACCCAGACG；产物范围212-220bp，引物终浓度63.3nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HTG7，引物序列F:GGATGTGAACCCAACTTTATGAG，R:GCAGAGCTGCTACACGGACT；产物范围279-299bp，引物终浓度110nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位ASB23，引物序列F:GCCTTTATCTCCCCTTTTCAAC，R:GAAAGTCTTGGTTTTGGCATTG；产物范围361-379bp，引物终浓度146.7nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HMS3，引物序列F:TCAGATAGTGATAATGCCGTGG，R:GCTCTAAAGCCCCAACTCTTTG；产物范围444-456bp，引物终浓度96.7nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HTG10，引物序列F:TGGGCTTTTTATTCTGATCTGTC，R:AGTTTATTACAAATGGCCAATTCC；产物范围111-133bp，引物终浓度300nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位TKY312，引物序列F:TGTCTGCACTCTTAAGCTCAT，R:TAATGCTTTCCAGGTTCATC；产物范围200-208bp，引物终浓度233.3nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位HMS2，引物序列F:GATCTCTAGCTCAGTAAATCACAGG，R:ACGGTGGCAACTGCCAAGGAAG；产物范围308-328bp，引物终浓度80nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位TKY297，引物序列F:CCTGGCTCTAGGAGATTCCA，R:AGGCTTGGTGTATTCAACCTACTC；产物范围405-429bp，引物终浓度76.7nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位HMS6，引物序列F:AGGTGAGACGCACTTCTGTTATCAG，R:GTCATTCCCTGCATTTCATCACTAA；产物范围481-497bp，引物终浓度93.3nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位HMS18，引物序列F:CAACAATGAAAATTTGTCCTGTGC，R:GTAAATGAGTAGACAATCATGAGG；产物范围174-192bp，引物终浓度130nM/L，携带标记为TAMARA；
微卫星点位TKY343，引物序列F:GCCTCTCCAGATAGTCCCTA，R:CCAAAGGTCACCAGATAATTG；产物范围256-262bp，引物终浓度366.7nM/L，携带标记为TAMARA；
微卫星点位TKY337，引物序列F:GCTAATGCAGCACAGCTTGT，R:ATGAATAAGGGATGTGACATTAGTC；产物范围375-387bp，引物终浓度240nM/L，携带标记为TAMARA。
优选地，每对引物中至少一条使用荧光标记标记其5’端，13对引物分为3组，每组使用不同荧光标记，其中：AHT4、HMS7、HTG7、ASB23、HMS3为第一组，使用FAM荧光标记；HTG10、KTY312、TKY337、HMS2、TKY297、HMS6为第二组，使用HEX荧光标记；HMS18、TKY337、TKY343为第三组，使用TAMRA荧光标记。
优选地，所述检测结果分析步骤，按照如下方法进行：
使用ABI 3730xl测序仪和Genemapper v4.0软件检测上述PCR产物，获得待测样品在13个微卫星位点上的基因分型；对比两个样本的13个微卫星位点的基因型，如果完全一致，判断为同一个体，反之不是同一个体；对比待测样本与亲本的13个微卫星位点的基因分型，根据等位基因的遗传定律判断二者的亲子关系。
优选地，所述提取驴的DNA：是采集驴的毛发、血液、皮肤、肌肉或器官组织。
本发明的检测方法用于驴的个体识别、亲子鉴定或性别鉴定的应用。
本发明的有益效果为：
1.本发明采用用于驴的个体识别及亲子鉴定的13个微卫星位点(AHT4,ASB23,HMS2,HMS3,HMS6,HMS7,HMS18,HTG7,HTG10,TKY297,TKY312,TKY337,TKY343)，并对微卫星点位、产物大小范围及引物终浓度进行了重新设计，重新构建了13重微卫星多重PCR体系，通过荧光标记的引物对待测驴的DNA进行多重PCR扩增，对扩增产物的荧光信号进行检测，获得待测驴在13个微卫星位点上的基因分型数据，达到身份识别或亲子鉴定的目的。
2.本发明检测速度快、实验成本低、实验效率高，只需一次PCR扩增即可获得十三个微卫星位点的全部分型信息，灵敏度高，最低只需5ng DNA即可检出十三个位点的分型，是首个用于驴亲子鉴定的微卫星荧光多重PCR检测方法，适于推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例中母驴的Genemapper软件检测峰图。
图2为本发明实施例中驴驹的Genemapper软件检测峰图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细描述。
实施例1：鉴定一头成年母驴和一头驴驹的亲子关系。采用本发明一种用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法，包括提取驴的DNA并检测、确定驴的13对微卫星点位并合成微卫星引物、PCR扩增得到13条目标微卫星序列及检测结果分析步骤，其中
提取驴的DNA并测量所提取DNA浓度；驴的毛发、血液、皮肤、肌肉或器官组织，本例提取的是驴的毛发，使用实验室常用方法提取驴DNA并测量所提取DNA浓度；DNA浓度的检测方法为现有方法。
所述驴的13对微卫星点位及产物大小范围分别为：AHT4：126-162bp，HMS7：212-220bp，HTG7：279-299bp，ASB23：361-379bp，HMS3：444-456bp，HTG10：111-133bp，TKY312：200-208bp，HMS2：308-328bp，TKY297：405-429bp，HMS6：481-497bp，HMS18：174-192bp，TKY343：256-262bp，TKY337：375-387bp；所述13对微卫星引物的退火温度相差小于等于2℃；
将上述得到的13对微卫星引物合成13对荧光引物；
驴的微卫星13重PCR扩增：使用上述合成的13对荧光引物，按照各自确定的引物终浓度配成引物混合液加入反应体系，反应体系为15ul：引物混合液6ul、DNA聚合酶(2xEasyTaq PCR SuperMix,全式金生物)7.5ul、将步骤S1中待测驴的DNA浓度配制成1～50ng，加灭菌水补齐至15ul；PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，退火温度58.5℃30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸20分钟；4℃保持；通过一次PCR扩增得到13条目标微卫星序列产物。
所述13对微卫星引物序列为：
微卫星点位AHT4，引物序列F:AACCGCCTGAGCAAGGAAGT，R:GCTCCCAGAGAGTTTACCCT；产物范围126-162bp，引物终浓度63.3nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HMS7，引物序列F:GCAGTCCTGTGTACCCTTCA，R:GGTAGATACATGAACCCAGACG；产物范围212-220bp，引物终浓度63.3nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HTG7，引物序列F:GGATGTGAACCCAACTTTATGAG，R:GCAGAGCTGCTACACGGACT；产物范围279-299bp，引物终浓度110nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位ASB23，引物序列F:GCCTTTATCTCCCCTTTTCAAC，R:GAAAGTCTTGGTTTTGGCATTG；产物范围361-379bp，引物终浓度146.7nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HMS3，引物序列F:TCAGATAGTGATAATGCCGTGG，R:GCTCTAAAGCCCCAACTCTTTG；产物范围444-456bp，引物终浓度96.7nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HTG10，引物序列F:TGGGCTTTTTATTCTGATCTGTC，R:AGTTTATTACAAATGGCCAATTCC；产物范围111-133bp，引物终浓度300nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位TKY312，引物序列F:TGTCTGCACTCTTAAGCTCAT，R:TAATGCTTTCCAGGTTCATC；产物范围200-208bp，引物终浓度233.3nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位HMS2，引物序列F:GATCTCTAGCTCAGTAAATCACAGG，R:ACGGTGGCAACTGCCAAGGAAG；产物范围308-328bp，引物终浓度80nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位TKY297，引物序列F:CCTGGCTCTAGGAGATTCCA，R:AGGCTTGGTGTATTCAACCTACTC；产物范围405-429bp，引物终浓度76.7nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位HMS6，引物序列F:AGGTGAGACGCACTTCTGTTATCAG，R:GTCATTCCCTGCATTTCATCACTAA；产物范围481-497bp，引物终浓度93.3nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位HMS18，引物序列F:CAACAATGAAAATTTGTCCTGTGC，R:GTAAATGAGTAGACAATCATGAGG；产物范围174-192bp，引物终浓度130nM/L，携带标记为TAMARA；
微卫星点位TKY343，引物序列F:GCCTCTCCAGATAGTCCCTA，R:CCAAAGGTCACCAGATAATTG；产物范围256-262bp，引物终浓度366.7nM/L，携带标记为TAMARA；
微卫星点位TKY337，引物序列F:GCTAATGCAGCACAGCTTGT，R:ATGAATAAGGGATGTGACATTAGTC；产物范围375-387bp，引物终浓度240nM/L，携带标记为TAMARA；所述13对微卫星引物的退火温度相差小于等于2℃。
如下表1所示：
表1：
其中：每对引物中至少一条使用荧光标记标记其5’端，13对引物分为3组，每组使用不同荧光标记，其中：AHT4、HMS7、HTG7、ASB23、HMS3为第一组，使用FAM荧光标记；HTG10、KTY312、TKY337、HMS2、TKY297、HMS6为第二组，使用HEX荧光标记；HMS18、TKY337、TKY343为第三组，使用TAMRA荧光标记。
基因分型及亲子鉴定：
使用ABI 3730xl测序仪和Genemapper v4.0软件检测上述PCR产物，获得待测样品在13个微卫星位点上的基因分型；对比待测样本与亲本的13个微卫星位点的基因型，如果完全一致，判断为同一个体，反之不是同一个体；对比待测样本与亲本的13个微卫星位点的基因分型，根据等位基因的遗传定律判断二者的亲子关系。
按照本发明方法构建的多重PCR体系，只需一次PCR扩增即可获得全部13个微卫星位点分型信息，上述方法显著降低了检测成本、缩短检测时间，是我国首个用于驴的13重微卫星PCR检测的方法。
本例DNA检测结果如图1所示为母驴的Genemapper软件检测峰图。如图2所示为驴驹的Genemapper软件检测峰图。
母驴分型为
| 位点 | HTG10 | AHT4 | ASB23 | HMS2 | HMS3 | HMS6 | HMS7 |
| 分型 | 22 | 25 | 23,25 | 19,22 | 28 | 12,13 | 15 |
| 位点 | HMS18 | HTG7 | TKY297 | TKY312 | TKY337 | KTY343 | |
| 分型 | 17,18 | 22，28 | 16，17 | 16，17 | 12，13 | 22 |
驴驹的分型为
| 位点 | HTG10 | AHT4 | ASB23 | HMS2 | HMS3 | HMS6 | HMS7 |
| 分型 | 22，23 | 20，25 | 22，23 | 22，23 | 28 | 12 | 15 |
| 位点 | HMS18 | HTG7 | TKY297 | TKY312 | TKY337 | KTY343 | |
| 分型 | 18 | 27,28 | 16 | 17,18 | 12,13 | 22，23 |
鉴定结论：母驴与驴驹在13个检测位点上基因分型符合遗传定律，判定为母子关系。
本发明的检测方法用于驴的个体识别、亲子鉴定或性别鉴定的应用。
本发明的检测操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
说明书核苷酸和氨基酸序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法
<141> 2018-12-12
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Ala Ala Gly Thr
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Cys Cys Cys Thr
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<213> 引物序列 （5’ - 3’）R
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Ala Gly Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala Ala Thr Gly Gly
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Cys Cys Ala Ala Thr Thr Cys Cys
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<213> 引物序列 （5’ - 3’）F
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1 5 10 15
Cys Ala Thr Cys
20
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）F
<400> 15
Gly Ala Thr Cys Thr Cys Thr Ala Gly Cys Thr Cys Ala Gly Thr Ala
1 5 10 15
Ala Ala Thr Cys Ala Cys Ala Gly Gly
20 25
<210> 16
<211> 22
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）R
<400> 16
Ala Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Ala Ala Gly
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）F
<400> 17
Cys Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Gly Gly Ala Gly Ala Thr
1 5 10 15
Thr Cys Cys Ala
20
<210> 18
<211> 24
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）R
<400> 18
Ala Gly Gly Cys Thr Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Cys Ala
1 5 10 15
Ala Cys Cys Thr Ala Cys Thr Cys
20
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）F
<400> 19
Ala Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Cys Gly Cys Ala Cys Thr Thr Cys
1 5 10 15
Thr Gly Thr Thr Ala Thr Cys Ala Gly
20 25
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）R
<400> 20
Gly Thr Cys Ala Thr Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Thr Thr Thr
1 5 10 15
Cys Ala Thr Cys Ala Cys Thr Ala Ala
20 25
<210> 21
<211> 24
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）F
<400> 21
Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Thr Cys Cys Thr Gly Thr Gly Cys
20
<210> 22
<211> 24
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）R
<400> 22
Gly Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ala Gly Ala Cys Ala Ala
1 5 10 15
Thr Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）F
<400> 23
Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Ala Gly Thr Cys
1 5 10 15
Cys Cys Thr Ala
20
<210> 24
<211> 21
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）R
<400> 24
Cys Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Thr Thr Gly
20
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）F
<400> 25
Gly Cys Thr Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys
1 5 10 15
Thr Thr Gly Thr
20
<210> 26
<211> 25
<212> PRT
<213> 引物序列 （5’ - 3’）R
<400> 26
Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Gly Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ala Cys Ala Thr Thr Ala Gly Thr Cys
20 25
Claims (3)
1.一种用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法，其特征在于：包括提取驴的DNA并检测、确定驴的13对微卫星位点并合成微卫星引物、PCR扩增得到13条目标微卫星序列产物及检测结果分析步骤；所述驴的13对微卫星点位及产物大小范围分别为：
微卫星点位AHT4，引物序列F:AACCGCCTGAGCAAGGAAGT，R:GCTCCCAGAGAGTTTACCCT；产物范围126-162bp，引物终浓度63.3nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HMS7，引物序列F:GCAGTCCTGTGTACCCTTCA，R:GGTAGATACATGAACCCAGACG；产物范围212-220bp，引物终浓度63.3nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HTG7，引物序列F:GGATGTGAACCCAACTTTATGAG，R:GCAGAGCTGCTACACGGACT；产物范围279-299bp，引物终浓度110nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位ASB23，引物序列F:GCCTTTATCTCCCCTTTTCAAC，R:GAAAGTCTTGGTTTTGGCATTG；产物范围361-379bp，引物终浓度146.7nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HMS3，引物序列F:TCAGATAGTGATAATGCCGTGG，R:GCTCTAAAGCCCCAACTCTTTG；产物范围444-456bp，引物终浓度96.7nM/L，携带标记为FAM；
微卫星点位HTG10，引物序列F:TGGGCTTTTTATTCTGATCTGTC，R:AGTTTATTACAAATGGCCAATTCC；产物范围111-133bp，引物终浓度300nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位TKY312，引物序列F:TGTCTGCACTCTTAAGCTCAT，R:TAATGCTTTCCAGGTTCATC；产物范围200-208bp，引物终浓度233.3nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位HMS2，引物序列F:GATCTCTAGCTCAGTAAATCACAGG，R:ACGGTGGCAACTGCCAAGGAAG；产物范围308-328bp，引物终浓度80nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位TKY297，引物序列F:CCTGGCTCTAGGAGATTCCA，R:AGGCTTGGTGTATTCAACCTACTC；产物范围405-429bp，引物终浓度76.7nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位HMS6，引物序列F:AGGTGAGACGCACTTCTGTTATCAG，R:GTCATTCCCTGCATTTCATCACTAA；产物范围481-497bp，引物终浓度93.3nM/L，携带标记为HEX；
微卫星点位HMS18，引物序列F:CAACAATGAAAATTTGTCCTGTGC，R:GTAAATGAGTAGACAATCATGAGG；产物范围174-192bp，引物终浓度130nM/L，携带标记为TAMARA；
微卫星点位TKY343，引物序列F:GCCTCTCCAGATAGTCCCTA，R:CCAAAGGTCACCAGATAATTG；产物范围256-262bp，引物终浓度366.7nM/L，携带标记为TAMARA；
微卫星点位TKY337，引物序列F:GCTAATGCAGCACAGCTTGT，R:ATGAATAAGGGATGTGACATTAGTC；产物范围375-387bp，引物终浓度240nM/L，携带标记为TAMARA；
所述13对微卫星引物的退火温度相差小于等于2℃；
所述PCR扩增得到13条目标微卫星序列产物，按照如下步骤进行：
驴的微卫星13重PCR扩增：使用上述微卫星引物合成13对荧光引物，按照各自确定的引物终浓度配成引物混合液加入反应体系，反应体系为15ul：引物混合液6ul、DNA聚合酶7.5ul、待测驴的DNA 1～50ng，加灭菌水补齐至15ul；PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，退火温度58.5℃30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸20分钟；4℃保持；通过一次PCR扩增得到13条目标微卫星序列产物；
使用ABI 3730xl测序仪和Genemapper v4.0软件检测上述PCR产物，获得待测样品在13个微卫星位点上的基因分型；对比两个样本的13个微卫星位点的基因型，如果完全一致，判断为同一个体，反之不是同一个体；对比待测样本与亲本的13个微卫星位点的基因分型，根据等位基因的遗传定律判断二者的亲子关系。
2.根据权利要求1所述用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法，其特征在于：所述提取驴的DNA：是采集驴的毛发、血液、皮肤或肌肉。
3.如权利要求1-2任一所述的检测方法用于驴的个体识别、亲子鉴定的应用。
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