CN102758026B

CN102758026B - 基于HiSeq测序技术检测乙型肝炎病毒分型和耐药基因的方法

Info

Publication number: CN102758026B
Application number: CN201210222621.5A
Authority: CN
Inventors: 韩颖鑫; 张印新; 梅严花; 王玉奇; 刘涛; 汪建
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2032-06-29
Also published as: CN102758026A

Abstract

提供了HBV核酸样本突变位点类型的检测方法、PCR引物、标签引物及其试剂盒。其中，确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法包括：使用第一引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物；对所述第一扩增产物进行测序；基于测序结果，确定HBV核酸样本中是否存在突变，其中，所述第一引物组包含第一引物和第二引物，所述第一引物具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述第二引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述第一引物的5’端进一步包含第一标签序列，所述第二引物的5’端进一步包含第二标签序列。利用该方法能够有效确定HBV核酸样本中是否存在突变。

Description

基于HiSeq测序技术检测乙型肝炎病毒分型和耐药基因的方法

技术领域

本发明属于基因组学和分子生物学中有机生物分子领域，具体而言涉及HBV核酸样本突变位点类型的检测方法、PCR引物、标签引物及其试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重的全球公共卫生问题之一，全球约3.5-4亿人感染HBV，每年大约有100万人死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。目前，用于HBV治疗的主要有两种药物：干扰素和核苷酸类药物。随着核苷酸类似物在临床上广泛应用于治疗慢性乙型肝炎，HBV的耐药问题日益凸显，已经成为临床上制约抗病毒疗效的重要原因。而且感染不同的HBV型别其临床表现和预后也有所不同，所以对乙肝患者进行HBV分型和耐药基因的检测对指导临床用药有重要意义。

然而，目前对乙肝患者进行HBV分型和耐药基因的检测手段仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个方面，提出了一种确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法，包括下列步骤：使用第一引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物；对第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果；以及基于测序结果，确定HBV核酸样本中是否存在突变，其中，第一引物组包含第一引物和第二引物，第一引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，第二引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，第一引物的5’端进一步包含第一标签序列（即正向标签），第一标签序列具有选自如SEQ ID NO：5-52至少之一所示的核苷酸序列，第二引物的5’端进一步包含第二标签序列（即反向标签），第二标签序列具有选自如SEQ ID NO：53-100至少之一所示的核苷酸序列。由此，能够有效地确定HBV核酸样本中突变位点的类型，并且能够同时对多种核酸样本进行分析。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供一组PCR引物，其包含第一引物和第二引物，其中第一引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，第二引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，其中，第一引物的5’端进一步包括第一标签序列（即正向标签），第一标签序列具有选自如SEQ ID NO：5-52至少之一所示的核苷酸序列，第二引物的5’端进一步包含第二标签序列（即反向标签），第二标签序列具有选自如SEQ ID NO：53-100至少之一所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，上述引物组还进一步包括第三引物和第四引物，第三引物具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，第四引物具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。利用根据本发明实施例的引物组，能够有效地实施前述确定HBV核酸样本中突变位点的类型的方法，进而能够用于有效地确定HBV核酸样本中突变位点的类型，并且能够同时对多种核酸样本进行分析。

根据本发明的另一方面，本发明还提供一组分离的寡核苷酸，由SEQ ID NO：5-100所示的寡核苷酸构成。利用这些寡核苷酸可以作为标签，可以有效地用于高通量测序，从而能够有效地利用高通量测序平台，同时对多种样本进行测序，并通过预知的标签的核苷酸序列对所得到测序结果的来源进行区分。

根据本发明的另一方面，本发明还提供一种试剂盒，其包括上述引物组或寡核苷酸组，同时，本发明还提供该试剂盒在检测HBV基因的核苷酸突变中的用途。利用根据本发明实施例的试剂盒，能够有效地实施前述确定HBV核酸样本中突变位点的类型的方法，进而能够用于有效地确定HBV核酸样本中突变位点的类型，并且能够同时对多种核酸样本进行分析。

根据本发明的另一方面，本发明还提供一种确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：扩增装置，所述扩增装置中设置有前述的一组PCR引物，用于对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物；测序装置，所述测序装置与所述扩增装置相连，并且适于对所述第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果；以及分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，用于对基于所述测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。利用根据本发明实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统，能够有效地实施前述确定HBV核酸样本中突变位点的类型的方法，进而能够用于有效地确定HBV核酸样本中突变位点的类型，并且能够同时对多种核酸样本进行分析。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明一个实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法的流程示意图；以及

图2是根据本发明一个实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统的结构示意图。

发明详细描述

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

核酸标签

根据本发明的一个方面，本发明提供了一组核酸标签（在本文中有时也称为“分离的寡核苷酸”）。根据本发明的实施例，这些核酸标签分别为SEQ ID NO：5-100所示。在本说明书中，这48对核酸标签分别被命名为PI-N，其中N=1-48中的任意整数，其序列如下表1：

表1标签引物的序列

Index编号	正向index(SEQID NO：)	反向index(SEQID NO：)
			PI-1	ATACTA（5）	CAGTCT（53）
PI-2	CATGTG（6）	CTGAGA（54）
			PI-3	TCGATC（7）	TCTCGT（55）
PI-4	GTAGTG（8）	TCTACG（56）
			PI-5	ACATCA（9）	AGATGA（57）
PI-6	ATGTCG（10）	GACTGT（58）
			PI-7	CACACT（11）	GAGCAG（59）
PI-8	CAGATA（12）	CGTGCA（60）
			PI-9	GCAGCT（13）	ATACGT（61）
PI-10	GTGACA（14）	GCTCGA（62）
			PI-11	CTCATA（15）	CGCTAC（63）
PI-12	ATGCTC（16）	ATGAGT（64）

PI-13	CGTCTC（17）	GTGCGA（65）
			PI-14	TCGTGA（18）	CTACGA（66）
PI-15	ACGCTG（19）	TCTGCT（67）
			PI-16	ATCATC（20）	CAGAGT（68）
PI-17	TGACTC（21）	CTCTGA（69）
			PI-18	AGCATG（22）	TGTATG（70）
PI-19	TAGTAC（23）	AGTGAG（71）
			PI-20	GATATC（24）	TCATGT（72）
PI-21	ACATAG（25）	ACAGTA（73）
			PI-22	GATACG（26）	GCGACG（74）
PI-23	CGTCGA（27）	TGCATA（75）
			PI-24	ACACTC（28）	CTGCTA（76）
PI-25	CTATGC（29）	GTCAGT（77）
			PI-26	GCGATA（30）	ACGACA（78）
PI-27	ACTAGT（31）	AGTCTA（79）
			PI-28	CGTACT（32）	AGATCT（80）
PI-29	CTCTAG（33）	GAGTAT（81）
			PI-30	AGTATC（34）	TACTGC（82）
PI-31	AGAGAC（35）	ACACAT（83）
			PI-32	ATGTGA（36）	TACGTA（84）
PI-33	GCTGCG（37）	GATCGC（85）
			PI-34	TAGAGC（38）	GCGTGT（86）
PI-35	ATGCAG（39）	GAGTGC（87）
			PI-36	CGACAC（40）	CGCAGA（88）
PI-37	GTGTCT（41）	CATCAC（89）
			PI-38	GTGCTG（42）	CACGCA（90）
PI-39	CTGACT（43）	ACTGCA（91）
			PI-40	CTCGAC（44）	CTCGTG（92）
PI-41	CGTGAC（45）	GTAGAC（93）
			PI-42	TCGCTA（46）	GACGAT（94）

PI-43	GCTCTC（47）	TATGAC（95）
			PI-44	GTCATG（48）	GTGAGC（96）
PI-45	CTGTGT（49）	TACGAG（97）
			PI-46	GCAGAG（50）	ATAGCT（98）
PI-47	TATCAG（51）	GTATGT（99）
			PI-48	CTAGTA（52）	GATCTA（100）

在本发明中所使用术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA。利用根据本发明实施例的核酸标签，通过将核酸标签与DNA相连，可以精确地表征DNA的样品来源。由此，利用上述核酸标签，可以同时构建多种DNA样品的用于测序的DNA文库，从而可以通过将来源于不同样品的DNA文库进行混合，同时进行测序，基于核酸标签对DNA序列进行分类，获得多种DNA的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术，例如利用Hiseq2000测序技术，同时对多种DNA进行测序的高通量，从而提高DNA测序的效率和通量，降低了DNA测序成本。这里所使用的表述方式“核酸标签与DNA相连”的意思是，核酸标签可以与DNA直接相连，以构建DNA文库。

为了实现能够有效构建DNA文库并进行测序，所构建的一组核酸标签需要能够保证结果可靠，可重复性高。即针对同样的DNA样品，可以保证利用该组核酸标签中的不同标签构建的DNA文库，能够获得一致的测序结果，因而可以确保实验结果可靠且重复性高。

本发明的发明人发现：在将携带标签的测序文库进行混合的情况下，必须考虑到混合后的标签上的每个碱基位点的GT含量。因为在高通量测序，例如在Hiseq2000测序过程中，碱基G和T的激发荧光一样，碱基A和C的激发光是一样的，因此必须考虑碱基“GT”含量与碱基“AC”含量的“平衡”，最适碱基“GT”含量为50％，能保证标签识别率最高和错误率最低。另外，还需要同时避免标签序列出现3或3个以上连续的碱基的出现，因为3个或3个以上连续的碱基会增加序列在合成过程中或测序过程中的错误率，标签序列本身嵌入PCR引物或接头中，也要尽可能的避免出现发夹结构或与测序引物及其反向互补序列相同的现象。

为此，本发明的发明人进行了大量的筛选工作，并且选定了根据本发明实施例的一组分离的核酸标签，即分别具有SEQ ID NO:5-100所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，所筛选出的这些核酸标签，能够确保数据的准确性和可重复性，并且利用根据本发明实施例的一组分离的核酸标签，即分别具有SEQ ID NO:5-100所示的核苷酸序列，不仅能灵活应用于DNA样品的测序，也能提高目前DNA样品的测序通量，而且保证了数据产出的可重复性和准确性。另外，根据本发明的实施例，发明人将利用不同核酸标签构建的文库与利用标准的无标签构建的测序文库进行比较，发现各个核酸标签的Pearson系数均在0.99左右，本领域技术人员能够理解，两者重复性越高，则其pearson系数越接近1。

高通量测序，例如HiSeq测序技术具有以下优势：（1）高灵敏度：高通量测序，例如HiSeq的测序通量大，目前一个实验流程下来可以产生600G（6000亿）碱基的数据，高的数据通量可以在测序序列数确定的情况下，使得每条序列获得高的测序深度，所以可以检测到只占病毒总体1%的突变株。同时因其测序深度高，其测序结果也更为可靠。（2）高通量，低成本：利用根据本发明实施例的标签，通过一次测序可以检测上万份样本，从而大大降低了成本。作为例子，假设40个样品，每个样品的构建文库的成本大约为200元。那么40个样品就是200X40=8000。如果采用本发明的标签序列，则可以将40个样品混合在一起进行构架文库，则其费用就是200。构建文库是一个耗时间耗人力的工作，所以这样既减少了试剂的费用，又在减少时间和人力消耗。

在本文中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代或单分子测序技术。第二代测序平台包括但不限于Illumina-Solexa（GA^TM,HiSeq2000^TM等）、ABI-Solid和Roche-454（焦磷酸测序）测序平台；单分子测序技术包括但不限于Helicos公司的真实单分子测序技术（True Single Molecule DNA sequencing）,Pacific Biosciences公司单分子实时测序（singlemolecule real-time(SMRT^TM)），以及Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔测序技术等（Rusk,Nicole(2009-04-01).Cheap Third-Generation Sequencing.Nature Methods6(4):244-245）。随着测序技术的不断进化，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他的测序方法和装置进行全基因组测序。根据本发明的具体示例，可以将根据本发明实施例的核酸标签用于利用选自Illumina-Solexa、ABI-SOLiD、Roche-454和单分子测序装置的至少一种进行测序。

确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法

根据本发明的实施例，将核酸标签引入到测序文库中的方法并不受特别限制。既可以在构建文库的过程中，按照常规方法，将标签引入到测序文库中。根据本发明的实施例，可以在对待测序的核酸样品进行预处理，通过PCR扩增的方法，将标签引入到扩增产物中，之后通过常规的构建文库的方法，针对所得到的含有标签的扩增产物构建测序文库，从而得到含有标签的测序文库。由此，可以在对多种核酸样品进行扩增之后，就可以混合在一起，进行文库构建，从而容易获得含有各自核酸标签的多种核酸样本的测序文库。

由此，在本发明的又一方面，本发明提出了确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法。

参考图1，根据本发明的实施例，该方法包括：

S100：使用第一引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物。

根据本发明的实施例，第一引物组包含第一引物和第二引物，第一引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，第二引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，并且第一引物的5’端进一步包含第一标签序列（即正向标签），所述第一标签序列具有选自如SEQ ID NO：5-52至少之一所示的核苷酸序列，第二引物的5’端进一步包含第二标签序列（即反向标签），所述第二标签序列具有选自如SEQ ID NO：53-100至少之一所示的核苷酸序列。由此，通过本发明的第一引物和第二引物能够有效地将核酸标签引入到扩增产物中，进而能够同时对多种HBV核酸样本进行分析，充分利用高通量测序仪器的测序能力，从而有效地降低了分析HBV核酸样本的成本。并且利用这些引物，能够检测的突变位点为选自rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I和rtM250V/I/L的至少一种。

根据本发明的实施例，HBV核酸样本的来源并不受特别限制。根据本发明的一些具体实施例，HBV核酸样本是从HBV的宿主中分离的。根据本发明的进一步的实施例，优选HBV核酸样本是从乙肝患者血清样本中分离的。由此，可以有效地对乙肝患者的HBV核酸样本进行分型。

根据本发明的实施例，在使用第一引物组进行扩增之前，可以首先使用第二引物组对HBV核酸进行扩增，并将所得到的扩增产物进行使用第一引物组的扩增。由此，使用第一引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物进一步包括：

首先，使用第二引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第二扩增产物；以及

接着，在得到第二扩增产物之后，使用第一引物组，对所述第二扩增产物进行扩增，以便得到所述第一扩增产物。根据本发明的实施例，所述第二引物组包括第三引物和第四引物，所述第三引物具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述第四引物具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。由此，可以针对量非常少的HBV核酸样本进行有效的扩增，从而提高了扩增效率，进而提高了确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法的效率。其中，上述各引物的序列如下表2所示：

表2引物序列

引物名称	序列（SEQ ID NO:）
		第一引物	5’-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3’(1)
第二引物	5’-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3’(2)

第三引物	5’-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3’(3)
		第四引物	5’-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’(4)

根据本发明的实施例，在得到第一扩增产物之后，可以对第一扩增产物进行纯化。例如，根据本发明的实施例，进一步包括通过选自琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所得到的第一扩增产物。

S200：对所述第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果。

根据本发明的实施例，在得到第一扩增产物之后，对第一扩增产物进行测序可以进一步包括：针对所述第一扩增产物，构建测序文库；以及对所述测序文库进行测序，以便得到所述测序结果。根据本发明的实施例，可以进行测序的方法和设备，并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用选自Hiseq2000、SOLID、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。由此，可以充分利用这些测序技术的高通量测序能力，从而可以极大地降低测序的成本，提高测序的效率。

根据本发明的实施例，针对第一扩增产物构建测序文库的方法并不受特别限制。可以根据测序平台的制造商所提供的操作手册来进行。例如，根据本发明的一个实施例，针对第一扩增产物，构建测序文库进一步包括：

首先，将第一扩增产物片段化，以便得到DNA片段。根据本发明的实施例，进行片段化的手段并不受特别限制。根据本发明的实施例，通过选自化学打断方法和物理打断方法的至少一种将所述第一扩增产物片段化，其中所述化学方法包括酶切方法，所述物理打断方法包括超声波打断方法和机械打断方法。

接下来，在得到DNA片段之后，对DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段。根据本发明的实施例，末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，其中，Klenow片段具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性，但缺少5’-3’外切酶活性。

在得到经过末端修复的DNA片段之后，对经过末端修复的DNA片段进行3’端添加碱基A，以便获得3’末端添加碱基A的DNA片段。根据本发明的实施例，可以利用Klenow（3’-5’exo-）对所述经过末端修复的DNA片段进行3’端添加碱基A。

之后，将所得到的3’末端添加碱基A的DNA片段与接头相连，以便获得连接产物。根据本发明的实施例，将所述3’末端添加碱基A的DNA片段与接头相连是利用T4DNA连接酶进行的。

在得到连接产物之后，对连接产物进行PCR扩增，以便获得第三扩增产物。

最后，将所得到的第三扩增产物进行纯化回收，以便获得回收产物，所述回收产物构成所述测序文库。根据本发明的实施例，可以通过琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种纯化回收第三扩增产物。

S300：基于所述测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。

根据本发明的实施例，在得到测序结果之后，可以通过将测序结果与参照序列进行比对，以便确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。可以采用的参照序列可以为HBV全基因组序列。根据本发明的实施例，可以用于检测的突变位点为选自rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I和rtM250V/I/L的至少一种。

PCR引物和试剂盒

本发明还提出了一组PCR引物。根据本发明的实施例，该组PCR引物包含第一引物和第二引物，所述第一引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述第二引物具有SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列，其中，第一引物的5’端进一步包括第一标签序列（即正向标签），所述第一标签序列具有选自如SEQ ID NO：5-52至少之一所示的核苷酸序列，所述第二引物的5’端进一步包含第二标签序列（即反向标签），所述第二标签序列具有选自如SEQ IDNO：53-100至少之一所示的核苷酸序列。由此，利用该组PCR引物，可以有效地实施前述确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法。关于该方法的优点和特征，前面已经进行了详细描述，不再赘述。

根据本发明的实施例，该组PCR引物还可以进一步包括第三引物和第四引物，所述第三引物具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述第四引物具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。由此，可以利用该组PCR引物有效地对少量核酸样本进行扩增，进而实施前述确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法。

根据本发明的实施例，本发明还提出了一种试剂盒，该试剂盒包含前面所述的PCR引物。该试剂盒可以有效地实施前述确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法。关于该方法的优点和特征，前面已经进行了详细描述，不再赘述。

由此，本发明还提出了前面所述试剂盒在检测HBV基因的核苷酸突变中的用途。根据本发明的实施例，该试剂盒可以检测的突变为选自rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I和rtM250V/I/L的至少一种。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种用于HBV检测的试剂盒，其包括：5种标签引物，所述5种标签引物分别由SEQ ID NO：1-4所示的核苷酸构成，或48对核酸标签，所述核酸标签分别由SEQ ID NO：5-100所示的核苷酸构成。当然，本领域技术人员能够理解，试剂盒中还可以包含其他常用试剂，在此不再赘述。

确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统

参考图2，本发明还提出了一种确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统1000。根据本发明的实施例，该系统1000包括：扩增装置100、测序装置200和分析装置300。

根据本发明的实施例，扩增装置100中设置有前面所示的一组PCR引物，用于对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物。根据本发明的实施例，还可以进一步包括核酸分离装置（图中未示出），该核酸分离装置适于从HBV的宿主分离HBV核酸样本，由此可以为扩增装置100提供用于检测的核酸样本。

根据本发明的实施例，测序装置200与扩增装置100相连，并且适于对第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果。根据本发明的实施例，测序装置的类型并不受特别限制。根据本发明的实施例，测序装置可以为选自Hiseq2000、SOLID、454和单分子测序装置的至少一种。

根据本发明的实施例，分析装置300与测序装置200相连，用于对基于测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。如前所述，可以通过比对，确定是否存在突变。根据本发明的实施例，分析装置进一步包括比对单元，所述比对单元中存储有参照序列，用于将所述测序结果与参照序列进行比对，以便确定所述HBV核酸样本是否存在突变。

利用根据本发明实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统，能够有效地实施前述确定HBV核酸样本中突变位点的类型的方法，进而能够用于有效地确定HBV核酸样本中突变位点的类型，并且能够同时对多种核酸样本进行分析。

需要说明的是，前面针对标签、引物、试剂盒以及确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法所描述的特征和优点，也适用确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例是采用HiSeq测序技术对病人血清中HBV样品进行检测的，具体操作步骤如下：

1、对于该突变位点的测序检测，我们检测的耐药位点包括：rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I、rtM250V/I/L。

首先，根据乙肝病毒基因组的序列(NCBI登录号：NC_003977)，设计了一对基础PCR扩增引物：

上游引物：5’-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3’(SEQ ID NO：1)（在本文中有时也成为“第一引物”）；

下游引物：5’-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3’(SEQ ID NO：2)（在本文中有时也成为“第二引物”）。

在上述基础PCR引物前分别加上48对Index引物用于区分每个样品，48对Index引物序列见下表3：

表348对Index引物序列

其中，针对拷贝数低的样品（样本量小），我们设计了巢式PCR引物即两对PCR引物：

第一轮PCR引物为：

上游引物：5’-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物：5’-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’(SEQ ID NO：4)，

第二轮PCR引物为：

上游引物：5’-正向Index引物-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物：5’-反向Index引物-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3’(SEQ ID NO：2)。

2、HBV-DNA的提取

按说明书操作，用TIANamp病毒基因组DNA提取试剂盒提取乙肝患者血清样本中的HBV-DNA。

3、PCR扩增反应

（1）针对样本量较多的样品，利用上述基础的Index引物对提取的HBV-DNA进行PCR扩增反应，其中PCR扩增反应体系的配置见表4：

表4

PCR反应条件为：94℃，5min；94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸90s，共扩增40个循环；最终72℃延伸5min。由此，获得PCR扩增产物。

（2）针对拷贝数低的样品，进行巢式PCR反应：

其中，第一轮PCR扩增反应体系的配置见表5：

表5

反应条件为：94°C，5min；94°C变性45s，54°C退火45s，72°C延伸90s，共扩增40个循环；最终72°C延伸5min。由此，获得第一轮PCR产物。

然后，以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR反应。第二轮PCR扩增反应体系的配置见表6：

表6

反应条件为：94°C，5min；94°C变性45s，58°C退火45s，72°C延伸90s，共扩增40个循环；最终72°C延伸5min。由此，获得PCR扩增产物。

4、电泳检测

利用1.5%的琼脂糖凝胶将上述获得的PCR扩增产物进行电泳检测，其中需PCR扩增产物5μL，电压140伏，电泳25分钟，然后EB染胶15分钟，采用凝胶成像系统拍照检测。

5、PCR扩增产物汇集和磁珠纯化

将每个样本的PCR扩增产物各取5微升，混合到一个EP管内，然后按照QIAGEN纯化试剂盒的说明书将PCR产物进行纯化。

6、样品打断和建库

（1）样品打断：

将经过纯化的PCR扩增产物转到打断管内，在Covaris单管打断仪上进行打断，以便获得DNA片段，其中打断条件为：强度为4，60s，3个循环。然后用QIAGEN纯化试剂盒进行纯化。

（2）建库：

利用上述获得的DNA片段，按照以下步骤进行建库：

①末端修复：反应体系如下：

②末端添加碱基A：反应体系如下：

③加接头：反应体系如下：

由此，获得各个测序文库。

7、2100和QPCR检测

利用Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent公司）和荧光定量PCR（QPCR）对获得的各测序文库进行检测，结果如下：

8、上机测序

以2100所测浓度为准，将上述经过检测的2个文库各取10pmolDNA等摩尔混在一起，用HiSeq Index PE101+8+101cycle程序测序，以便获得测序结果，具体操作流程详见HiSeq操作说明书。

9、数据分析

通过计算机对上述获得的测序结果中的adapter index、primer index以及primer的序列信息进行筛选，以便获得每个样本的DNA序列信息，然后将所得DNA序列与HBV数据库进行比对，最终成功地对每一份样本进行HBV检测并分型，并找出了耐药检测位点，观察到突变情况，具体结果见下表：

备注：“-”表示耐药阴性

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种非诊断目的的确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法，其特征在于，包括下列步骤：

使用第一引物组，分别对48个HBV核酸样本进行扩增，以便得到48份第一扩增产物，

其中，

所述第一引物组由第一引物和第二引物组成，所述第一引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述第二引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，

针对每一个HBV核酸样本，所述第一引物的5’端和所述第二引物的5’端进一步携带有如下表1所示具有SEQ ID NO：5-100所示核苷酸序列的48对标签序列的其中之一，且所述48个HBV核酸样本的标签序列相互不同，以便区分每一个HBV核酸样本；

将所述48份第一扩增产物混合后进行测序，以便得到测序结果；以及

基于所述测序结果和所述标签序列，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。

表1

Index编号正向index（SEQ ID NO：）反向index（SEQ ID NO：） PI-1 ATACTA（5） CAGTCT（53） PI-2 CATGTG（6） CTGAGA（54） PI-3 TCGATC（7） TCTCGT（55） PI-4 GTAGTG（8） TCTACG（56） PI-5 ACATCA（9） AGATGA（57） PI-6 ATGTCG（10） GACTGT（58） PI-7 CACACT（11） GAGCAG（59） PI-8 CAGATA（12） CGTGCA（60） PI-9 GCAGCT（13） ATACGT（61） PI-10 GTGACA（14） GCTCGA（62） PI-11 CTCATA（15） CGCTAC（63） PI-12 ATGCTC（16） ATGAGT（64） PI-13 CGTCTC（17） GTGCGA（65） PI-14 TCGTGA（18） CTACGA（66） PI-15 ACGCTG（19） TCTGCT（67）

PI-16 ATCATC（20） CAGAGT（68） PI-17 TGACTC（21） CTCTGA（69） PI-18 AGCATG（22） TGTATG（70） PI-19 TAGTAC（23） AGTGAG（71） PI-20 GATATC（24） TCATGT（72） PI-21 ACATAG（25） ACAGTA（73） PI-22 GATACG（26） GCGACG（74） PI-23 CGTCGA（27） TGCATA（75） PI-24 ACACTC（28） CTGCTA（76） PI-25 CTATGC（29） GTCAGT（77） PI-26 GCGATA（30） ACGACA（78） PI-27 ACTAGT（31） AGTCTA（79） PI-28 CGTACT（32） AGATCT（80） PI-29 CTCTAG（33） GAGTAT（81） PI-30 AGTATC（34） TACTGC（82） PI-31 AGAGAC（35） ACACAT（83） PI-32 ATGTGA（36） TACGTA（84） PI-33 GCTGCG（37） GATCGC（85） PI-34 TAGAGC（38） GCGTGT（86） PI-35 ATGCAG（39） GAGTGC（87） PI-36 CGACAC（40） CGCAGA（88） PI-37 GTGTCT（41） CATCAC（89） PI-38 GTGCTG（42） CACGCA（90） PI-39 CTGACT（43） ACTGCA（91） PI-40 CTCGAC（44） CTCGTG（92） PI-41 CGTGAC（45） GTAGAC（93） PI-42 TCGCTA（46） GACGAT（94） PI-43 GCTCTC（47） TATGAC（95） PI-44 GTCATG（48） GTGAGC（96） PI-45 CTGTGT（49） TACGAG（97）

PI-46 GCAGAG（50） ATAGCT（98） PI-47 TATCAG（51） GTATGT（99） PI-48 CTAGTA（52） GATCTA（100）

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HBV核酸样本是从HBV的宿主中分离的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述HBV核酸样本是从乙肝患者血清样本中分离的。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用第一引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物进一步包括：

使用第二引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第二扩增产物；以及

使用第一引物组，对所述第二扩增产物进行扩增，以便得到所述第一扩增产物，

其中，

所述第二引物组由第三引物和第四引物组成，所述第三引物具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述第四引物具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括通过选自琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所述第一扩增产物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果进一步包括：

针对所述第一扩增产物，构建测序文库；以及

对所述测序文库进行测序，以便得到所述测序结果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用选自Hiseq2000、SOLID、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，针对所述第一扩增产物，构建测序文库进一步包括：

将所述第一扩增产物片段化，以便得到DNA片段；

对所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；

对所述经过末端修复的DNA片段进行3’端添加碱基A，以便获得3’末端添加碱基A的DNA片段；

将所述3’末端添加碱基A的DNA片段与接头相连，以便获得连接产物；

对所述连接产物进行PCR扩增，以便获得第三扩增产物；以及

将所述第三扩增产物进行纯化回收，以便获得回收产物，所述回收产物构成所述测序文库。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过选自化学打断方法和物理打断方法的至少一种将所述第一扩增产物片段化，其中所述化学方法包括酶切方法，所述物理打断方法包括超声波打断方法和机械打断方法。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，所述Klenow片段具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性，但缺少5’-3’外切酶活性。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用Klenow（3’-5’exo-）对所述经过末端修复的DNA片段进行3’端添加碱基A。

12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述3’末端添加碱基A的DNA片段与接头相连是利用T4DNA连接酶进行的。

13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种纯化回收所述第三扩增产物。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于所述测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变进一步包括：

将所述测序结果与参照序列进行比对，以便确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变为选自rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I和rtM250V/I/L的至少一种。