CN105648099A

CN105648099A - 基于焦磷酸测序技术的乙型肝炎病毒（hbv）耐药性基因检测技术

Info

Publication number: CN105648099A
Application number: CN201610176527.9A
Authority: CN
Inventors: 陈华; 刘小青; 隋少飞
Original assignee: Cage Biological Engineering (shenzhen) Co Ltd
Current assignee: Cage Biological Engineering (shenzhen) Co Ltd
Priority date: 2016-03-25
Filing date: 2016-03-25
Publication date: 2016-06-08

Abstract

本发明涉及基于焦磷酸测序技术的乙型肝炎病毒（HBV）耐药性基因检测技术。具体而言，本发明涉及用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的测序引物。本发明还涉及包含测序引物的用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的试剂盒和微阵列。本发明还涉及测序引物在制备用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的试剂盒和微阵列中的用途。本发明还涉及使用测序引物检测样品中的乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的方法。

Description

基于焦磷酸测序技术的乙型肝炎病毒（ HBV ）耐药性基因检测技术

技术领域

背景技术

乙型肝炎病毒（HBV）感染已成为全球严重的公共卫生问题，严重危害着人类的健康。全球约有20亿HBV感染者，其中约有4亿将发展为乙肝，全球每年约有60万人死于与HBV感染相关的疾病。目前，广泛应用的抗HBV药物主要有两类，即α2干扰素和核苷类药物。核苷类药物中主要是拉米夫定和伐昔洛韦。拉米夫定是近年新发现的具有抗HBV作用的核苷类药物，适用于体内HBV复制活跃且滴度较高的慢性乙型肝炎患者的治疗，包括部分对干扰素禁忌或干扰素治疗无效的患者。但该类药物需要长期服用，且易产生耐药，其中最主要的是长期服用该药可引起编码HBV DNA聚合酶的P基因变异。

临床上HBV治疗药物耐药研究：

拉米夫定是目前应用最广、时间最长的药物，其主要的耐药突变位点有rt204、rt180。耐药的分子机制可能为rt204位点参与形成了拉米夫定与聚合酶的结合部位，rt204突变后降低了拉米夫定与dNTP底物的亲和力，降低突变株的复制力，从而降低拉米夫定的抗病毒作用。其他突变位点有rt169、rt173、rt180、rt184等。

阿德福韦酯属于无环嘌呤类核苷酸类似物。相关的耐药突变多为多点突变，主要耐药位点有rt181、rt236。

恩替卡韦对初治患者很少发生耐药，但在拉米夫定失效患者中耐药发生率明显增加。恩替卡韦耐药变异需要在rt204+rt180位突变的基础上，再联合rt184、rt202、rt250和rt169位点上一个或多个氨基酸突变。

替比夫定与拉米夫定耐药基因序列相似，但其耐药发生率更低。耐药突变位点为rt204。

替诺福韦是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，有报道称其耐药与rt194变异有关，能改变DNA与dNTP底物的结合位点，从而影响DNA合成。

现已有多种生物学检测技术应用于HBV基因变异检测，如聚合酶链反应-逆向点杂交、PCR-限制性片断长度多态性、基因芯片、限制性片段质谱多态性技术、实时PCR、PCR产物直接测序等。

聚合酶链反应-逆向点杂交操作繁琐，成本高。PCR-限制性片断长度多态性分析只能分析已知序列特异位点的基因突变，且有些耐药突变很难找到合适的限制性内切酶，因此检测的突变类型有限。基因芯片样本的制备和标记较繁琐，仪器昂贵，检测成本高。限制性片段质谱多态性技术也只能分析已知序列且价格昂贵。实时PCR需要针对每个位点设计探针，随着耐药位点增多，成本增高。同时一些非测序方式需要依赖酶切或聚类的方式判读患者的基因突变情况，存在较大的分型错误的几率。直接测序虽然准确度高，但测序反应产生的DNA片段需要经过毛细管电泳分离，其后由检测系统检测荧光信号，耗时较长且检测成本较高。

焦磷酸测序法可对一定长度内序列进行实时定量分析，其重复性和精确性能与Sanger测序媲美，而检测速度大大提高，检测成本明显降低。此外，焦磷酸测序技术的检测灵敏度也远高于Sanger测序。目前该技术已广泛应用于微生物鉴定及分法医学鉴、遗传学分析、SNP检测等方面。因此，焦磷酸测序技术在HBV基因变异检测的应用与推广将具有极大价值与潜力。

然而，目前尚没有商业化实现焦磷酸测序技术在乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变检测的方案。

发明内容

本发明一方面涉及用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的测序引物，所述测序引物包含至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25以及它们的任意组合。在一个实施方案中，所述测序引物具有至少一个选自以下的核苷酸序列，或者由或基本由至少一个选自以下的核苷酸序列组成：SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25以及它们的任意组合。在另一个实施方案中，所述测序引物针对的靶标序列为选自以下的序列：SEQ ID NO: 6、10、14、20、24和28以及它们的任意组合。

本发明一方面涉及用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的测序引物组，所述测序引物组包括：

包含或具有选自SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25之一的核苷酸序列的测序引物，和

包含或具有选自SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25的另外一个、另外两个、另外三个、另外四个或全部另外五个的核苷酸序列的测序引物。

本发明另一方面涉及一种用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的试剂盒或微阵列，其包含本发明的测序引物或测序引物组。本发明另一方面涉及本发明的测序引物或测序引物组在制备用于基于焦磷酸测序技术检测样品中的乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的试剂盒或微阵列中的用途。

在一个实施方案中，所述试剂盒或微阵列还包含至少一种选自以下的引物组：

1）引物组1，其包含具有由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的引物；和

2）引物组2，其包含具有由SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列的引物。

在一个实施方案中，所述试剂盒或微阵列还包含表明至少一种选自以下的待分析序列和分配顺序的说明书：

1）由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序；

2）由SEQ ID NO: 8所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 9所示的分配顺序；

3）由SEQ ID NO: 12所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 13所示的分配顺序；

4）由SEQ ID NO: 18所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 19所示的分配顺序；

5）由SEQ ID NO: 22所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 23所示的分配顺序；和

6）由SEQ ID NO: 26所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 27所示的分配顺序。

本发明还涉及一种基于焦磷酸测序技术检测样品中的乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的方法，所述方法包括：

(1)提取和任选纯化样品中的DNA，

(2)将提取和任选纯化的DNA进行扩增，从而获得扩增产物，

(3)对步骤(2)的扩增产物进行焦磷酸测序。

在一个实施方案中，所述焦磷酸测序使用本发明的测序引物或测序引物组进行。在另一个实施方案中，所述扩增为PCR扩增，优选所述PCR扩增使用本发明的引物组。在又一个实施方案中，检测样品中的乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的方法可不用于诊断受试者的耐药性，例如可用于检测体外培养中的乙型肝炎病毒是否变异，可用于检测环境来源的乙型肝炎病毒样品是否具有耐药性。

在一个实施方案中，所述焦磷酸测序还使用至少一种选自以下的待分析序列和分配顺序：

在一个实施方案中，所述样品为生物样品，优选所述样品为体液样品或组织样品，和更优选所述样品选自活组织检查样品、细胞培养物、经固化处理的样品（如石蜡包埋样品）、全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、粪便、分泌液、乳汁、腹膜液。

附图说明

图 1为焦磷酸测序的一个技术流程及各主要元素示意图。

图 2为使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 3)对野生型质粒rt173和rt169位点处的基因突变检测结果的一个截图(所检测样本为0%突变比例理论值的基因野生型质粒)，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。

图 3为使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 7)对野生型质粒rt184、rt181和rt180位点处的基因突变检测结果的一个截图(所检测样本为0%突变比例理论值的野生型质粒)，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。

图 4为使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 11)对野生型质粒rt194位点处的基因突变检测结果的一个截图(所检测样本为0%突变比例理论值的野生型质粒)，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。

图 5为使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 17)对野生型质粒rt204和rt202位点处的基因突变检测结果的一个截图(所检测样本为0%突变比例理论值的野生型质粒)，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。

图 6为使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 21)对野生型质粒rt236位点处的基因突变检测结果的一个截图(所检测样本为0%突变比例理论值的野生型质粒)，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。

图 7为使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 25)对野生型质粒rt250位点处的基因突变检测结果的一个截图(所检测样本为0%突变比例理论值的野生型质粒)，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。

图 8为使用包括本发明的测序引物在内的测序体系所检测到的rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250位点处的基因突变的检测值与理论值相比较的曲线图。

图 9为使用本发明表3所示各测序引物对临床来源的样本的测序结果的截图。图9A：rt173和rt169位点，图9B：rt184、rt181和rt180位点，图9C：rt194位点，图9D：rt204和rt202位点，图9E：rt236位点，和图9F：rt250位点。

图10为对野生型质粒rt204/202位点使用不同测序引物的测序结果图。

具体实施方式

参考用于说明的示例应用在下文中描述本发明的数个方面。应当理解的是，陈述许多具体细节、关系和方法来提供对本发明的充分理解。然而，在相关领域的普通技术人员将容易地认识到，可在不含一个或多个具体细节的情况下实施本发明或者可用其他方法来实施本发明。

本发明目的在于解决现有技术中对乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的检测的缺点，例如较大的分型错误、耗时较长或检测成本较高。本发明通过使用本发明的测序引物的焦磷酸测序技术而解决了上述问题。

使用本发明的测序引物的焦磷酸测序技术具有以下优点：

1）仪器及试剂通过系统优化，可达到最优的检测效果，且易标准化；

2）检测结果自动由软件给出，避免结果判断主观性；

3）操作过程简便且省时，检测全程190分钟，其中仪器自动运行时间170分钟，手工操作时间20分钟；

4）检测灵敏度可低至5%突变比例；

5）线性度高，能用于定量检测。

除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。在细胞和分子生物学中的普通术语的定义可以参见：余龙等译的基因VIII，标准书号：ISBN:978-7-03-014597-0，科学出版社出版（2005）；张瑾峰等译的细胞与分子生物学，中信出版社出版（2004），ISBN:978-7-50-860075-8；和王镜岩等编的生物化学，高等教育出版社出版（2002），ISBN:978-7-04-011088-3； Kendrew, J. 等人 (编), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd. 出版 (1994), ISBN 0-632-02182-9;和Meyers, R.A. (编), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 出版(1995), ISBN 1-56081-5698。虽然在实施本发明时可采用类似或等同于本文所述方法和材料的任何方法和材料，但是本文描述了具体的材料和方法。

样品

本发明所用的样品可以是生物来源、环境来源、医学来源或患者来源的一定量的材料。一方面，它可包括标本或培养物(例如微生物培养物)。另一方面，它也可包括但不限于生物学样品和非生物样品(例如环境样品和工业样品等)。生物学样品可包括采自受试者的材料，其包括但不限于体液样品(例如血液、血清、血浆、唾液、尿液、组织液、精液、分泌液、脓汁和呼吸液(respiratory fluid)和粘液)和组织样品(例如活组织切片等)。生物学样品可获自人受试者或其它动物。环境样品是指取自例如自然环境、生活环境、工作环境和生产环境等的样品，包括但不限于天然食物、表面物质、土壤、水。工业样品是指取自工业制品的样品，包括但不限于从加工食品和奶制品、加工设备、仪器、装置、器具、一次性用品和非一次性用品中获得的样品。这些实例不能理解为限制适用于本发明的样品类型。获自来源的样品或在预处理以改进样品特征(例如从血液制备血浆等)后的样品可直接使用。

可按照本发明进行分析和/或使用的样品包括临床来源的多核苷酸，例如DNA或RNA。

从样品中提取核酸的方法是本领域众所周知的，可用例如苯酚和氯仿进行DNA提取，或者使用市售DNA提取试剂进行提取。例如，可使用柱试剂盒(例如GENERATION (注册商标) Capture Column Kit Gentra)进行提取。

应该理解的是，核酸可通过本领域众常规的纯化方法来纯化，例如使用PrepSEQ™试剂盒(来自Applied Biosystems)和美国专利号5,234,809中的方法等等。

耐药性又称抗药性，系指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于化疗药物作用的耐受性。在本发明中，耐药性是指乙型肝炎病毒的耐药性，特别是指乙型肝炎病毒对临床上对乙型肝炎常用的药物(包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦等)的耐药性。耐药性基因在本发明的一些实施方案中是指在rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和/或rt250等突变位点上发生突变的基因。

引物

本文所用的“引物”通常指与靶序列互补和退火的线性寡核苷酸。引物长度的下限按杂交能力而定，因为非常短的引物(例如小于5个核苷酸)在大多数杂交条件下不形成热力学稳定的双链体。引物长度通常在8-50个核苷酸内变化。在某些实施方案中，引物介于大约15-25个核苷酸之间。天然存在的核苷酸(尤其是鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，在下文称为“G”、“A”、“C”和“T”)以及核苷酸类似物，都可用于本发明的引物。本文使用的术语“测序引物”是指用于起始对核酸进行的测序反应的寡核苷酸引物。

本文使用的“扩增产物”是指自核酸模板，通过核酸扩增而产生的扩增的核酸。

本文使用的“模板DNA”或“模板RNA”是指作为用于扩增的所需靶标的核酸。例如，模板RNA被逆转录为cDNA，并且该模板cDNA用于产生扩增产物。

本文使用的术语“核苷酸类似物”指与天然存在的核苷酸在结构上相似的化合物。核苷酸类似物可以具有改变的磷酸骨架、糖部分、核碱基或其组合。通常具有改变的核碱基的核苷酸类似物尤其赋予不同的碱基配对和碱基堆积特性。具有改变的磷酸-糖骨架的核苷酸类似物(例如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA))通常尤其改变链特性，例如二级结构形成。

用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的PCR引物、测序引物及靶系列的实例如表3。

本发明的PCR引物和测序引物的核苷酸序列还包括其修饰形式，只要所述引物的扩增或测序效果不受到明显的影响即可。所述修饰可以为例如在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基、在核苷酸序列中缺失一个或多个核苷酸残基、或者将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基，例如将A替换成T，将C替换成G等。本领域技术人员清楚，所述修饰形式的引物也涵盖在本发明之内、特别是权利要求的保护范围之内。在一个实施方案中，PCR引物和测序引物的核苷酸序列的修饰形式为如CN103270174A中所公开的化学增强型引物。

可以使用例如通用DNA合成仪(例如由Applied Biosystems制造的394型)，经化学方法合成本发明引物中的各个核苷酸。还可采用本领域众所周知的任何其它方法来合成寡核苷酸，例如PCR引物和测序引物。

使用从样品中提取的基因组DNA作为模板，并使用PCR引物对乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因进行扩增反应，以获得扩增产物。扩增反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCP)、自动维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和滚环扩增(RCA)，其公开于以下参考文献(在此引作参考)中：Mullis等，美国专利第4,683,195号；第4,965,188号；第4,683,202号；第4,800,159 (PCR)号；Gelfand等，美国专利第5,210,015号(用“Taqman”或”Taq” [注册商标]探针进行的实时PCR)；Wittwer等，美国专利第6,174,670号；Kacian等，美国专利第5,399,491号(“NASBA”)；Lizardi,美国专利第5,854,033号；Aono等，日本专利公开第JP 4-262799号(滚环扩增)；等等。

优选使用PCR法对靶核苷酸进行扩增。PCR法本身是本领域众所周知的。术语“PCR”包括该反应的衍生形式，其包括但不限于反转录PCR、实时PCR、嵌套式PCR、多重PCR和荧光定量PCR等。优选使用荧光定量PCR法对靶核苷酸进行定量扩增。

在引物、模板DNA和耐热DNA聚合酶存在下，使用与有义链杂交的引物(反向引物)和与反义链杂交的引物(正向引物)，通过使变性、退火和延伸步骤的循环重复大约30次～60次(例如50次)来进行PCR。在一个实施方案中，PCR为实时荧光定量PCR。在一个实施方案中PCR使用了引物组1和/或2。本领域技术人员能够理解的是，也可使用其它PCR法和引物组，只要可扩增出目标片段即可。

在本发明的PCR中，可使用各种常规的耐热DNA聚合酶进行扩增，包括但不限于FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)、Ex Taq (注册商标, Takara)、Z-Taq、AccuPrime Taq DNA聚合酶和HotStarTaq Plus DNA聚合酶。

基于引物Tm值选择合适PCR反应条件的方法是本领域众所周知的，本领域普通技术人员可以根据引物长度、GC含量、目标特异性和灵敏度、所使用的聚合酶性质等，选出最佳条件。例如，可使用以下条件进行荧光定量PCR反应：95℃ 15 分钟，95℃ 15 秒，58℃ 20 秒，72℃ 30 秒，循环50次。反应体系为40μL。

在获得PCR产物后，可对PCR产物进行处理，以获得与测序引物互补结合的单链PCR产物。单链PCR产物的产生和纯化可通过本领域周知的方法来进行。常见的产生和纯化单链PCR产物的方法包括但不限于T7逆转录法（Hughes等人, Nat. Biotechnol., 2001, 19:342-347）、核酸外切酶法（Higuchi和Ochman, Nucleic. Acids Res., 1989, 17:5865）、变性高效液相色谱法（denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC）（Dickman和Hornby, Anal. Biochem., 2000, 284:164-167）和磁珠捕获法（Espelund等人, Nucleic. Acids Res., 1990, 18:6157-6158）等。在一个实施方案中，本发明通过磁珠捕获法获得与测序引物互补结合的单链PCR产物。在另一个实施方案中，本发明通过PyroMark® Q24真空工作站按照制造商的说明书对PCR产物进行处理，以获得与测序引物互补结合的单链PCR产物。

另外，也可使用不对称PCR方法直接制备单链PCR产物，从而省去了在PCR后进行额外的处理。不对称PCR可在PCR扩增的同时制备DNA单链。常规不对称PCR使用两条不等量的引物，在开始的循环里进行正常扩增。随着循环的增加，量少的引物被逐渐耗尽，而超量的引物可继续直线扩增生成DNA单链（Gyllensten和Erlich, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85:7652-7656）。

在获得单链PCR产物后，可采用本发明的测序引物进行焦磷酸测序。在一个实施方案中，本发明的测序引物包含或具有至少一个(例如至少2、3、4、5或全部6个)选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25。当本发明的测序引物包含或具有选自SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25的2、3、4、5或全部6个核苷酸序列时，这意指选自SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25的2、3、4、5或全部6个测序引物组合使用以检测多个靶基因的耐药性，例如包含或具有SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的测序引物与包含或具有SEQ ID NO: 7、11、17、21和/或25的核苷酸序列的测序引物组合使用。

本发明的测序引物可以任意组合，以针对样品中的不同靶基因进行测序，例如SEQ ID NO: 3可与SEQ ID NO: 7、11、17、21和/或25组合，SEQ ID NO: 7可与SEQ ID NO: 3、11、17、21和/或25组合，SEQ ID NO: 11可与SEQ ID NO: 3、7、17、21和/或25组合，以此类推。因此，在一个实施方案中，本发明的测序引物可包含或具有选自SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25之一的核苷酸序列，并任选包含或具有选自SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25的另外一个、另外两个、另外三个、另外四个或全部另外五个的核苷酸序列；例如本发明的测序引物可包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列以及任选包含至少一个(例如至少2、3、4或全部5个)选自SEQ ID NO: 7、11、17、21和25的核苷酸序列；本发明的测序引物可包含SEQ ID NO: 7的核苷酸序列以及任选包含至少一个(例如至少2、3、4或全部5个)选自SEQ ID NO: 3、11、17、21和25的核苷酸序列；等等。

本领域技术人员能够理解的是，当各测序引物组合使用时，所使用的PCR引物、靶基因、待分析序列、分配顺序和靶序列根据下文表3的对应关系也相应地组合使用。例如当SEQ ID NO: 3的测序引物与SEQ ID NO: 7、11、17、21和/或25的测序引物组合使用时，PCR引物组1与PCR引物组2组合使用，由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序与由SEQ ID NO: 8所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 9所示的分配顺序、由SEQ ID NO: 12所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 13所示的分配顺序、由SEQ ID NO: 18所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 19所示的分配顺序、由SEQ ID NO: 22所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 23所示的分配顺序、和/或由SEQ ID NO: 26所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 27所示的分配顺序组合使用。

在一个实施方案中，采用QIAGEN公司的PyroMark Gold Q24 Reagents试剂盒和实时定量焦磷酸序列分析仪（型号：PyroMark® Q24 MDx），按照说明书方法进行焦磷酸测序。可使用以下杂交条件进行焦磷酸测序：80℃加热1.5min，室温退火20分钟。在一个实施方案中，焦磷酸测序还使用至少一种选自以下的待分析序列和/或分配顺序：

1）由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和/或由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序；

2）由SEQ ID NO: 8所示的待分析序列和/或由SEQ ID NO: 9所示的分配顺序；

3）由SEQ ID NO: 12所示的待分析序列和/或由SEQ ID NO: 13所示的分配顺序；

4）由SEQ ID NO: 18所示的待分析序列和/或由SEQ ID NO: 19所示的分配顺序；

5）由SEQ ID NO: 22所示的待分析序列和/或由SEQ ID NO: 23所示的分配顺序；和

6）由SEQ ID NO: 26所示的待分析序列和/或由SEQ ID NO: 27所示的分配顺序。

待分析序列是测序实验完成后进行结果分析时使用的，分析仪的软件将此待分析序列与测序结果进行比对。比如待分析序列为GCCG/TCGGCGAG/TAC/TGATA/TGGT/ATGT/ACGGGGT，软件就会对标注有“/”的位点计算突变的比例；在实际应用中，比例值会随着样本而变化，这个比例值则指示突变的程度。分配顺序是仪器在进行测序过程中喷出的核苷酸底物的顺序；测序时，仪器按照分配顺序按次序将核苷酸底物加入反应池中，如果喷入A时检测到荧光信号，就代表这个位点的测序结果为A，以此类推。本领域技术人员可根据需要常规地选择和设计待分析序列和/或分配顺序，并在实际应用中根据具体的靶序列的情况而使用不同的待分析序列和/或分配顺序。在一个实施方案中，焦磷酸测序可使用如表3所示的分析序列和/或分配顺序。本领域技术人员能够理解的是，引物组、测序引物、分析序列和分配顺序均根据具体的靶序列而相应地变化。

试剂盒

本发明涉及一种用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的试剂盒，其含有本发明的测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物(或本发明测序引物组)与引物组的组合。本发明还涉及本发明测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物(或本发明测序引物组)与引物组的组合在制备用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的试剂盒中的用途。在一个实施方案中，所述测序引物可包含或具有至少一个(例如至少2、3、4、5或全部6个)选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25。在一个实施方案中，所述引物组为选自引物组1和引物组2的至少一个引物组。

试剂盒可包含实施本发明方法所用的材料或试剂(包括测序引物和引物组)。试剂盒可以包括储存反应试剂(例如在合适容器中的引物、dNTP、酶等)和/或支持材料(例如缓冲液、实施检测的说明书等)。例如，试剂盒可以包括一个或多个含有相应反应试剂和/或支持材料的容器(例如盒子)。这样的内容物可一起或分开递送给既定的接受者。例如，第一个容器可含有用于测定的酶，第二个容器含有引物组、而第三个容器含有测序引物。所述试剂盒还可含有适合容纳所述试剂或容器的隔室。作为一个实例，试剂盒可含有测序引物、引物组、PCR反应缓冲液、使用说明书。试剂盒还可含有聚合酶和dTNP等。试剂盒还可含有UNG、用于质控的内标、阳性和阴性对照等。试剂盒还可包含用于从样品制备核酸例如DNA的试剂。本发明试剂盒还可包含除了本发明的测序引物和/或引物组之外的其它任何测序引物和/或引物组，例如能够有效检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的测序引物和/或引物组。以上实例不能理解为限制适用于本发明的试剂盒及其内容物。

在一个实施方案中，试剂盒中的说明书表明了焦磷酸测序所用的分析序列和/或分配顺序为下列的至少一种：

微阵列

本发明涉及一种用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的微阵列，其含有本发明的测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物(或本发明测序引物组)与引物组的组合。本发明还涉及本发明测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物(或本发明测序引物组)与引物组的组合在制备用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的微阵列中的用途。在一个实施方案中，所述测序引物可包含或具有至少一个(例如至少2、3、4或全部5个)选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25。在一个实施方案中，所述引物组为选自引物组1和引物组2的至少一个引物组。

微阵列是指具有平坦表面的固相支持体，其具有核酸阵列，阵列中的各个成员包含固定在空间上确定的区域或位点上的寡核苷酸或多核苷酸的相同的拷贝，所述区域或位点不与阵列中的其它成员的区域或位点重叠；也就是说，所述区域或位点在空间上是离散的。此外，空间上确定的杂交位点可为“可寻址的”，因为其位置及其固定化的寡核苷酸的身份是已知或预先确定的(例如在其使用前是已知或预先确定的)。通常寡核苷酸或多核苷酸为单链，并通常由5'-端或3'-端与固相支持体共价连接。微阵列中含有非重叠区的核酸的密度通常大于100/cm²，更优选大于1000/cm²。微阵列技术公开于例如以下参考文献中：Schena编辑的Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000)；Southern, Current Opin. Chem. Biol., 2:404-410，1998，其全部内容通过引用结合到本文中。

虽然上文已描述了本发明的各种实施方案，但是应理解的是，其仅以实例的方式提供，而并非限制。对公开的实施方案的许多改变可依照本文的公开内容来进行，而不会背离本发明的精神或范围。因此，本发明的广度和范围不应受到任何上述的实施方案所限制。

本文提及的所有文献都通过引用结合到本文中。本申请引用的所有出版物和专利文件都为所有目的而通过引用结合，引用程度如同单独地指出各个出版物或专利文件一样。

实施例

除非另外说明，否则本文实施例所用的材料均市购获得，用于进行实验的各种具体实验方法均为本领域常规的实验方法(参见例如F.奥斯伯等主编的《精编分子生物学实验指南》(1999)，科学出版社，ISBN 7-03-006408-9和J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南(第三版)》(2002)，科学出版社，ISBN 7-03-010338-6)或者按照制造商所建议的步骤和条件，并能由本领域技术人员根据需要常规地确定。以下对某些材料和方法进行了详述。

实施例 1 ：使用本发明测序引物进行的焦磷酸测序

材料和方法

1.1材料

表1：本发明所使用的材料及来源

材料名称	来源	批号	用量	单位	贮存条件
						PCR反应液A、B(含引物、探针、dNTP、缓冲液等）	自配	N/A	24.6	μl	-20℃
HS Taq	QIAGEN	133219532	0.4	μl	-20℃
						测序引物1-6	Invitrogen	20141201	2.5	μl	-20℃
PyroMark Gold Q24 Reagents	QIAGEN	20131201	1	人份	4 ℃

选取HBV野生型(SEQ ID NO: 29)和突变型(SEQ ID NO: 30)质粒（由Invitrogen合成），质粒10个检测位点的氨基酸类型及核苷酸序列详见表2。

表2：质粒10个检测位点的氨基酸类型及核酸序列

1.2设备

QIAGEN公司Rotor-gene Q PCR仪和PyroMark® Q24 MDx测序仪。

1.3方法

如图1所示，首先采用PCR反应液和HS Taq对纯化的HBV基因组DNA在Rotor-Gene Q平台上进行扩增，PCR反应液中包含荧光染料，在扩增过程中能够嵌入不断增加的PCR双链产物中。因此整个产物富集的过程能够通过Rotor-Gene Q的软件进行实时监测，从而确保质量可靠的PCR产物用于后续焦磷酸测序分析。通过PyroMark Q24真空工作站对PCR产物进行处理，最终获得与测序引物互补结合的单链PCR产物。之后在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上运行特定的焦磷酸测序程序，仪器会根据特别设计的分配顺序(DO)的顺序依次加入四种dNTP，通过酶与底物的级联反应，dNTP在单链产物上的有效延伸以光信号的形式被仪器接收，并最终以信号峰的形式实时出现在软件界面中。运行后的结果由软件进行自动分析，减少了人工分析的负担和误差。

1.3.1样本制备

取等浓度的野生型和突变型质粒混合成0%、5%、10%、15%、25%、50%、75%、100%突变比例梯度样本。

1.3.2 样本PCR扩增

分别用PCR反应液A、B对样本进行扩增（采用QIAGEN公司的实时荧光定量PCR分析仪（型号：Rotor-Gene Q），反应体系为40μl，每个样本分别用3批试剂各检测8次，总计24次。PCR反应条件如下：95℃ 15 分钟，95℃ 15 秒，58℃ 20 秒，72℃ 30 秒，循环50次。

1.3.3 焦磷酸测序

采用QIAGEN公司的PyroMark Gold Q24 Reagents试剂盒和实时定量焦磷酸序列分析仪（型号：PyroMark® Q24 MDx），按照制造商说明书方法和条件进行操作，测序引物的杂交条件为：80℃加热1.5min，室温退火20分钟。测序仪自动得出每个位点上的碱基的百分数，即为该位点的碱基比例的检测值，并与理论值相比较。

下表3给出了PCR反应和焦磷酸测序过程中所使用的各靶基因、PCR引物、测序引物、待分析序列、分配顺序和靶序列之间的关系以及相应的序列。

表3. 靶基因、PCR引物、测序引物、待分析序列、分配顺序(DO)和靶序列之间的关系以及相应的序列

1.4结果及分析

图2给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 3)对野生型质粒rt173和rt169位点处的基因突变检测结果的一个截图，图3给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 7)对野生型质粒rt184、rt181和rt180位点处的基因突变检测结果的一个截图，图4给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 11)对野生型质粒rt194位点处的基因突变检测结果的一个截图，图5给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 17)对野生型质粒rt204和rt202位点处的基因突变检测结果的一个截图，图6给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 21)对野生型质粒rt236位点处的基因突变检测结果的一个截图，图7给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 25)对野生型质粒rt250位点处的基因突变检测结果的一个截图。从图2-7可知，本发明测序引物能够快速准确地检测出乙型肝炎病毒耐药性基因中的突变，测序特异性高，且测序背景低。

下表4给出了对各位点突变比例梯度的检测结果，结果显示：突变比例的检测值与理论值较接近，检测准确性较高；各位点的标准偏差较小，显示出良好的精密度；各位点的突变型碱基检测值与理论值呈现良好的线性关系，线性拟合的相关系数均大于0.98（见图8）。因此，本发明的测序引物可应用于定量检测且检测准确性高。

表4：突变比例的理论值与检测值

实施例 2 ：本发明测序引物对临床来源的样本的测序

本实施例中所用的材料、仪器与方法及条件均同实施例1，但所测序的样本为来自医院的包含乙型肝炎病毒的临床血浆样本，其经Nucleic Acid Purification Kit（QIAGEN）处理后得到HBV病毒核酸，然后按照实施例1进行样本PCR扩增和焦磷酸测序。

本发明表3所示各测序引物对临床样本的测序结果见图9。

从图9可知，本发明表3所示各测序引物能用于对临床来源的样本进行测序，从而可用于指导患者根据耐药情况选择最佳的治疗方案。

实施例 3 ：不同测序引物的测序结果之间的比较

本实施例中所用的材料、仪器与方法及条件均同实施例1，但在焦磷酸测序过程中使用了不同的测序引物。测序结果见图10。

图10为对野生型质粒rt204/202位点使用不同测序引物的测序结果图。以A4和A8孔为例，相同的样本使用不同测序引物和相同的DO其测序质量完全不同（A4孔显示红色测序失败，而A8孔(本发明测序引物)显示蓝色测序成功）。

另外对不同的PCR引物和测序引物进行了类似的比较筛选，根据测序结果（未显示）最终选择了表3的引物序列。

Claims

1. 用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的测序引物，所述测序引物包含至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25。

2. 权利要求1的测序引物，其中所述测序引物具有至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25。

3. 权利要求1或2的测序引物，其中所述测序引物针对的靶标序列为选自以下的序列：SEQ ID NO: 6、10、14、20、24和28以及它们的任意组合。

4. 一种用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的试剂盒或微阵列，其包含权利要求1-3中任一项的测序引物。

5. 权利要求4的试剂盒或微阵列，其还包含至少一种选自以下的引物组：

6. 权利要求4或5的试剂盒或微阵列，其还包含表明至少一种选自以下的待分析序列和分配顺序的说明书：

7. 权利要求1-3中任一项的测序引物在制备用于基于焦磷酸测序技术检测样品中的乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的试剂盒或微阵列中的用途。

8. 权利要求7的用途，其中所述试剂盒或微阵列还包含至少一种选自以下的引物组：

9. 权利要求7或8的用途，其中所述试剂盒或微阵列还包含表明至少一种选自以下的待分析序列和分配顺序的说明书：

10. 权利要求7或8的用途，其中所述样品为生物样品，优选所述样品为体液样品或组织样品，和更优选所述样品选自活组织检查样品、细胞培养物、经固化处理的样品（如石蜡包埋样品）、全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、粪便、分泌液、乳汁和腹膜液。