CN117965803A - HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物和试剂盒。本发明开发出一种嵌合引物荧光PCR技术定量检测整合位点chrX:111,009,033的试剂盒，以β‑globin为内参基因，填补了目前世界上HBV整合定量方面的空白，将有力推动HBV整合的发生、致癌机制等研究。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
世界目前约有20亿乙型肝炎病毒(HBV)感染者，其中约2.4亿人为慢性乙型肝炎(CHB)患者，每年约一百万人死于CHB所致的肝衰竭、肝硬化、肝细胞癌(HCC)。HBV感染后，其病毒成熟体黏附于宿主肝脏细胞表面并进入肝细胞内，部分病毒基因成份进入肝细胞核内部，HBV DNA以疏松环状结构(rcDNA)转变成共价闭合环状DNA(cccDNA)，部分DNA整合入宿主基因。采用Alu-PCR等传统方法检测认为，HBV随机整合入宿主基因。近年来通过高通量测序技术(WGS)对HBV相关HCC患者进行检测发现，宿主基因特别是和肿瘤相关的细胞增殖基因如TERT，MLL4，CCNE1，NUP85，AGBL5等存在优势整合位点，这些基因在肿瘤组织肝细胞的HBV整合位点和频率显著高于周围非肿瘤组织，提示HBV整合可能导致HCC。HBV整合致癌机制可能包括：①整合引起宿主染色体不稳定；②影响整合位点周围宿主基因的功能，如抑癌基因的失活或表达抑制、或癌基因的过表达激活；③整合形成具有致癌作用的HBV截短蛋白及病毒-宿主基因融合蛋白。早期发现并及时清除乙肝患者HBV整合肝细胞对于预防HCC和彻底治愈慢乙肝有重要的临床意义，是未来HBV相关HCC基因治疗的重要策略之一。但由于HBV整合的随机性及插入病毒序列多样性等原因，目前世界上还没有HBV整合检测试剂盒面世、无法对HBV整合进行系统的细胞研究，导致目前在HBV整合发生和致癌机制方面尚未取得突破性进展。申请人长期从事HBV整合发生和致癌机制研究。2018年在法国里昂INSERMU1052分子生物实验室中采用反向巢式PCR(InvPCR)在HepG2.2.15细胞中首次发现了插入PAK3基因的HBV整合位点chrX:111,009,033(Ruan P,Dai XF,Sun J,He CP,Huang C,ZhouR,Chemin I.Integration of hepatitis B virus DNA into p21-activated kinase 3(PAK3)gene in HepG2.2.15 cells[J].Virus Genes.2020,56(2):168-173)。
因此，急切需要开发一种能够快速且准确对这种HBV整合位点chrX:111,009,033进行检测的引物、探针和试剂盒。
发明内容
针对HBV整合位点chrX:111,009,033，本发明提供了一种HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒，快速、灵敏和准确地定量检测整合位点chrX:111,009,033。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的嵌合引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物对，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针。
进一步地，所述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物对及核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的探针。
进一步地，所述试剂盒还包括：用于定量检测的阳性标准品，所述阳性标准品为含浓度梯度的含有HBV整合位点chrX:111,009,033扩增序列的质粒。
进一步地，所述试剂盒还包括：超纯水或Rnase Free H2O、5×PCR Buffer和Enzyme Mix。
进一步地，所述试剂盒使用时，反应体系包括单链延伸体系和实时荧光定量PCR扩增体系；
所述单链延伸体系包括提取的核酸、如SEQ ID NO.4所示的嵌合引物，获得单链延伸产物；
所述实时荧光定量PCR扩增体系包括所述单链延伸产物、核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物对，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针、5×PCR Buffer、Enzyme Mix、以及超纯水或Rnase FreeH2O。
进一步地，所述单链延伸体系包括提取的核酸5±1μl、如SEQ ID NO.4所示的嵌合引物1±0.3μl、获得单链延伸产物；
所述实时荧光定量PCR扩增体系包括所述单链延伸产物5±1μl、核苷酸序列如SEQID NO.1-2所示的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物对各0.75±0.3μl，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针1±0.3μl、5×PCR Buffer 4±1μl、Enzyme Mix 5±1μl、以及加超纯水或Rnase Free H2O至20μl。
作为优选地，所述阳性标准品包括标准品1，浓度为1×101拷贝/mL；标准品2，浓度为1×102拷贝/mL；标准品3，浓度为1×103拷贝/mL；标准品4，浓度为1×104拷贝/mL；标准品5，浓度为1×105拷贝/mL，标准品6，浓度为1×106拷贝/mL；标准品7，浓度为1×107拷贝/mL。
进一步地，所述试剂盒还包括：
阳性对照品：HBV整合位点chrX:111,009,033扩增序列质粒标准品；
阴性对照品：RNase Free H2O。
内标引物FP：SEQ ID NO.5，和RP：SEQ ID NO.6；
荧光探针：SEQ ID NO.7。
进一步地，所述试剂盒使用时，反应体系包括单链延伸体系和实时荧光定量PCR扩增体系；
所述单链延伸体系包括提取的核酸、如SEQ ID NO.4所示的嵌合引物，获得单链延伸产物；
所述实时荧光定量PCR扩增体系包括所述单链延伸产物、核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物对，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针、5×PCR Buffer、Enzyme Mix、以及超纯水或Rnase FreeH2O。
更进一步地，所述单链延伸体系包括提取的核酸5±1μl、如SEQ ID NO.4所示的嵌合引物1±0.3μl、含DNA聚合酶I的Mix5±1μl、加超纯水或Rnase Free H2O至20μl，获得单链延伸产物；
所述实时荧光定量PCR扩增体系包括所述单链延伸产物5±1μl、核苷酸序列如SEQID NO.1-2所示的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物对各0.75±0.3μl，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针1±0.3μl、5×PCR Buffer 4±1μl、Enzyme Mix 5±1μl、以及加超纯水或Rnase Free H2O至20μl。
在本发明的第二方面，提供了一种HBV整合位点chrX:111,009,033定量检测标准品，所述标准品的制备方法如下：
采用核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的嵌合引物R和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的Alu引物R1对细胞提取DNA进行PCR扩增，获得扩增产物，改良InvPCR技术证明其为包含整合位点chrX:111,009,033病毒插入全长序列的特异性扩增片段；
将所述特异性扩增片段插入PMD-18T载体，获得HBV整合位点chrX:111,009,033定量检测标准品。
在本发明的第二方面，提供了所述HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，包括：
以提取的核酸为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的嵌合引物进行单链延伸，获得单链延伸产物；
以所述单链延伸产物为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物对进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括所述的HBV整合位点chrX:111,009,033的实时荧光定量PCR检测引物对和探针。
进一步地，所述实时荧光PCR扩增的反应体系包括：样品模板、所述的HBV整合位点chrX:111,009,033的实时荧光定量PCR检测引物和探针、5×PCR Buffer和Enzyme Mix。
所述扩增程序为：95℃预热5min，95℃解链10s，54℃退火10s，72℃延伸10s共40循环。
进一步地，对扩增曲线进行分析判断原则为：
当FAM荧光通道中Ct≤40时，判断样品为HBV整合位点chrX:111,009,033阳性；
当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为HBV整合位点chrX:111,009,033阳性，否则判断样品为HBV整合位点chrX:111,009,033阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道中Ct≤45时，判断样品为HBV整合位点chrX:111,009,033阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1、本发明提供了供HBV整合位点chrX:111,009,033的实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，能够快速、准确且灵敏地检测出HBV整合位点chrX:111,009,033，特异性强、灵敏度高，高达5拷贝/mL。定量分析的定量线性范围好；实验结果重复性好，精密度高。
2、本申请经过大量的创新性试验得出本申请的引物对、探针、试剂盒及检测方法，解决了用一对引物对和一个探针就检测出HBV整合位点chrX:111,009,033，且使其特异性强，灵敏度高的问题，这也是本申请最大的技术难点。普通HBV定量检测对检测部分没要求，可以从全长3200bp中选择，容易找到完全匹配的一对引物；然而本申请的HBV整合位点chrX:111,009,033属于cccDNA，本领域技术人员检测cccDNA通常是通过一段刻痕设计引物，然而该该方法可选择范围太少，难以设计到特异性强的引物。本申请发明人创造性的从一个固定的嵌合点两边来设计引物，和探针一起联合使用特异性强、灵敏度高。
附图说明
图1是HBV整合产生机制；
图2是改良InvPCR技术检测整合位点chrX:111,009,033插入病毒片段全长序列策略；
图3是PCR结果：A.整合位点chrX:111,009,033插入病毒片段全长；B.病毒-宿主嵌合体右侧结合位点检测结果；C.病毒-宿主嵌合体左侧结合位点检测结果；D.包含整合位点chrX:111,009,033插入病毒全长序列的质粒；
图4是Sanger测序结果：A.病毒-宿主嵌合体右侧结合位点；B.病毒-宿主嵌合体左侧结合位点；C.整合位点chrX:111,009,033插入病毒全长序列。
图5是包含HBV整合位点chrX:111,009,033插入病毒全长序列的质粒；
图6是InvPCR技术检测宿主基因HBV整合；
图7是TaqMan PCR反应原理图；
图8.是嵌合引物荧光PCR定量检测整合位点chrX:111,009,033示意图。A.人为设计的碱基序列；B.包含PAK3基因和HBX基因的嵌合序列。
图9为HBV整合位点chrX:111,009,033标准品扩增曲线；
图10为标准品浓度标准曲线；
图11是3例HBV整合位点chrX:111,009,033阳性标本及33份阴性标本的病毒实时荧光定量PCR扩增曲线；
图12为内参基因β-globin扩增曲线。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请进行详细说明。
实施例1实时荧光定量PCR检测试剂盒的开发
1、HBV整合位点chrX:111,009,033定量检测标准品(包含整合位点chrX:111,009,033插入病毒全长序列的质粒)
①采用已知InvPCR技术(图6)检测HepG2.2.15细胞HBV整合[Tu T,JilbertAR.Detection of hepatocyte clones containing integrated hepatitis B virus DNAusing inverse nested PCR[J].Methods Mol Biol.2017,1540:97-118.]；
②根据检测出的整合位点chrX:111,009,033病毒-宿主嵌合体右侧结合位点序列，设计嵌合引物R及Alu引物R1和Alu引物F1(见表1)。以HepG2.2.15细胞提取DNA为底物，嵌合引物R分别和Alu引物R1和Alu引物F1进行PCR反应：95℃预热5min，95℃解链10s，56℃退火10s，72℃延伸3min共40循环。结果显示，在嵌合引物R和Alu引物R1间扩增出1255bp片段；
表1
③根据嵌合引物R(SEQ ID NO.8)和Alu引物R1(SEQ ID NO.9)的PCR扩增产物两端含有Alu酶切点(AGCT)的特点，对已知InvPCR技术进行改良,即用Alu限制性内切酶代替NcoI限制性内切酶。将10U的Alu限制性内切酶加入2μg的嵌合引物R(SEQ ID NO.8)和Alu引物R1(SEQ ID NO.9)的PCR扩增产物，37℃孵育1h，80℃灭活20m。加入500U的T4连接酶，25℃连接2h，70℃灭活20m。然后加入5U的BsiHKAI和5U的SphI-HF限制性内切酶，37℃孵育1h(SphI-HF适合温度)后65℃孵育1h(BsiHKAI适合温度)，提取1μgDNA作为InvPCR反应模板。第一轮PCR采用改良InvPCR引物F1(SEQ ID NO.13)和R1(SEQ ID NO.14)：95℃预热5min，95℃解链15s，54℃退火15s，72℃延伸3min共40循环。将反应产物稀释1000倍作为第二轮PCR反应模板，以改良InvPCR引物F2(SEQ ID NO.15)和R2(SEQ ID NO.16)为引物对扩增，反应条件同第一轮。最终扩增出900bp片段，Sanger测序技术显示为嵌合引物R和Alu引物R1的PCR扩增产物为包含整合位点chrX:111,009,033病毒插入全长序列的特异性扩增片段；
④为测出上述特异性扩增片段剩余未测出部分序列，设计引物IN F2(SEQ IDNO.11)和Alu R2(SEQ ID NO.12)对上述特异性扩增片段(即嵌合引物R和Alu引物R1间扩增出的1255bp片段)进行PCR反应：95℃预热5min，95℃解链10s，56℃退火10s，72℃延伸14s共40循环。最终测出整合位点chrX:111,009,033插入病毒全长序列。
⑤将所述步骤②获得的包含整合位点chrX:111,009,033病毒插入全长序列的1255bp特异性扩增片段载入PMD-18T载体，采用分子克隆技术制作出包含整合位点chrX:111,009,033插入病毒全长序列的质粒，并以该质粒作为定量检测标准品。
2、HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物及其探针组合
(1)本实施例中首先合成一条由28个碱基组成的嵌合引物(如表2所示，5’-TCGCTTTCGGGTCCCTTTTAATACCCAA-3’)，其5’端划线部分为人为设计的16个碱基序列而与所检测的病毒-宿主基因序列无同源性，3’端的12个碱基包括7个PAK3基因序列和5个HBX基因序列。先用此嵌合引物对提取产物作单链延伸15个循环，PCR反应：95℃预热5min，95℃解链10s，50℃退火20s，72℃延伸1min共15循环。同时采用β-globin为内标，内标引物及探针见表2。
表2
(2)核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的核酸探针。
(3)试剂盒内还包括阳性对照：HBV整合位点chrX:111,009,033标准品；阴性对照：RNase Free H2O；5×PCR Buffer和Enzyme Mix。其中5×PCR Buffer和Enzyme Mix的配制方法如下：
5×PCR Buffer配制：
配置混合后于冰箱-20℃保存。
Enzyme Mix配制：
配置混合后于冰箱-20℃保存。
3、HBV整合位点chrX:111,009,033的实时荧光PCR检测方法
(1)核酸的提取
①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；
②取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；
③将标本取200μl加入此管中，加入5μl内标溶液，充分混匀；
④再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；
⑤加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；
⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；
⑦滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；
⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min。重复步骤⑧一次；
⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；
⑩将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50μl RNase-free H2O，室温静置2min；12 000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸；
(2)实时荧光定量PCR扩增(每份20μl体系)
①取5μl提取的核酸作为模板，加入表2所示的嵌合引物1μl作单链延伸15个循环，获得单链延伸产物，所述PCR反应程序：95℃预热5min，95℃解链10s，50℃退火20s，72℃延伸1min共15循环。
②以单链延伸产物为底物，加入核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物对以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的核酸探针，同时加入20μl PCR反应液(实时荧光定量PCR反应液的配制体系如表3所示)至八联管中进行实时荧光定量PCR扩增。
表3实时荧光定量PCR反应液的配制体系
(3)实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预热5min，95℃解链10s，54℃退火10s，72℃延伸10s共40循环，扩增的片段长度为140bp。
(4)得到实时荧光定量PCR扩增结果，对扩增曲线进行分析，并作出判断。判断规则为：
当FAM荧光通道中Ct≤40时，判断样品为HBV整合位点chrX:111,009,033阳性；
当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为HBV整合位点chrX:111,009,033阳性，否则判断样品为HBV整合位点chrX:111,009,033阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道中Ct≤45时，判断样品为HBV整合位点chrX:111,009,033阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
3、实验结果
HBV整合位点chrX:111,009,033标准品扩增曲线如图9所示，标准品是含HBV整合位点chrX:111,009,033插入全长序列质粒，标准品1浓度为1×101拷贝/mL；标准品2浓度为1×102拷贝/mL；标准品3浓度为1×103拷贝/mL；标准品4浓度为1×104拷贝/mL；标准品5浓度为1×105拷贝/mL；标准品6浓度为1×106拷贝/mL；标准品7浓度为1×107拷贝/mL；
图10是HBV整合位点chrX:111,009,033标准品浓度标准曲线，所述标准浓度曲线方程为：y＝-6.03x+41.18，其中x是浓度的log值，y是Ct值。
利用上述构建的方法检测标本36份，检测出HBV整合位点chrX:111,009,033阳性3例；图11是这3例HBV整合位点chrX:111,009,033阳性标本及33份阴性标本的病毒实时荧光定量PCR扩增曲线，根据这3例阳性结果的所述Ct值结合标准曲线方程，由RocheLightCycler 480分析软件自动分析得到这3例HBV整合位点chrX:111,009,033阳性标本的病毒浓度，具体结果见表4。同时，这36份标本的内参基因β-globin扩增曲线正常，如图12所示，说明本次实验的提取和扩增过程正常，阳性和阴性结果准确。
表4-3例HBV整合位点chrX:111,009,033阳性标本病毒浓度
实施例2、HBV整合位点chrX:111,009,033的实时荧光PCR试剂盒的性能测定
1、准确性验证
病毒核酸检测的金标准是基因组测序，将此试剂盒的检测结果与病毒基因组测序做比较，分析其准确性。本实施例选取了基因组测序确定为HBV整合位点chrX:111,009,033的4例标本，用本发明提供的试剂盒检测后结果如下表5。由结果可见，4份阳性标本全部被检出，表明本发明提供的HBV整合位点chrX:111,009,033的实时荧光PCR的准确性为100％。
表5本发明的准确性分析
2、特异性验证
试剂盒的特异性是通过检测其他病原体来评估，本实施例选择了常见病原体阳性标本或质粒模拟阳性标本，结果如下表6。经检测，此发明对22种呼吸道及其他常见病原体阳性标本无扩增，表明本发明提供的HBV整合位点chrX:111,009,033的实时荧光PCR的特异性为100％。
表6本发明的特异性分析
| 阳性病原体 | 是否有扩增 | 阳性病原体 | 是否有扩增 |
| 腺病毒 | 无扩增 | 乙型肝炎病毒 | 无扩增 |
| 甲型流感病毒 | 无扩增 | 丙型肝炎病毒 | 无扩增 |
| 乙型流感病毒 | 无扩增 | 人免疫缺陷病毒 | 无扩增 |
| 乙型肝炎病毒 | 无扩增 | 金黄色葡萄球菌 | 无扩增 |
| 呼吸道合胞病毒 | 无扩增 | 大肠杆菌 | 无扩增 |
| 副流感病毒 | 无扩增 | 肺炎支原体 | 无扩增 |
| 人单纯疱疹病毒 | 无扩增 | 肺炎衣原体 | 无扩增 |
| 偏肺病毒 | 无扩增 | 肺炎克雷伯菌 | 无扩增 |
| 博卡病毒 | 无扩增 | A组乙型链球菌 | 无扩增 |
| 鼻病毒 | 无扩增 | 铜绿假单胞菌 | 无扩增 |
| 巨细胞病毒 | 无扩增 | 流感嗜血杆菌 | 无扩增 |
3、灵敏度检测
灵敏度也即最低检测限，是指将阳性标本经过梯度稀释后，在最低稀释梯度的同一个标本中测到靶核酸的可能性在统计学上概率>95％。用于灵敏度评估的样本在每个需评估的浓度水平检测次数应不少于20次，以至少19次出现阳性扩增信号为合格。在此，我们将HBV整合位点chrX:111,009,033的阳性标准品质粒按一定拷贝数倍比稀释后，每一个稀释度平均分为20个样本，用此发明的方法进行检测，出现19次及以上阳性的该拷贝数即为最低检测限，结果见表7。经验证，在5拷贝/ml浓度时，检出率为95％，低于此浓度时，检出率不足95％。由此可见，表明本发明提供的HBV整合位点chrX:111,009,033的实时荧光PCR的灵敏度为5拷贝/mL。
表7本发明的灵敏度分析
4、精确性检测
精确性是指相同阳性样本多次检测，结果判读的一致性，以变异系数(CV)小于5判定为精确性良好。本实施例在每个浓度梯度分3次检测4份阳性标本，结果如下表8所示。经验证，在5～1×108拷贝/mL范围内，此发明的批内CV<5％，且批间CV<5％，精密度良好。
表8本发明的精确性分析
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的嵌合引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物对，以及核苷酸序列如SEQID NO.3所示的探针。
2.根据权利要求1所述的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物对及核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的探针。
3.根据权利要求2所述的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于定量检测的阳性标准品。
4.根据权利要求3所述的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为含浓度梯度的含有HBV整合位点chrX:111,009,033扩增序列的质粒。
5.根据权利要求4所述的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：超纯水或Rnase Free H2O、5×PCR Buffer和EnzymeMix。
6.根据权利要求5所述的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用时，反应体系包括单链延伸体系和实时荧光定量PCR扩增体系；
所述单链延伸体系包括提取的核酸、如SEQ ID NO.4所示的嵌合引物，采用所述单链延伸体系获得单链延伸产物；
所述实时荧光定量PCR扩增体系包括所述单链延伸产物、核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物对，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针、5×PCR Buffer、Enzyme Mix、以及超纯水或Rnase Free H2O。
7.一种HBV整合位点chrX:111,009,033定量检测标准品，其特征在于，所述标准品的制备方法如下：
采用核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的嵌合引物R和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的Alu引物R1对细胞提取的DNA进行PCR扩增，获得特异性扩增片段；
将所述特异性扩增片段插入PMD-18T载体，获得HBV整合位点chrX:111,009,033定量检测标准品。
8.一种权利要求1-6任一所述的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
以提取的核酸为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的嵌合引物进行单链延伸，获得单链延伸产物；
以所述单链延伸产物为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的HBV整合位点chrX:111,009,033实时荧光定量PCR检测引物对以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析并作出判断。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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