CN116783308A - 用于多重核酸检测的通用卡盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的领域通常涉及在多重反应环境中检测核酸靶标。特别地,本文公开了用于在通用检测卡盒中使用定制遗传靶标测试组进行多重PCR检测的方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统或其组分。所公开的方法和试剂盒通常可用于快速设计针对大量(即数十个或数十倍个)个性化和/或定制遗传靶标(包括突变、SNP、致病序列、表观遗传病变等)的自动化的基于多重PCR的检测测定。所公开的方法和产品的一般原理是提供:(1)预载有通用报告分子的测试组不可知的通用检测卡盒;和与其分开地(2)靶特异性多重PCR寡核苷酸池,其在PCR扩增条件下在靶标的存在下导致产生能够与卡盒内的通用报告分子特异性反应并从其产生信号的分子。因此,本文公开的方法和产品极大地简化了标准诊断测定开发流程,因此非常有利于以前所未有的速度将定制选择的遗传检测组提供给实验室和患者。
Description
技术领域
本发明的领域通常涉及在多重反应环境中检测核酸靶标。特别地,本文公开了用于在通用检测卡盒中使用定制遗传靶标测试组进行多重PCR检测的方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统或其组分。所公开的方法和试剂盒通常可用于快速设计针对大量(即数十个或数十倍个)个性化和/或定制遗传靶标(包括突变、SNP、致病序列、表观遗传病变等)的自动化的基于多重PCR的检测测定。所公开的方法和产品的一般原理是提供:(1)预载有通用报告分子的测试组(panel)不可知的通用检测卡盒;和与其分开地(2)靶特异性多重PCR寡核苷酸池,其在PCR扩增条件下在靶标的存在下导致产生能够与卡盒内的通用报告分子特异性反应并从其产生信号的分子。因此,本文公开的方法和产品极大地简化了标准诊断测定开发流程,因此非常有利于以前所未有的速度将定制选择的遗传检测组提供给实验室和患者。
背景技术
对于快速、直接地开发允许监测个体的遗传多样性疾病状态如感染、器官移植排斥或癌症的个性化诊断测定存在全球需求。此类测定应基于患者特异性遗传信息,提供高可靠性并保持成本效益。目前现有的方法过于耗费时间和资源,因此无法提供合适的解决方案。
在癌症领域,自21世纪初以来,我们正在观察到从癌症类型特异性诊断和治疗到更加个性化的诊断和泛癌治疗方法的范式转变,重点关注个体的潜在遗传学和免疫反应(Hanahan和Weinberg,2011,Cell144:646-674)。因此,现在人们更广泛地认识到癌症不是一种统一的疾病,而是许多不同遗传决定的获得性病理性增殖综合征的总称,其中不仅每种癌症类型,甚至每种个体癌症似乎都具有独特的遗传突变特征(Ciriello等人,2013,NatGen 45:1127–1133)。因此,尽管许多癌症中可检测和可治疗靶向的驱动突变(例如KRAS、BRAF或EGFR基因中的突变)仍然非常普遍,但仍存在大量剩余癌症病例,其中以个体为中心的测试可以极大地使患者的管理和结果受益。
进行这种个性化筛选的一种方法是通过下一代测序(NGS)。尽管NGS分析逐渐变得更实惠,但它们仍然相对昂贵,并且需要专家参与数据解释,而这通常是全科医生无法企及的。此外,获得NGS结果的等待时间仍然很长。因此,NGS在一段时间内可能仍然是一种在很大程度上不适合频繁或定期随访癌症治疗的技术。考虑到现有全自动系统的速度、灵敏度、易用性和可用性,基于选定靶标的qPCR的检测可能提供了最佳解决方案。此外,这些全自动系统使得能够在全球范围内部署测试,使测试更接近患者并确保全球患者访问。尽管包括Biocartis NV在内的几家供应商都可以为癌症患者提供出色的突变测试组特异性诊断测试,并拥有最先进的测定开发流程,但提供个性化定制的靶标特异性卡盒低于制造商的利润率。尽管资金和投资回报考虑有限,但在当前的开发程序下引入新的诊断卡盒仍然与从个人角度来看太长的标准开发和制造提前期相关。因此,迫切需要通过开发更快、更便宜的个性化基因测定来改变个人的癌症随访护理,特别是对于分子监测测试、术后和微小残留病(MRD)监测。
随着2020年全球Covid大流行的突然袭击,导致许多制造公司被封锁,这进一步延长了时间线和上市时间,并大大限制了许多患者获得医疗保健和疾病监测系统的机会,很明显,比以往任何时候都更需要一种新的策略来更快、更经济地开发基于qPCR检测的定制测试。特别是,鉴于SARS-CoV-2作为一种全新的病毒和不断变异的病原体的出现,使其难以检测,特别希望这种新策略能够普遍适用于检测来自人类生物体以外的序列,并且具有高度可定制性和易于适应性,以包括快速变化的序列的检测。
我们相信我们已经开发了这样一种方法,通过提供一个新平台,该平台包含通用的(即靶标不可知)通用检测卡盒,其包含通用报告分子并与大型多重qPCR靶标特异性的可定制寡核苷酸池兼容,这些寡核苷酸池可以与临床样品一起引入到卡盒中以检测卡盒内的感兴趣的靶标。我们相信,本文提出的方法将在个性化肿瘤学监测中找到前所未有的用途,包括但不限于:使用液体活检的个性化分子监测测试、个性化治疗选择、治疗和/或复发监测、手术后随访、检测MRD、辅助治疗后的复发监测,和甚至在复发的情况下,监测耐药突变的获得和对治疗的反应,以及细胞疗法、个性化癌症疫苗和新抗原靶向免疫疗法。本文公开的方法和产品同样适用于癌症以外的应用,包括移植监测或产前检测,以及非人类序列的检测,例如用于检测传染病领域的病毒和细菌病原体、脓毒症检测、微生物组表征和许多其他。
本公开内容提供了方法、试剂盒、部件试剂盒、系统及其组分,用于在用于即时护理(PoC)设备的通用检测卡盒中使用定制的遗传靶标测试组来执行遗传靶标的多重检测。所公开的方法和产品的一般原理是基于提供至少两种以下单独的组分:
(1)预载有通用报告分子的测试组不可知的通用检测卡盒,其被配置成检测通用序列的存在;和与其分开地
(2)靶特异性多重PCR寡核苷酸池,其在PCR扩增条件下,在靶标存在的情况下,导致产生含有通用序列并因此能够与卡盒内的通用报告分子特异性反应并从其生成信号的分子(进一步称为可检测分子)。
上面解释的概念在当前的诊断测定开发实践中是非常新的。迄今为止,就申请人所知,仅存在预载有适当的检测化学物质和特异于预定的测定遗传靶标(例如治疗靶向突变)的寡核苷酸试剂的测定特异性的样品到结果诊断卡盒。现有的卡盒在检测其定义的遗传靶标方面可以非常快速和灵敏,但它们的设计与优化、验证、测试等方面的大量努力以及材料成本和等待时间(例如靶特异性试剂,如寡核苷酸探针或其他有时非常复杂的扩增和/或检测系统)有关。此外,一旦开发出具有固定的诊断测试组的工作卡盒,进一步修改或调整其靶特异性试剂(例如,以在测试组中包括额外靶标)就不是直截了当的了。例如,必须首先排除新引入的寡核苷酸与初始寡核苷酸之间的任何负面相互作用,以免影响修饰的产品的性能。在向现有和之前优化的解决方案中添加新的靶特异性报告分子(例如探针)之后进行选择期间或在染料或猝灭剂之间存在潜在的不相容性时,可能会出现其他问题。问题可能出现在许多层面上,因此,必须意识到,即使是现有靶特异性测定的看似微不足道的修改(以进行更新或满足特定用户需求)的引入也不是直截了当的,而是可能需要大量的产品重新设计工作。
本文所呈现的方法和产品(包括试剂盒、部件的试剂盒、卡盒、系统和组分)通过提供样品到结果的通用检测卡盒解决了部分或所有上述缺点,该卡盒预载有所有必要的样品处理和扩增化学物质,但代替现有测定特异性卡盒的诊断靶特异性试剂,通用检测卡盒包含被配置成检测通用序列标签的存在的通用报告子(例如标记的探针)。为了避免设计或重新设计工作、降低开发成本以及合成和递送靶特异性报告分子的等待时间,这种通用检测卡盒可以预先进行广泛的测试、表征、生产和储存,以便在需要时快速供应给客户诸如医院、诊所或检测中心。然后,客户可以定义和订购与所述卡盒兼容的自定义选择的靶特异性寡核苷酸子集的所需混合物。寡核苷酸子集可包含靶特异性引物或引物对,但也可包含充当引物或探针的一种或多种额外寡核苷酸,这取决于选择的扩增化学。寡核苷酸子集混合物与装载有通用报告分子的通用卡盒的相容性将取决于以下因素:(i)它们在卡盒内进行一次多重扩增反应的能力;和(ii)每个靶特异性寡核苷酸子集在其靶标存在的情况下生成包含与卡盒内定义的通用报告分子相关联并可被其检测到的通用序列标签的核酸产物的配置。
因此,从用户的角度来看,上述解释的概念相对于常见做法的不同之处在于,用户收到的是包含通用卡盒和靶特异性寡核苷酸池的双(或更多)组分产品,而不是具有已经预载有特异于固定的诊断测试组的试剂的卡盒的单独的包装。因此,用户不是仅将生物样品插入测定特异性卡盒,而是还插入靶特异性寡核苷酸的混合物;图1中示意性说明的程序,与目前的做法相比,仅构成最小的额外处理负担。
相反,从测定设计的角度来看,基于通用卡盒的方法具有大幅缩短新测定交付时间的巨大潜力,据我们估计,至少缩短几个月到一年,在某些情况下甚至多至几年。这是因为核酸分离化学和报告系统可以根据通用卡盒类型进行标准化,从而将设计工作推向专注于使用靶特异性寡核苷酸子集的混合物建立有效的多重反应。
然而,该领域普遍认为实现高水平的多重检测具有挑战性。想要例如在目前市售的具有5个扩增室的Biocartis IdyllaTM卡盒中检测例如20种不同的变体的技术人员将自然地旨在设计五个平行的4-plex,每个腔室一个,而不是甚至考虑并行运行一个或几个,即每个腔室中的各自20-plex个反应。特别地,如果给定系统具有固定数量的与扩增室相关并适用于捕获来自其中的报告分子的信号的波长特异性检测通道,则也不太可能的是技术人员会考虑在这样的扩增室中运行具有超过检测通道数量的靶标数量的多重反应。
当涉及低拷贝靶标时,考虑增加多重扩增中的靶标数量甚至变得更不可能。其中突出的实例包括来自体液样品(包括血浆或尿液)的循环细胞游离DNA(cfDNA)中存在的变异。一个合适的监测测试应该能够检测到患者样品中1%或更少,最好是0.1%或更少的cfDNA。本领域技术人员众所周知的是开发可检测1%或更少的变异的单重qPCR测定已经具有挑战性。因此,他们将知道,开发能够检测每个靶向变体的1%变异的多重qPCR测定更具挑战性,因为qPCR反应中使用的不同引物和探针可能会相互干扰,从而降低测定的性能。
此外,用于引物设计的常用工具仍然主要基于基本的热力学分析模型来预测引物和探针行为。然而,实际上,反应条件通常包含热力学模型中未考虑的成分,包括缓冲液添加剂、与处理引物模板错配相关的酶特异性行为、PCR斜率的影响和循环时间等。因此,人们还广泛认识到,可用的寡核苷酸工具并不特别适合预测引物和探针行为,这对于高性能测定尤其重要,在这种测定中,在多重PCR中应检测到小于1%的变异。
由于上述三个与多重检测带来的广泛认可的挑战相关的主要原因,我们相信迄今为止没有人试图开发如本文所述的通用检测卡盒概念。然而,我们已经测试了本文提出的概念的可行性,并创建了一个非常有前途的通用卡盒原型,其与将与样品一起引入到其中的多重检测定制设计遗传靶标测试组兼容。本文公开的通用检测卡盒的基本设计原理以及基于它的方法、试剂盒、组分和用途通常适用于所有基于qPCR的检测策略,包括具有一个或多个PCR室的任何随机访问样品到报告的设备。它们的优势包括大大减少设计工作量、材料成本和订单等待时间。这些和其他特征和优点将在后续部分进行解释。
发明内容
本公开内容提供了方法、试剂盒、部件试剂盒、系统及其组分,其用于使用通用检测卡盒中的定制遗传靶标测试组对遗传靶标进行多重检测。所公开的方法和产品的一般原理基于提供至少两种以下单独的组分:
(1)预载有通用报告分子的测试组不可知的通用检测卡盒,其被配置成检测通用序列的存在;和与其分开地
(2)靶特异性多重PCR寡核苷酸池,其在PCR扩增条件下在靶标的存在下导致产生包含通用序列并因此能够与卡盒内部的通用报告分子特异性反应并从其生成信号的分子(进一步被称为可检测的核酸产物)。
具体而言,在第一个一般方面,公开了一种用于检测多个遗传靶标的方法,该方法包括:
-提供多个寡核苷酸子集的混合物,每个所述子集对遗传靶标是特异的并且包含对所述子集独特的通用序列标签(“独特通用序列标签”或“UGST”),
其中每个所述子集适应于在核酸扩增条件下和在遗传靶标的存在下产生包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物;
-与所述混合物分开地,提供集成的流体卡盒,其包括
(i)用于接受生物样品和/或混合物的入口,
(ii)位于入口下游的核酸分离室,
(iii)用于核酸扩增的试剂;
(iv)位于核酸分离室下游的一个或多个核酸扩增室,和
(v)多个通用报告子,其中多个通用报告子中的每一个包含对包含在可检测的核酸产物之一中的独特通用序列标签特异(互补)的通用序列,并且适应于在所述可检测的核酸产物的存在下产生信号;
其中混合物和生物样品或提取的核酸由用户插入卡盒中,该方法还包括:
-在插入生物样品或提取的核酸和混合物之后操作卡盒,其中操作包括(在卡盒内)从生物样品进行核酸分离,然后进行包含混合物的多重核酸扩增;
-如果从所述扩增产生至少一种可检测的核酸产物,则检测从包含在集成流体卡盒内部的多个通用报告分子中的至少一个产生的信号。
在进一步的一般方面,公开了一种试剂盒或部件的试剂盒,所述试剂盒包括作为单独的组分提供的:
-多个寡核苷酸子集的混合物,每个所述子集对遗传靶标是特异的并且包含对所述子集独特的独特通用序列标签,其被定义为不存在于从其检测遗传靶标的生物体的遗传信息中的序列,其中每个所述子集适应于在核酸扩增条件下和在遗传靶标的存在下产生包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物;和
-集成的流体卡盒,其包含
(i)用于接受生物样品和/或混合物的入口;
(ii)位于入口下游的核酸分离室;
(iii)用于核酸扩增的试剂;
(iv)位于核酸分离室下游的一个或多个核酸扩增室,和
(v)多个通用报告分子,其中多个通用报告分子中的每一个包含对独特通用序列标签之一特异(其可以是互补的)的通用序列,并且适应于在包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物的存在下产生信号。
在进一步的一般方面,公开了一种系统或系统的一部分,所述系统包括作为单独的组分的:
可与自动化系统接合的卡盒,该卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室,优选多于一个核酸扩增室,例如2、3、4、5、6、7或8个,或甚至更多个核酸扩增室;
其中入口与核酸分离室流体连接,并且其中核酸分离室与一个或多个核酸扩增室流体连接;
其中一个或多个核酸扩增室包含通用报告分子,其中该通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其被配置用于靶核酸的扩增,优选靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的;
b)介体探针,其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含UGST,其中UGST的序列与通用报告分子的UGST结合位点互补;
ii)第二部分,其中第二部分与待扩增的靶核酸序列的第一链互补;
优选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
在进一步的一般方面,公开了一种系统或系统的一部分,所述系统包括作为单独的组分的:
-可与自动化系统接合的卡盒,该卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室,优选多于一个核酸扩增室,例如2、3、4、5、6、7或8个,或甚至更多个核酸扩增室;
其中入口与核酸分离室流体连接,并且其中核酸分离室与一个或多个核酸扩增室流体连接;
其中一个或多个核酸扩增室包含通用报告分子,其中该通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其中靶特异性引物对的至少一个成员在与靶标结合时包含茎环结构,并且优选地,靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的和;
b)介体探针,其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)第二部分,其中第二部分与等位基因特异性引物的茎环结构或其互补物互补;
优选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
在进一步的一般方面,公开了一种系统或系统的一部分,所述系统包括作为单独的组分的:
-被配置成接受卡盒的仪器,卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室,优选多于一个核酸扩增室,例如2、3、4、5、6、7或8个,或甚至更多个核酸扩增室;
其中入口与核酸分离室流体连接,并且其中核酸分离室与一个或多个核酸扩增室流体连接;
其中一个或多个核酸扩增室包含通用报告分子,
其中通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
-寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其被配置用于靶核酸的扩增,其中靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的;
b)介体探针,其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含UGST,其中UGST的序列与通用报告分子的UGST结合位点互补;
ii)第二部分,其中第二部分与待扩增的靶核酸序列的第一链互补;
优选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
在进一步的一般方面,公开了系统或系统的一部分,所述系统被配置成确定靶序列、靶序列中的突变、靶序列的特定等位基因、病原体等的存在或不存在。
在一些实施方案中,卡盒的核酸扩增室包含用于核酸扩增的试剂。
在一些实施方案中,核酸分离室包含核酸提取/纯化试剂,或与包含核酸提取/纯化试剂的单独隔室流体接触。
在一些实施方案中,卡盒在核酸扩增室中包含多个通用报告分子,其中多个通用报告分子的每个UGST结合位点是不同的。
在一些实施方案中,多个通用报告分子中的每一个包含不同的报告分子。
在一些实施方案中,寡核苷酸混合物包含多个靶特异性扩增引物对,其中每个引物对对不同的靶标具有特异性,优选地其中每个引物对的至少一个成员包含等位基因特异性引物;和多个介体探针,其中i)每个介体探针的第一部分包含与多个通用报告分子中的一个通用报告分子的UGST结合位点互补的UGST;和ii)每个介体探针的第二部分与待扩增的多个靶核酸序列的不同靶核酸的第一链互补。
在进一步的一般方面,公开了一种系统或系统的一部分,所述系统包括作为单独的组分的:
-被配置成接受卡盒的仪器,卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室,优选多于一个核酸扩增室,例如2、3、4、5、6、7或8个,或甚至更多个核酸扩增室;
其中入口与核酸分离室流体连接,并且其中核酸分离室与一个或多个核酸扩增室流体连接;
其中一个或多个核酸扩增室包含通用报告分子,其中该通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其中靶特异性引物对的至少一个成员在与靶标结合时包含茎环结构,并且优选地,靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的,并且;
b)介体探针,其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)第二部分,其中第二部分与等位基因特异性引物的茎环结构或其互补物互补;
优选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
在本文公开的系统的一些实施方案中,等位基因特异性引物包含ARMS引物。
在进一步的一般方面,公开了用于检测靶核酸的方法。在一些实施方案中,这些方法包括:
-使用靶特异性引物对扩增来自受试者的核酸样品,优选地,其中靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的,并且其中扩增反应在介体探针和通用报告分子的存在下进行;
a)其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)第二部分,其中第二部分与靶核酸的第一链互补;
优选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂;
b)其中通用报告分子包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)UGST结合位点,其与介体探针的UGST互补;
v)聚合酶延伸阻断剂;
其中荧光团/猝灭剂对的成员经由茎环结构定位以猝灭荧光团;
-检测在靶核酸存在的情况下由荧光团/猝灭剂对的荧光团产生的信号,从而检测靶核酸的存在。在进一步的一般方面,公开了用于检测靶核酸的方法。
在一些实施方案中,用于检测靶核酸的方法包括:
-使用靶特异性引物对扩增来自受试者的核酸样品,
其中靶特异性引物对的至少一个成员在与靶标结合时包含茎环结构,优选地,靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的,并且
其中扩增反应在介体探针和通用报告分子的存在下进行;
a)其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)第二部分,其中第二部分与等位基因特异性探针的茎环结构或其互补物互补;
优选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂;
b)其中通用报告分子包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)UGST结合位点,其与介体探针的UGST互补;
v)聚合酶延伸阻断剂;
其中荧光团/猝灭剂对的成员经由茎环定位以猝灭荧光团;
-检测在靶核酸存在的情况下由荧光团/猝灭剂对的荧光团产生的信号,从而检测靶核酸的存在。
在本文公开的方法的一些实施方案中,等位基因特异性引物包含ARMS引物。
在一些实施方案中,本文公开的系统或方法包含参考系统,包括参考靶核酸序列,其包含KIF11基因序列的至少一部分,包括KIF11基因的非编码区。在一些实施方案中,参考系统包含SEQ ID NO:69-80中的一个或多个,优选选自以下的引物对:SEQ ID NO:69和70;SEQ ID NO:71和72;SEQ ID NO:73和74;SEQ ID NO:75和76;SEQ ID NO:77和78;和SEQ IDNO:79和80;优选地,扩增的区域通过选自SEQ ID NO:81-86的探针检测,优选通过选自SEQID NO:87和88的通用报告分子检测。
在一些实施方案中,与现有技术方法相比,所公开的系统、方法、试剂盒及其组分提供了优异的结果。举例来说,但不作为限制,在一些实施方案中,所公开的系统、方法、试剂盒和组分更便宜(例如与NGS相比)、更易于使用(例如与任何其他方法相比,例如基于板的系统上的qPCR或NGS),和/或更快地设计和销售(例如与任何其他方法相比,见上文)。
在又一个一般方面,提供了方法、试剂盒、其组分及其各自在下文描述的实施方案用于有利的应用的用途,例如包括但不限于检测多个遗传靶标(可能在从患者获得的样品中)。患者可以是癌症患者、患有传染病的患者、移植接受者或准妈妈。如果患者是癌症患者,所公开的方法、试剂盒和组分的有利用途包括但不限于NGS分析后患者监测、对治疗的反应或治疗监测、微小残留病(MRD)检测或监测、手术后随访,或个体化癌症新抗原靶向免疫疗法选择。
在又一个一般方面,提供了一种用于检测来自受试者的靶核酸的方法,其包括:使用靶特异性引物对扩增来自受试者的核酸样品,
其中靶特异性引物对的至少一个成员(优选地是等位基因特异性的并且)在与靶标结合时包含茎环结构(“FuseTag”),并且
其中扩增反应在通用报告分子(2)的存在下进行;
a)其中FuseTag从5'到3'包括:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)茎环结构;
iii)第二部分,其中第二部分与靶标互补,并且优选地是等位基因特异性的;
b)其中通用报告分子(2)包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)UGST结合位点,其与FuseTag的UGST互补;
v)聚合酶延伸阻断剂;
其中荧光团/猝灭剂对的成员经由茎环结构定位以猝灭荧光团;
检测在靶核酸存在的情况下由荧光团/猝灭剂对的荧光团产生的信号,从而检测靶核酸的存在。
在另一个方面,公开了一种用于相对于样品中的KIF11核酸定量样品中的靶核酸的数量的方法,其包括:
1.在KIF11扩增反应中使用KIF11特异性引物对扩增样品中包含的KIF11核酸,
i.其中KIF11特异性引物对的每个成员彼此独立地与位于KIF11基因的外显子、内含子或非编码序列中的KIF11区域互补;
ii.其中KIF11扩增反应在KIF11检测探针的存在下进行;
2.检测KIF11检测探针在KIF11扩增反应中产生的信号;
3.定量2.的信号;
4.在靶扩增反应中使用靶特异性引物对从样品扩增靶核酸;
i.其中靶扩增反应是在存在靶检测探针的情况下进行的;和
5.检测靶检测探针在靶扩增反应中产生的信号;
6.定量5.的信号;
7.将6.的定量的信号针对3.的定量的信号进行标准化,从而相对于样品中的KIF11核酸定量样品中的靶核酸的数量。
在另一方面,公开了一种用于确定样品中的gDNA污染的方法,其包括:
1.在KIF11扩增反应中使用第一和第二KIF11特异性引物对扩增样品中包含的KIF11核酸,
a.其中第一KIF11特异性引物对的至少一个成员与KIF11内含子或KIF11基因的非编码序列互补;
b.其中使用第一KIF11特异性引物对的扩增反应在第一KIF11检测探针的存在下进行;
c.其中第二KIF11特异性引物对的每个成员位于KIF11外显子中;
d.其中使用第二KIF11特异性引物对的扩增反应在第二KIF11检测探针的存在下进行;
2.检测第一和第二KIF11检测探针在第一和第二KIF11扩增反应中产生的信号;
3.对第一次和第二次KIF11扩增反应的信号进行定量;
4.将第一扩增反应的定量的信号针对第二扩增信号的定量的信号进行标准化,从而确定样品中的gDNA污染,优选样品为线粒体DNA、cDNA、mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、microRNA、lncRNA、cfDNA、细胞游离肿瘤DNA或siRNA样品。
在另一方面,公开了一种用于确定样品中核酸的完整性的方法,其包括:
1.在KIF11扩增反应中使用第一和第二KIF11特异性引物对扩增样品中包含的KIF11核酸,
a.其中第一KIF11特异性引物对的每个成员彼此独立地与位于KIF11基因的外显子、内含子或非编码序列中的KIF11区域互补;
b.其中使用第一KIF11特异性引物对的扩增反应在第一KIF11检测探针的存在下进行;
c.其中第二KIF11特异性引物对的每个成员彼此独立地与位于KIF11基因的外显子、内含子或非编码序列中的KIF11区域互补;
d.其中使用第二KIF11特异性引物对的扩增反应在第二KIF11检测探针的存在下进行;
e.优选地,由第一和第二KIF11特异性引物对的扩增反应产生的扩增子位于足够远的位置以不干扰,例如扩增子为至少600个碱基对(bp),例如至少700bp、800bp、900bp或甚至更多,例如至少1千碱基对;
2.通过以下步骤确定每个所述核酸扩增反应中的阈值:
o在扩增反应期间的多个不同时间测量至少一种信号,其强度与反应中扩增的核酸序列的量相关;
o确定与导数特征相关的循环数,其代表阈值;
3.比较第一和第二KIF11扩增反应的阈值(阈值循环数);
4.其中第一和第二KIF11扩增反应的阈值循环数(ΔCq)之间的差异是基因组DNA完整性的量度;
任选地,步骤2可以包括
o从信号的测量结果导出生长曲线;
o计算生长曲线的导数并鉴定导数的特征;
o计算生长曲线的二阶导数,其中特征包括二阶导数的正峰值;和
在另一方面,公开了一种用于确定gDNA片段化的方法,其包括:
·通过第一、第二和第三扩增反应,优选通过PCR产生具有可辨别的长度的3个(第一、第二和第三)KIF11扩增子;
·确定所述第一、第二和第三扩增反应的Cq值;
·比较所述第一、第二和第三扩增反应的Cq;
·其中所述第一、第二和第三扩增反应之间Cq值的差异是gDNA片段化的指示。
在另一方面,公开了一种用于确定gDNA片段化的方法,但该方法也可用于评估细胞游离DNA或细胞游离肿瘤DNA被源自白细胞的更完整的基因组DNA的污染,所述方法包括
·通过第一扩增反应生成第一KIF11扩增子(“短”);和
·通过第二扩增反应生成第二KIF11扩增子(“长”);
·确定所述第一扩增反应和所述第二扩增反应的Cq值;
·确定所述第一扩增反应和所述第二扩增反应的ΔCq值;
·其中ΔCq是gDNA片段化的指示。
在另一方面,公开了试剂盒的用于扩增基因组参考基因KIF11的区域的用途,所述试剂盒包含引物和包括扩增方案和结果分析的说明书,其中引物是选自以下的引物对:SEQID NO:69-80,优选地选自以下的引物对:SEQ ID NO:69和70;SEQ ID NO:71和72;SEQ IDNO:73和74;SEQ ID NO:75和76;SEQ ID NO:77和78;和SEQ ID NO:79和80;优选地,扩增区域通过选自SEQ ID NO:81-86的探针检测,优选通过选自SEQ ID NO:87和88的通用报告分子检测。
在另一方面,公开了一种用于对处理、分离和扩增过程进行质量控制的方法,其包括:
·样品处理;
·核酸分离;
·通过扩增反应生成3个长度明显不同的KIF11扩增子;
·确定每个所述KIF11扩增子的Cq值;
其中KIF11扩增子的Cq值是处理、分离和扩增的质量控制的量度。
在又一方面,公开了试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)被设计用于与KIF11基因的扩增子退火的至少一种探针;
(b)进行退火反应所需的产品和试剂;和
(c)使用说明;
其中探针是其至少一部分对如本文所述的扩增子特异的探针。
在另一方面,公开了一种用于生物样品的自动化处理的系统,所述系统包括:
·被配置成包含一个或多个样品处理模块的外壳,每个样品处理模块被配置成容纳如本文所述的可拆卸卡盒,其中所述系统被配置成操作样品处理模块以执行PCR以确定一种或多种靶基因的存在和/或数量并任选地确定相应可拆卸样品卡盒内的一种或多种靶DNA序列的水平,其中对相应可拆卸样品卡盒内的样品的所述处理执行包括以下的方法:
·在用于接收所述卡盒的生物样品的入口中提供样品;和使用所述卡盒:
·用于从入口接收的生物样品分离核酸的工具,所述工具能够与用于接收生物样品的所述入口流体连通;
·与用于接收生物样品的所述入口流体连接并定位在所述入口的下游的包含用于执行PCR的试剂和/或缓冲液的多个腔室;
·所述多个腔室包括含有PCR混合物的腔室;
·所述多个腔室包括含有用于扩增KIF11基因的全部或区域的引物的至少一个腔室;和
·所述多个腔室包括含有用于检测所述KIF11基因的全部或区域的探针的腔室,
·在所述腔室中进行核酸扩增以检测和/或定量所述靶核酸,其中所述KIF11基因用作内部对照,从而检测和/或定量所述靶核酸。
在优选的方面,在方法、用途、试剂盒、部件的试剂盒、系统及其组分中,靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的并且当与靶标结合时包含茎环结构。
在另一方面,公开了一种用于进行PCR以检测和/或定量一种或多种靶基因并任选地检测和/或定量核酸的试剂盒,所述试剂盒包括含有如本文所述的卡盒和任选地使用说明的容器。
附图说明
为了更全面的理解,参考以下结合附图的详细描述,其中:
图1:显示了一般工作流程,其中所有通用试剂(即非测试组特异性的试剂)都存在于通用卡盒内,而测试组特异性试剂和样品由用户通过通用卡盒的样品入口添加;
图2:显示了介体探针PCR的反应机制。聚合酶对正向(FW)引物的延伸导致介体探针的靶特异性组分的水解和游离介体的释放。下一步,游离的介体可以结合到通用报告分子。注意,通用报告分子的荧光团和猝灭剂可以互换(未显示)。在游离介体的延伸后,通过猝灭剂的置换或荧光团修饰和/或猝灭剂或荧光团连接的核苷酸的水解产生荧光信号(未显示)。注意,未水解的介体探针和通用报告分子不能被聚合酶延伸(如方块所象征性地指示的);RE引物是反向引物。
图3:显示了在96孔格式qPCR仪器中在单重(即仅包含扩增1个靶标所需的引物)以及多重(即包含扩增多个靶标所需的引物)中使用ARMS引物进行突变检测的性能。如图例所示在PCR反应(其始终包含10,000个基因组野生型DNA拷贝,以及引物和介体探针的寡核苷酸混合物以及通用报告分子,和聚合酶、dNTP和PCR盐)中以各种浓度添加靶标作为合成突变靶标(EGFR G719A;EGFR InsFQEA、EGFR L861Q)。图A显示原始曲线,图B显示Cq值;X轴:PCR循环数,Y轴:任意荧光单位;。实心方块表示存在10,000个基因组野生型DNA拷贝但未添加合成突变靶标的情况。
图4:显示了在集成的样品到结果仪器中以多重检测(即,使用包含扩增多个靶标所需的引物以及介体探针的寡核苷酸混合物)使用ARMS引物进行突变检测的性能。通过样品入口将靶标作为各种浓度的合成突变靶标,连同包含引物和介体探针的寡核苷酸混合物,以及预先定量为包含约7,000个拷贝的基因组DNA/PCR室的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)临床样品一起添加。通用报告分子、聚合酶和dNTP被点样在卡盒的不同腔室中。突变体(合成靶标):每次PCR 100(1.4%)–50(0.7%)–10(0.1%)-0(0.0%)个拷贝。PCR盐是液化缓冲液的一部分,其是通用的并且存在于卡盒的一个试剂容器中。RFU=相对荧光单位,即从集成的样品到结果仪器的qPCR组件获得的信号;
图5:显示了在集成的样品到结果仪器中以多重检测(即,使用包含扩增多个靶标所需的引物以及介体探针的寡核苷酸混合物)进行野生型基因组DNA的检测的性能。包含引物和介体探针的寡核苷酸混合物,以及FFPE临床样品或提取的DNA通过样品入口添加。通用报告分子、聚合酶和dNTP被点样在卡盒的不同腔室中。PCR盐是液化缓冲液的一部分,其是通用的并且存在于卡盒的一个试剂容器中。Y轴代表信号强度,X轴代表循环数,A-E代表不同的PCR室;
图6:显示了使得能够区分相邻标记的概念。ARMS引物现在包含茎环结构,其中茎可以任选地由靶序列组成。
图A显示了具有茎环结构的ARMS引物的一种设计,其中引物的3'-末端包含对靶序列特异的序列。介体探针的结合位点与ARMS引物(表示为“具有茎环的FW引物”)重叠(至少部分重叠)。当靶标未被扩增时,介体探针无法与靶序列结合,因此无法产生信号。介体探针也不能与ARMS引物结合,因为它处于茎环配置中,因此介体探针无法接近。当靶标被扩增时,聚合酶可以展开茎结构,从而为介体探针创建结合位点。一旦结合,游离介体随着另一个引物的延伸而释放,并且游离介体可以与点样的通用报告分子结合并产生信号;
图B显示了具有茎环结构的ARMS引物的替代设计,其中茎环结构定义了引物的5'端,并可用作通用尾标签。类似于图A,介体探针2的结合位点与ARMS引物(表示为“G12C引物”)重叠(至少部分重叠)。当靶标未被扩增时,介体探针2无法与靶序列结合,因此无法产生信号。介体探针2也不能与ARMS引物(G12C引物)结合,因为它处于茎环配置中,因此介体探针无法接近。当靶标被扩增时,聚合酶可以展开茎结构,从而为介体探针创建结合位点。一旦结合,游离介体随着另一个引物的延伸而释放,游离介体可以与点样的通用报告分子结合并产生信号。介体探针1的存在是兼性的,但可以用作阳性对照和/或用于增加检测靶标的选择。介体探针从5'至3'由第一部分(其中第一部分包含与相应的通用报告分子(通用报告子)的UGST结合位点互补的独特通用序列标签(“UGST”))、第二部分(其中第二部分与靶标(介体探针1)互补或与ARMS引物(介体探针2)互补)和聚合酶延伸阻断剂(由方框指示)组成。通用报告分子(通用报告子)是单链DNA,并且包括:i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;ii)茎环结构;iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;和v)聚合酶延伸阻断剂。
图C显示了使得能够区分相邻标记的“FuseTag”概念。与图B相比,正向ARMS引物被修饰(“FuseTag”引物),现在从5'到3'包括:第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”),当释放时其在图6C中表示为游离介体2;茎环结构;和第二部分,其中第二部分与靶标互补(并且优选地是等位基因特异性的)。当未通过FuseTag引物扩增特定靶标时,不会释放独特的通用序列标签(介体2),因此无法产生信号。然而,介体探针1仍可被多重反应混合物中存在的另一种正向引物水解。
图7:显示了根据图6中所示的概念以多重检测(即,使用包含扩增多个靶标所需的引物以及介体探针的寡核苷酸池)区分KRAS G12C与KRAS G12D和野生型背景的演示。将使得能够选择性扩增KRAS G12C的具有茎环的ARMS引物与反向引物以及被设计为结合掺入的KRAS G12C ARMS引物的茎环部分的介体探针一起添加。该混合物还包含10,000个野生型DNA基因组拷贝,以及聚合酶和进行功能性PCR反应所需的所有其他成分。将合成的KRASG12C突变靶标(参见顶部图A和底部图B的左侧部分)或合成的KRAS G12D突变靶标(参见顶部图A和底部图B的右侧部分)在10倍滴定系列(估计具有输入5000-500-50-0个拷贝/PCR)中添加到混合物中。将混合物添加到96孔qPCR兼容板的不同孔中。顶部代表PCR曲线,底部显示相同PCR曲线的Cq值。观察到的数据表明,ARMS引物中的茎环使得能够在野生型DNA的10,000个基因组拷贝中将KRAS G12C与KRAS G12D和野生型背景区分至低至500个拷贝和更低;图C显示了在预先定量为每个PCR室含有约10,000个基因组DNA拷贝和如图所示的各种拷贝数的合成突变靶标的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)野生型样品存在的情况下,在集成的样品到结果仪器中用于KRAS G12C的具有茎环的相同ARMS引物的性能。
图8:显示了如何使用基于KIF11的QC plex验证片段化的程度。右边的图显示了高质量的样品;在这种情况下,所有曲线(1、2和3)都在相同的Cq值附近穿过阈值。在中间图中,中间(2)和最长(3)扩增子的曲线向右迁移(即,向更高Cq值的方向)。这意味着样品包含较少的“长”DNA,因此是片段化的。左侧图代表一个非常片段化的样品,这可以通过最长扩增子(3)的qPCR结果的缺失和中间扩增子(2)的向更高Cq值的迁移看出。
图9:显示了由介体化学检测到的长和短KIF11扩增子之间的ΔCq与评估的FFPE样品中的DNA片段化程度密切相关。短KIF11扩增子的拟合曲线用带圆圈的线表示,而长KIF11扩增子的拟合曲线用规则线表示。图A-D如下显示:(A)无片段化,高质量gDNA样品,ΔCq(长-短):0.2;(B)低片段化样品;ΔCq(长-短)1.2(左)和0.9(右);(C)中等片段化样品;ΔCq(长-短)4.7(左)和5.6(右);(D)高片段化样品;ΔCq(长-短)9.4(左)和N/A(未检测到长扩增子;右)。
图10:在96孔格式qPCR仪器中使用FuseTag引物在单重PCR中对四个不同靶标的突变检测。左上:BRAF V600E;右上:EGFR E709K;左下:EGFR S768I;右下:EGFR L861Q;X轴表示PCR循环数;Y轴表示荧光(任意单位)。在PCR反应(始终包含2,000个基因组野生型DNA拷贝,以及通用报告分子和聚合酶、dNTP和PCR盐)中添加200个拷贝的靶标作为合成突变靶标。黑线表示gDNA背景中200个拷贝的扩增结果,灰线表示存在基因组野生型DNA,但未添加合成突变靶标。
图11:在gDNA背景下在96孔格式qPCR仪器中使用FuseTag引物在多重PCR中进行突变检测。将靶标作为各种浓度的合成突变靶标与包含引物和介体探针的寡核苷酸池以及1000个基因组野生型DNA拷贝一起添加。将通用报告分子、聚合酶、dNTP和PCR盐(例如MgCl2)与含有从FFPE样品释放DNA所需的成分的液化缓冲液一起添加到每个反应中。三角形表示500个拷贝的BRAF V600E靶标;实心圆圈表示100个拷贝的靶标;菱形表示20个拷贝的靶标。方块表示阴性对照,即0个拷贝的靶标。X轴表示PCR循环数;Y轴表示荧光(任意单位)。
发明详述
本公开内容提供了方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统及其组分,其用于在通用检测卡盒中使用定制的遗传靶标测试组来执行遗传靶标的多重检测。
已显示系统或系统的一部分、方法、试剂盒、部件的试剂盒及其组分可用于在只需要单个样品入口源的设备中在可以超过可以在单个PCR反应室中区分的荧光信号的数量的多重检测中使用通用的(即非靶特异性的,因此可以大量购买,因此价格便宜)荧光标记的报告分子检测一种或多种靶序列的存在。相比之下,同时代的技术受到单个PCR反应中可以区分的荧光信号数量的限制(例如,在使用传统技术的IdyllaTM的情况下,可以区分6个信号,因为进入每个不同的PCR室(只有1个样品入口)的信号没有区别)。利用本发明的技术,可以使用通用的荧光标记的报告分子,同时可以利用设备中可用的所有PCR反应室中的多重能力。
在第一个一般方面,提供了一种用于检测多个遗传靶标的方法,该方法包括:提供多个寡核苷酸子集的混合物,每个所述子集对遗传靶标是特异的并且包含对所述子集独特的通用序列标签,
其中每个所述子集适应于在核酸扩增条件下和在遗传靶标的存在下产生包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物;与所述混合物分开地,提供整合的流体卡盒,其包含(i)用于接受生物样品和/或混合物的入口,(ii)位于入口下游的核酸分离室,(iii)用于核酸扩增的试剂;(iv)位于核酸提取室下游的一个或多个核酸扩增室,和(v)多个通用报告分子,其中多个通用报告分子中的每一个包含特异于包含在可检测的核酸产物之一中的独特通用序列标签的通用序列,并且适应于在存在所述可检测的核酸产物的情况下产生信号;其中混合物和生物样品或分离的核酸由用户插入卡盒中,该方法进一步包括在插入生物样品和混合物之后操作卡盒,其中操作包括(在卡盒内)从生物样品分离核酸,然后进行包含混合物的多重核酸扩增;如果从所述扩增产生至少一种可检测的核酸产物,则检测从包含在集成流体卡盒内的多个通用报告分子中的至少一个生成的信号。
如本文所用,术语“遗传靶标”(其在本文中可与“靶核酸”互换使用,除非上下文另有要求)是指可以通过诊断测定进行靶向以用于检测或研究的任何基因、转录物、一般性的核酸或上述任何的片段或形式。遗传靶标的实例包括但不限于基因,有时称为“靶基因”,基因突变体,基因内的特定突变或短核苷酸多态性(SNP),等位基因形式或遗传变体。如本文所用,术语“变体”可指代任何遗传变体,即已知或预期在遗传样品中不同的任何遗传特征。如本文所用的术语“变体”可被解释为一种类型的“遗传靶标”并且可指特定突变、SNP或遗传重排,包括重复和缺失。遗传重排、重复和缺失可能影响小区域,例如一个或几个碱基对(bp)的区域,或大区域,例如延伸到多个千碱基对(kbp)的大染色体缺陷。在本文中,术语“变体”通常是指需要在受试者中监测的组织与正常组织之间的已知遗传差异,并且可以被视为与符合其在分子生物学和生物技术领域中使用的标准含义的术语“特定等位基因”、“突变”、“SNP”、“变体”同义的术语。当本文提到引物对的成员是等位基因特异性的时,所述成员将在适当条件下结合特定等位基因但不结合基因的任何其他等位基因。类似地,当本文提及等位基因特异性探针时,所述探针在适当条件下将结合和/或检测基因的特定等位基因而不是任何其他等位基因。
如本文所用,术语“寡核苷酸”涉及相对短或寡聚的、通常低于200个核苷酸(“nt”)的核酸。寡核苷酸通常是合成的,并且可以包含各种修饰,如修饰的碱基,或与具有不同功能的各种分子缀合等。如本文所用,术语“寡核苷酸子集”应解释为是特异于“遗传靶标”的寡核苷酸的功能性连接的组。取决于应用,寡核苷酸子集中的寡核苷酸通常将在覆盖遗传靶标或位于遗传靶标侧翼的序列内或周围杂交,可能以使得能够进行遗传靶标的扩增或检测。典型的靶特异性寡核苷酸子集将包括至少一种引物,可能是引物对,并且还可能包括对遗传靶标例如遗传变异体或介体探针特异的寡核苷酸探针。通常,术语“寡核苷酸混合物”将在本文中用于描述靶特异性扩增引物对(“寡核苷酸子集”)和探针,优选靶特异性探针,甚至更优选介体探针。如本文所用,“多个寡核苷酸子集”或“多个遗传靶标”或“多个寡核苷酸混合物”中的术语“多个”应理解为指多于一个,例如多个遗传靶标。在多重扩增或多重PCR的上下文中,术语“多重”通常指多于1个,例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或在10的倍数的范围内。然后,术语“多个寡核苷酸子集的混合物”应解释为包含混合在一起的多个寡核苷酸子集的组合物,可能是溶液或其至少部分干燥的形式(例如冻干的)。在某些上下文中,术语“混合”也可以指包含多个寡核苷酸子集的“测试组”或“集合”。
如本文所用,术语“核酸”及其等同物“多核苷酸”被赋予本领域中的常规含义并且是指由核苷酸单体之间的磷酸二酯键结合在一起的主要地核糖核苷酸或主要地脱氧核糖核苷酸的聚合物。(脱氧)核苷酸是(脱氧)核苷的磷酸化形式,最常见的包括腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷或尿苷。这些核苷由戊糖(核糖或脱氧核糖)和含氮碱基(“核碱基”,或简称为“碱基”,包括腺嘌呤、鸟嘌呤(嘌呤)、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶(嘧啶)组成。这些碱基(或它们的核苷,或后者的核苷酸)在核酸链中遵循的序列被称为“核酸序列”,并且通常以所谓的5'-末端到3'-末端方向(指的是核酸链的化学取向)方便地给出。“5'”源自对核酸序列读取开始的第一个(脱氧)核糖环的5'碳的引用,和“3'”源自对核酸序列读取结束的最后一个(脱氧)核糖环的3'碳的引用。核酸序列可以例如是ATATGCC,其在本文中被解释为指5'-ATATGCC-3'核酸序列。在相同的约定下,后一个序列将与序列5'–GGCATAT–3'或简称为GGCATAT互补。核酸包括但不限于DNA和RNA,包括基因组DNA、线粒体DNA或甲基化DNA、cDNA、mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、microRNA、lncRNA、siRNA及其各种修饰形式。核酸通常可以从自然资源,例如从不同类型的生物体中获得的生物样品获得。另一方面,也可以通过任何已知的人类设计方法(例如PCR)合成、重组或以其他方式生产核酸。
如本文所用,在与卡盒分开提供的多个寡核苷酸子集的混合物或与所述混合物分开提供的卡盒的特定上下文中的术语“分开”应被理解为在混合物和卡盒之间不存在物理连接,直到用户将混合物或其中的一部分插入卡盒的那一刻。例如,混合物可以在小瓶或管或任何其他容器内以液体形式提供。在这种情况下,用户将打开这种容器并将包含混合物的其内容物倒入或更可能通过借助于例如移液管转移到卡盒中。或者,可以将混合物点样和/或吸收到固体介质(例如纤维素或一张羊皮纸)上,并在结合到所述介质上时提供到卡盒中。还存在其他替代物,包括珠子、可溶解的药片或胶囊等。在任何这些情况下,本发明上下文中的混合物在物理上不包含在卡盒内部,直到在还向卡盒中提供生物材料或分离的核酸之前、一起或者之后由用户转移到卡盒。在可能的情况下,混合物和卡盒甚至可以在不同的时间点提供,例如,当它们在不同的日子出售或运送给用户时。
如本文所用,术语“生物样品”或简称为“样品”旨在包括各种样本或生物来源的溶液,其含有核酸和/或细胞材料,无论其是否新鲜地从生物体获得(即新鲜组织样品)或通过本领域已知的任何方法保存(例如冷冻或FFPE样品)。生物样品的实例包括:细胞(例如哺乳动物细胞以及真核微生物)的培养物、体液、体液沉淀物、灌洗样本、细针抽吸物、活检样品、组织样品、癌细胞、从患者获得的其他类型的细胞、来自正在接受针对疾病或感染的测试和/或治疗的个体的组织的细胞或体外培养的细胞,或法医样品。体液样品的非限制性实例包括全血、骨髓、脑脊液(CSF)、腹膜液、胸膜液、淋巴液、血清、血浆、尿液、乳糜、粪便、射精液、痰液、乳头抽吸液、唾液、拭子标本、洗涤或灌洗液和/或刷子样本。一方面,样品是线粒体DNA、cDNA、mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、microRNA、lncRNA、cfDNA、细胞游离肿瘤DNA或siRNA样品。
如本文所用,术语“液体活检”或“液体活检样品”应理解为指代从受试者获得的任何非组织样本,尤其是体液样品。液体活检来源包括但不限于血液、血浆、血清、尿液、脑脊液(CSF)、羊水、其他体液例如唾液、汗液、眼泪、母乳、精液、粪便、胸膜液、腹膜液或洗涤液等。分析液体活检样品中的核酸可以最大限度地减少对昂贵、侵入性和经常疼痛的组织和/或肿瘤活检以实现动态疾病或其他生理状态监测的需求。例如,在癌症患者中,从液体活检中提取的细胞游离肿瘤DNA或RNA可潜在地用于检测突变、易位或拷贝数改变,以及特定癌症标志物的表达。血液(血浆、血清或全血等)是人中液体活检样品分析中使用的最常描述的流体。在癌症患者中,血液是通过肿瘤组织释放的循环肿瘤细胞(CTC)和分别包括循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤RNA(ctRNA)的细胞游离DNA(cfDNA)和细胞游离RNA(cfRNA)的来源,其可用于检测患者肿瘤中存在的突变。DNA可以是甲基化或未甲基化的。然而,值得注意的是,ctDNA仅构成血液中存在的cfDNA的一小部分,这凸显了最大化用于核酸分析的样品量以检测罕见突变的重要性。此外,cfDNA总是具有低的品质,并且被片段化成核小体的近似大小(140bp到170bp)。因此,对于某些癌症类型,包括肾癌、前列腺癌以及上尿路和下尿路上皮癌,替代的液体活检方法(例如尿液)可能是更丰富的肿瘤衍生材料来源。尿液还有其他独特的好处,例如易于获取(不需要训练有素的医务人员)、没有患者不适(增加的患者依从性),并且与血液相比可能含有更少的污染蛋白质。
此外,如本文所用,术语“核酸分离”应解释为从生物材料释放核酸以使其可用于扩增的任何形式。在本公开内容的范围内,该术语可以涵盖涉及生物样品的液化或在固体支持物(例如二氧化硅)上的任何核酸提取或纯化的任何程序。
术语“聚合酶链式反应”或“PCR”应理解为指依赖于热循环和至少引物(通常为引物对)和DNA聚合酶的使用的常见实验室核酸扩增技术。“定量PCR”或简称“qPCR”在本文中给出了基于PCR的实验室技术的定义,该技术用于扩增并可能同时检测或定量靶标DNA分子。与在反应结束时(即在热循环完成后)检测反应产物的标准PCR不同,qPCR的关键特征是随着反应“实时”进行,在热循环过程中检测DNA产物;因此,qPCR的别名是“实时PCR”。目前存在许多不同类型的qPCR。例如,当以逆转录(RT)步骤开始时,qPCR可用于定量信使RNA的数量,然后被称为逆转录酶qPCR或RT-qPCR。如本文所用,术语“定量PCR”或简称为“qPCR”将优先于术语“实时PCR”或“RT-PCR”使用,以避免与逆转录PCR混淆,逆转录PCR也经常缩写为RT-PCR。大多数qPCR使用以下最常见的方法之一来实时检测涉及荧光的产物扩增:(a)非特异性荧光染料与任何双链DNA的嵌入,(b)荧光由核酸结合荧光染料在与双链DNA结合后产生,(c)荧光团在引物延伸期间通过探针的消化释放,或(d)通过在核酸合成期间与靶标结合后发出荧光的与探针结合的荧光染料释放。当扩增反应发生时,实时监测反应混合物发出的荧光,但在最初的扩增循环中,荧光太低而无法与背景区分开来。热循环过程中产生的荧光信号由适当的光学检测系统检测,并从它们通过背景阈值的那一刻开始跟踪,直到反应达到稳定状态。可以使用相对或绝对定量策略来估计靶序列的拷贝数,通常通过分析获得的扩增曲线的形状(标准曲线策略)、与标准参考进行比较或通过确定信号何时上升到某个阈值(通常称为Ct值,但有时也称为Cp值或Cq值)以上来估计。在相对定量中,使用Ct或标准曲线分析在给定样品中估计的靶核酸水平表示为相对于在另一个参考样品(例如,未处理的对照样品)中针对相同靶标获得的值。相反,在绝对定量中,qPCR信号与使用标准曲线的输入拷贝数相关,或者也可以根据更新的数字PCR方法计算。目前,第一种策略仍然更为普遍,它通过将获得的值与先前制作的标准曲线进行比较来估计靶DNA的量。这些和其他qPCR定量策略在本领域中广为人知,并且它们的计算可以取决于给定的应用和qPCR系统或多或少地不同。
虽然荧光是迄今为止最常用的方法,但任何可测量的特性都可用于qPCR。
如本文所用,扩增反应的“定量循环”或“Cq”值被定义为荧光达到阈值所需的循环的分数,指示扩增曲线相对于循环轴的位置。由于Cq与靶标的起始浓度直接相关,而Cq值的差异与起始浓度比有关,因此Cq值与样品中靶核酸的量成反比,并与样品中的靶标拷贝数相关。较低的Cq值(通常低于29个循环)指示较高的靶核酸量。较高的Cq值(超过38个循环)意味着较低的靶核酸量。
ΔCq在本文公开的各种方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统或组分中计算,其是浓度的对数比,即靶核酸浓度的对数,针对参考核酸(例如KIF11基因或其区域)标准化的浓度。在一些实施方案中,ΔCq在第一和第二以及可能地第三KIF11扩增反应的阈值循环数(Cq)之间计算,作为基因组DNA的存在(完整性或污染)的量度。
已经确定,KIF11扩增子在Livak和Schmittgen(2001Methods25:402–8)开发的qPCR结果的双ΔCq分析或Pfaffl(2004Quantification strategies in real-timePCR.In M.W.Pfaffl,A-Z of quantitative PCR.La Jolla,CA,USA:InternationalUniversity Line)开发的用于相对定量的基于标准曲线法的分析中非常有用。
一般来说,qPCR测量的Cq结果主要取决于靶核酸的起始浓度,尤其是在同一实验中。因此,qPCR结果可以报告为ΔCq和双ΔCq值,它们分别代表实验之间的基因表达比率和倍数变化。因此,ΔCq=0表示靶核酸和参考基因的起始浓度相同。技术人员可以根据具体需要确定ΔCq和双ΔCq的值以考虑满足预设要求(例如核酸完整性、gDNA的污染、gDNA片段化、过程控制等)的实验。
输出信号(例如扩增反应中由可检测探针(例如荧光)产生的信号)的定量涉及将来自大集合的输入值映射到较小集合(通常具有有限数量的元素,例如舍入和截断)中的输出值的过程,并且可以通过本领域技术人员已知的任何方式(优选地通过使用专用软件的数字信号处理)执行。
标准化是指将在不同标度上测量的值(例如扩增反应中由靶核酸产生的信号)调整至概念上通用的标度(例如在扩增反应中用参考探针(例如KIF11)获得的信号)的过程。例如,将扩增反应中使用靶核酸获得的值调整至KIF11基因扩增反应的值,优选靶核酸和KIF11基因在相同扩增反应中扩增和/或从相同样品获得。
阈值表示可检测信号(例如荧光信号)超过基础阈值水平(“背景噪声”)所需的扩增循环数或扩增经过时间,指示阳性PCR结果。阈值可以是热循环扩增反应中的阈值循环数,或者阈值可以是等温核酸扩增反应中的时间值(例如扩增的经过时间)。阈值可以通过本领域技术人员已知的任何方式来确定。为了进行定量PCR,为在测试和校准样品中扩增的每个靶核酸确定循环阈值。重要的是用于确定阈值的方法给出可重现的值。通过将阈值定位在生长曲线的对数阶段,可以实现这种再现性。优选地,阈值源自生长曲线的一阶或二阶导数。
可以通过计算与生长曲线的一阶导数的正峰值相关联的循环数或时间值来确定阈值。阈值(例如,热循环扩增中的阈值循环数或等温扩增中的时间值)也可以由二阶曲线的峰的位置来表示。可以通过以下步骤确定核酸序列扩增的阈值:(i)从测量的信号导出核酸序列的生长曲线;(ii)计算生长曲线的导数;(iii)鉴定导数(例如一阶和/或二阶导数)的特征;和(iv)确定与导数的特征相关的阈值。
如本文所用,术语“引物”是指寡核苷酸,无论是天然存在的(例如在纯化的限制性消化物中)还是合成产生的,其在置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成(即在适当缓冲液(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅助因子等)中并且在合适的温度下存在不同的三磷酸核苷酸和聚合酶)的条件下时能够充当核酸序列合成的起始点。可以修饰引物的一个或多个核苷酸,例如,通过添加甲基、生物素或洋地黄毒苷部分、荧光标签或通过使用放射性核苷酸或通用可检测标记,在这种情况下引物可以用作探针。如本文所用,可互换使用的术语“变体特异性引物”或“等位基因特异性引物”是指特异性结合变体序列的引物。类似地,术语“变体特异性引物对”是指在PCR反应中旨在仅当存在变体时才产生扩增子的引物对。变体特异性引物对可以例如包括变体特异性引物,使得仅当存在变体并且变体特异性引物具有合适的结合位置时才产生扩增子。或者,变体特异性引物对可以包括两个引物,其只有在存在变体时才以正确的取向和合适的距离结合。例如,如果变体是缺失,则在不存在缺失的情况下,引物对的引物之间的距离可能太大而无法在PCR反应中产生扩增子。在存在缺失的情况下,变体特异性引物对的靶标结合引物具有用于扩增子生成的正确距离。相同的概念可以应用于基因重排。一种类型的变体特异性引物是所谓的“ARMS-引物”。ARMS是扩增受阻突变系统的缩写,其是用于鉴定点突变或多态性的PCR的一种常见应用,其中DNA通过等位基因特异性引物扩增。ARMS PCR使用一对引物,包括ARMS引物和通常共同的PCR引物。ARMS引物通常具有以下空间特征:(1.)长度通常为约20至40bp;(2.)引物的3'端的核苷酸通常与靶核苷酸互补,即G针对C或C针对G和T针对A或A针对T。此位置的错配可显著降低扩增。A:G、G:A和C:C错配具有最差的影响,而其他错配具有不同的影响程度。例如,在具有A-T取代的突变中,突变等位基因的ARMS引物应具有与核苷酸T互补的最后一个核苷酸,即它应具有A。相同位置处的正常等位基因的引物应与核苷酸A互补,即它应具有T;(3.)可能在ARMS引物的最后5到10个核苷酸之一处有额外一个或多个错配,以进一步提高其特异性。在一些实施方案中,等位基因特异性引物,例如ARMS引物,在与靶核酸序列杂交时包含茎环结构(参见例如图6)。术语“扩增子”是指产生遗传片段或靶序列的一个或多个拷贝(遗传片段或靶序列的扩增)的结果,其可以通过本领域技术人员已知的任何方式形成,例如通过PCR。在此上下文中,扩增反应是指产生遗传靶标或靶核酸的一个或多个拷贝。如本文所用,术语扩增子包括术语“PCR产物”。
所公开的方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统或组分涉及用于自动化系统(可能是PoC系统或设备)的卡盒。如本文所用,术语“卡盒”应理解为腔室和/或通道的独立组件,其形成为可作为一个配件在适用于接受或连接到这样的卡盒的较大仪器的内部或外部转移或移动的单个物体。卡盒和它的仪器可以被看作是形成自动化系统,进一步被称为自动化平台。在一些实施方案中,该系统还包括一种或多种反应组分,例如寡核苷酸混合物、报告分子和用于扩增反应的试剂,例如缓冲液、盐、酶等(“PCR混合物”)。包含在卡盒中的一些部件可以牢固地连接,而其他部件可以相对于卡盒的其他组分灵活地连接和移动。类似地,如本文所用,术语“流体卡盒”应被理解为包括适用于处理、加工、排放或分析液体优选流体的至少一个腔室或通道的卡盒。在WO2007004103中给出了这种卡盒的实例。有利地,流体卡盒可以是微流体卡盒。一般而言,如本文所用,术语“流体”或有时“微流体”是指处理在几何上被限制在至少在一或二维(例如宽度和高度或通道)上的小的、通常为亚毫米尺度的范围内流体的行为、控制和操纵的系统和布置。这种小体积流体在需要小尺寸和低能耗的微尺度下移动、混合、分离或以其他方式处理。微流体系统包括结构诸如微气动系统(压力源、液体泵、微阀等)和用于处理微升、纳升和皮升体积的微流体结构(微流体通道等)。在EP1896180、EP1904234和EP2419705中描述了示例性的和非常适用于本上下文的流体系统。与上文一致,术语“腔室”应被理解为流体或微流体组件内任何几何形状的任何功能上定义的隔室,由至少一个壁定义并包括执行归因于这个隔室的功能所必需的工具。按照这些思路,“扩增室”应被理解为(微)流体组件内的隔室,其适合执行并有目的地提供在所述组件中以执行核酸扩增。扩增室的实例包括PCR室和qPCR室。根据上文,在备选实施方案中,此类卡盒可包含寡核苷酸通用探针。除非上下文另有要求,否则术语“腔室”和“隔室”,包括复数形式,在本文中可互换使用。
术语“探针”一般涉及所述探针的任何可测量性质,当探针与分析物相互作用时该性质发生变化,因此可以研究探针与分析物之间的相互作用。探针优选是具有标签的核酸,例如通过放射性或化学标记,甚至更优选荧光标记。当靶标被扩增时,靶检测探针的可测量特性将发生变化,例如产生可测量信号,类似地,当KIF11被扩增时,KIF11检测探针的可测量特性将发生变化,例如产生可测量信号。优选地,由靶检测探针产生的信号不同于由KIF11检测探针产生的信号,从而允许区分信号。如本文所用,术语“通用报告分子”(在本文中与术语“通用报告分子”可互换使用)应解释为能够由于其与独特通用序列标签(至少部分地、优选基本上地与至少其部分互补)的杂交产生可检测信号或信号变化的任何寡核苷酸探针。在简化中,通用报告分子可以解释为标记的探针,特异于通用序列标签。在一些实施方案中,通用报告分子包含单链DNA分子,其包含以下元件:荧光团/猝灭剂对的第一成员;茎环结构;荧光团/猝灭剂对的第二成员;UGST结合位点,其与介体探针的UGST互补;聚合酶延伸阻断剂;其中荧光团/猝灭剂对的成员经由茎环定位以在不存在介体探针的UGST的结合和延伸的情况下猝灭荧光团。示例性、非限制性的通用报告分子如图2和图6所示。
如本文所用,术语“介体探针”指从5'到3'包含以下元件的单链DNA序列:第一部分,第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);第二部分,第二部分包含与靶核酸的第一链互补或与等位基因特异性引物的一部分(或等位基因特异性引物的一部分的互补物)互补的序列。举例来说,在一些实施方案中,等位基因特异性引物在与其靶标杂交时包含茎环结构。扩增后,引物的茎环序列成为扩增的序列的一部分(参见例如图6)。在一些实施方案中,介体探针的UGST与这样的茎环序列的全部或一部分或其互补物互补。
如本文所用,术语“茎环”(也被称为“发夹”)是指发生在单链核酸(例如引物和探针)中的分子内碱基配对,特别是当同一条链的两个区域(通常当以相反方向阅读时在核苷酸序列上互补)碱基配对以形成以未配对的环结束的双螺旋。该结构是茎环或发夹环。
术语“通用序列标签”应理解为不存在或可能以低至可忽略不计的丰度存在于从中检测遗传靶标的生物体的遗传信息中的序列,通常在寡核苷酸的长度范围内。可能的独特序列标签的实例包括但不限于nullomers、乱序合成序列、源自不同/系统发育上遥远的生物体的序列、独特分子标识符等。在通用序列标签的上下文中,对(寡核苷酸)子集(来自混合物)“独特”应理解为恰好一个通用序列标签对应于恰好一个特异于一个“遗传靶标”的“寡核苷酸子集”。如本文所用,“寡核苷酸子集”包括对靶标特异的那些寡核苷酸,并且包括但不限于一种或多种扩增引物,以及一种或多种探针,例如介体探针。
如本文所用,术语“可检测的核酸产物”是指来自遗传靶标与对所述靶标特异的寡核苷酸子集的扩增反应的产物或副产物。可检测的核酸产物应被理解为可凭借包含可被通用报告分子(例如具有标记的探针)检测的“独特通用序列标签”(“UGST”)而被检测。可检测的核酸产物的实例可以是掺入通用序列标签序列并用引物或引物对产生的扩增子,所述引物或引物对形成来自多个寡核苷酸子集的子集的一部分。备选的可检测的核酸产物可以被切割或以其他方式释放扩增子、引物或探针的部分,所述释放的部分在其序列中掺入通用序列标签。这种可检测的核酸产物的一个具体实例是通过切割(例如,通过聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性)释放并且包含通用序列标签例如独特通用序列标签的介体探针的第一部分。
简而言之,公开了一种方法,其中用户不仅将生物样品插入到卡盒中,而且还插入单独提供的多个定制靶特异性寡核苷酸子集的混合物。这与使用现有的测定特异性卡盒的程序(其中靶特异性寡核苷酸提供在卡盒内)形成对比。然而,在目前公开的实例中,为了能够在卡盒中进行多重核酸扩增,靶特异性寡核苷酸子集的混合物必须由用户提供到卡盒中,与可能包含由混合物定义的感兴趣的遗传靶标的样品一样。在从所述扩增产生至少一种可检测的核酸产物的情况下,产生信号并且信号可以从包含在卡盒内的多个通用报告分子中的至少一个检测到。
本文呈现的方法允许非常快速的定制测定设计,由此遗传靶标测试组可以完全由客户定义。在诊断卡盒制造商当前的生产流水线现实下,实现这种灵活性以设计完全由客户定义的测试组并将其移植到标准测试组特异性的卡盒中是根本不可能的。将标准测试组特异性卡盒投入市场以供可能单个用户的相对少量的使用的巨大努力和成本不仅无利可图,而且可能甚至不会带来所涉及的投资成本的回报。然而,在所公开的概念的范围内,其中主要投资花费在通用检测卡盒上,并且定制的测试组设计随后可以相对容易地流水线化,可能借助机器学习驱动的算法,用于监测肿瘤患者的个性化测试组变得可付诸实践。例如,在所公开方法的一个感兴趣的实例中,多个寡核苷酸子集中的至少一个,优选多个特异于在先前对来自从其获得生物样品并将其提供到卡盒中的个体的样品进行的下一代测序(NGS)分析中鉴定的遗传靶标。在这种情况下,例如,首先通过NGS分析来自患者的肿瘤样品以确定关键的肿瘤相关病变。基于结果,可以相对快速地设计和生产包含特异于选定的已鉴定的病变和感兴趣的基因的寡核苷酸试剂的靶特异性寡核苷酸子集的定制测试组。从这一刻起,可以使用通用检测卡盒、定制设计的测试组和来自所述患者的样品(例如血液或血浆)轻松且经济高效地监测所选病变和基因的状态。像这样,在手术或治疗过程之后,在分子水平上监测和监督患者的肿瘤状态和反应的任何可能的需要医疗干预或治疗改变的情况,而无需重复NGS分析。
在所公开的方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统和组分的下一个实例中,与前一个兼容,多个通用报告子被固定在集成流体卡盒的内部,优选地通过被固定在一个或多个核酸扩增室的内部。取决于给定通用卡盒的设计,固定可以通过本领域已知的共价键合或亲和力相互作用来完成,这可用于基于具有受控液体流动的通道的整体或蚀刻芯片状结构的通用卡盒。另一种选择包括在含有基质的斑点溶液中提供试剂,随后可以将其干燥或冷冻干燥成玻璃态或类似的,不仅固定试剂,而且保护它们并稳定它们的储存寿命。在与水溶液接触时,这种干燥的基质变得水合并释放捕获在其中的试剂。与此一致,在所公开的方法、系统、组分、试剂盒、部件的试剂盒的一个实例中,多个通用报告分子被固定在斑点溶液中。
如果这种固定是在一个或多个扩增室内进行的,那么其他试剂自然可以与通用报告分子一起包括在斑点混合物中,其可以包括例如dNTP和/或酶如聚合酶和逆转录酶。取决于稳定性考虑,可以将具有不同试剂的一个或多个斑点放置在所选的隔室中。
在另一个可能的实例中,与所公开的方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统和组分的任何上述实例相兼容,提供斑点溶液,例如包括甲基化敏感性酶。按照这些思路,可以将甲基化敏感限制酶(MSRE)或甲基化依赖性限制酶(MDRE)添加到斑点溶液中。当包含分离的DNA和多个寡核苷酸子集的混合物的混合物进入PCR室时,MSRE/MDRE在特定温度(20-50℃,通常为30-37℃)下孵育时消化未甲基化/甲基化的识别位点。在下一步中,将DNA、靶特异性寡核苷酸子集和MSRE/MDRE的混合物加热至50-110℃之间的温度,通常在70-99℃之间以灭活MSRE/MDRE。同时,任选地,可以激活热启动PCR酶,然后进行典型的qPCR循环方案。使用这种方法,可以在相同的通用检测卡盒中轻松检测到任何甲基化特征。
点样通用报告分子和/或其他试剂是很简单的,并且与延长的保质期呈正相关。取决于试剂类型,可以使用不同的斑点溶液成分或固定化工具。也可以在不同的隔室或通道中为诸如MSRE/MDRE的试剂点样或固定位置,这取决于给定的卡盒基础设施、加热器的位置等。例如,它们也可以提供在扩增室的上游。
在给定隔室中放置不同试剂和运行过程的选择通常将取决于特定通用卡盒的内部设计。在所公开的方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统和组分的下一个可能的实例中,与之前的任何实例兼容,多重核酸扩增和来自多个通用报告分子的至少一个的信号的产生在一个或多个扩增室内进行。这种安排允许实时监测反应和靶标检测,以及将扩增过程中产生的可检测的核酸产物放置在通用报告分子附近。也可以备选地设想使用流动池并将扩增和信号检测分开的其他布置。
在本文公开的方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统和组分的另一个可能的实例中,从生物样品分离的核酸和多个寡核苷酸子集的混合物可以在集成的流体卡盒内移动到至少两个或更多个不同的扩增室中。这至少在两种情况下是有益的。一,如果考虑同一反应的重复,例如两次重复或三次重复,例如对于边界可检测的低拷贝数靶标,或者,二,对于具有与扩增室相关联和适用于捕获来自其中提供的报告分子的信号的定义或固定数量的波长特异性检测通道的自动化系统。在后一种情况下,通过在多于两个扩增室之间分离核酸和寡核苷酸池混合物,可以通过在不同的扩增室中提供或点样不同的通用报告分子来从多重反应中检测更多的靶标,即使不同的通用报告分子可以是与在相同通道中可检测的染料缀合。因此,在该实例的一个可能实例中,不同的通用报告分子被提供在同一卡盒内的不同扩增室中。
此外,在上述实例的一个实例中,在存在可检测的核酸产物的情况下生成的信号可以从发光染料生成,并且可能其中包含不同通用报告分子的不同扩增室包含一组相同或至少部分重叠的发光染料。按照这些思路,如果我们想象具有3个扩增室的通用检测卡盒,每个隔室在4个不同的通道(例如红色、黄色、绿色和蓝色)中监测,核酸和寡核苷酸池混合物将在3个隔室之间分离。在3个隔室中的每一个中,会发生相同的多重扩增,并且在每个隔室中,4个不同的通用报告分子可以在4个不同的通道(红色、黄色、绿色和蓝色)中发出信号表明存在扩增的可检测的核酸产物。鉴于每个隔室的4个不同通用报告分子中的每组都可以特异于来自多重检测的不同靶标,来自多重检测的12个不同靶标可以与3个扩增隔室中的12个不同检测事件相关联,每个隔室允许在4个通道中的检测。在最后两个实例的可能实施方案中,出于时间考虑,可以在所述两个或更多个扩增室中的每一个中同时进行使用混合物的多重核酸扩增。
在另一方面,提供了公开的方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统和组分,其中多个寡核苷酸子集中的一个或多个至少包含含有独特通用序列标签的引物,并且可检测的核酸产物是包含所述独特通用序列标签的扩增子。在这个简单的实施方案中,寡核苷酸子集可仅包含靶特异性引物对,其中每个这样的配对的引物中的一个例如在茎环结构中包含通用序列标签,其可在通用检测卡盒中通过通用报告分子检测。在这种情况下,可检测的核酸产物是作为多重扩增的一部分产生的扩增子本身。
在所公开的方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统和组分的一个完全不同的替代实施方案中,提供了其中多个寡核苷酸子集中的一个或多个包含至少一种引物和至少一种介体探针,所述介体探针包含独特通用序列标签,并且其中可检测的核酸产物是包含所述独特通用序列标签的切割的游离介体。该实施方案基于Albert Ludwig University ofFreiburg的EP2776585中公开的介体化学原理,并示意性地显示在图2中。它已被评估为在如下面的实施例部分所述的原型卡盒中非常有效地工作。我们通过将其与ARMS引物相结合进一步修改了原始原理,从而提高了灵敏度。因此,在后一个实例的一些实施方案中,至少一种引物是ARMS引物。
为了更好地区分紧密定位的突变,某些靶特异性ARMS引物被进一步修饰以包括茎环结构,其中茎可以任选地由靶序列组成。我们进一步修饰介体探针,使其至少部分与茎环修饰的ARMS引物重叠,概念如图6所示。在上图A中,ARMS引物的5'末端包含与靶序列互补的序列,而在下图B中,ARMS引物的5'末端以茎-环-茎结构终止,该结构用作通用尾标签,其具有简化此类引物的设计的优势。ARMS引物的茎的3'组分可以具有源自靶序列的序列,或者可以是另一个序列。当靶标未被扩增时,介体探针无法与靶序列结合,因此无法产生信号。介体探针也不能与其在ARMS引物内的互补序列结合,该序列位于茎环配置内部,因此介体探针无法接近。当靶标被扩增时,聚合酶可以展开茎结构,从而为介体探针创建结合位点。一旦结合,游离的介体随着另一个引物的延伸而释放,游离介体可以与点样的通用报告分子结合并产生信号。与上文一致,在后两个实例的具体实施方案中,ARMS引物包含茎环结构,并且优选地,介体探针序列还与所述茎环结构中包含的序列至少部分重叠。
在另一个实例中,提供了一种方法,其中在多个寡核苷酸子集的混合物的存在下,可能在核酸提取室内,进行从生物样品的核酸分离。在这种特定情况下,用户可以将多个寡核苷酸子集的混合物与生物样品一起添加到卡盒中,从而节省时间。令人惊讶的是,我们观察到它在基于IdyllaTM的通用卡盒原型上与包括液化方案的核酸分离方案一起工作得非常好。备选方案包括首先提供多个寡核苷酸子集的混合物,并将其更深地泵入内部卡盒空间,然后在混合物达到卡盒中所需的隔室后添加生物样品,并且只有它们启动核酸分离方案。另一种选择可能涉及在卡盒内包括两个入口,一个用于混合物,一个用于生物样品。
在一些实例中,提供了方法、用途、试剂盒、部件的试剂盒、系统和组分,其中生物样品是固体组织样品,可能是固定的固体组织样品,优选福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。在这种情况下,核酸分离可以有利地包括所述实体组织样品的液化或由其组成。
在备选实例中,提供了方法、用途、试剂盒、部件的试剂盒、系统和组分,其中生物样品是液体活检样品。在所述实例的一个特定实施方案中,提供了方法、用途、试剂盒、部件的试剂盒、系统和组分,其中核酸分离包括细胞游离核酸的分离。在后一实施方案的进一步实施方案中,核酸分离可有利地包括核酸提取(优选在固体支持物上)或由其组成。
在进一步的实例中,提供了方法、用途、试剂盒、部件的试剂盒、系统和组分,其中来自多个寡核苷酸子集的混合物的至少一部分寡核苷酸子集是通过计算机实现的方法(包括机器学习或人工智能)设计的。
对照是任何实验和基于此类实验的任何决定的稳健性的关键,尤其是在使用敏感技术(例如靶基因的扩增)时。然而,有必要记住,对照基因的成功扩增只能提供有关靶基因本身完整性的间接信息。因此,必须审慎地选择合适的对照基因。至少一个要求是对照基因不容易在包括癌症在内的广泛疾病中发生变异,例如体细胞突变或拷贝数改变。此外,在典型情况下,通过跟踪靶基因的变化来评估治疗方案在各种疾病情况下的效果,因此需要针对参考基因对数据进行标准化。因此,选择参考基因的一个关键先决条件是它们不应受到治疗的影响。迄今为止,最常用的参考基因是管家基因(HKG)。然而,针对随机HKG的数据标准化可能会导致用于比较治疗条件的标准化因子的计算错误,从而隐藏样品之间的生物学差异。事实上,只要拷贝数、参考基因的稳定性、感兴趣的靶基因和疾病之间的关系是未知的,就很难选择合适的参考基因。在此,我们确定了驱动蛋白家族成员11基因(“KIF11”;NCBI Entrez基因:3832)在几乎所有可获得公共数据的癌症类型中的拷贝数改变和体细胞突变方面以及SNP方面具有高度基因组稳定性。KIF11被鉴定为非常有前途的通用对照,很可能在全球任何人群中提供一致的性能。
由于我们将KIF11鉴定为大多数癌症类型中出奇稳定的基因组区域,因此KIF11基因或其部分(例如KIF11区域)可在广泛的方法中(如PCR、LCR、NGS、CGH)用作普遍适用的基因组参考靶标(参考基因),作为管家参考基因的替代或附加于同时使用的管家参考基因,例如Lemma等人(Identification and Validation of Housekeeping Genes for GeneExpression Analysis of Cancer Stem Cells,PLOS ONE|DOI:10.1371/journal.pone.0149481February 19,2016)中描述的。使用这种普遍适用的参考基因在多基因测试组中特别有用,因为它允许在评估不同基因中突变的存在时仅使用单个参考基因,而不是在每个不同基因中使用稳定区域作为参考基因来评估相应基因中突变的存在,这将需要在测试设备的多重设施中使用更多的试剂和更多的空间。
在一些实例中,提供了方法、用途、试剂盒、部件的试剂盒、系统或组分,其中多个寡核苷酸子集的混合物包含对KIF11基因中的区域特异的子集。在它们可能的实施方案中,KIF11基因中的所述区域用作基因组参考基因,或者备选地,用所述子集产生的KIF11扩增子用作基因组参考基因。本实例的优选实施方案涉及人KIF11基因,但也可能涉及其其他哺乳动物同系物。在具体实例中,KIF11中的区域位于以下外显子6、8、18、21、内含子6、外显子21-内含子21边界或KIF11基因的非编码区中的任一个中。在进一步的实施方案中,提供了方法、用途、试剂盒、部件的试剂盒、系统或组分,其中多个寡核苷酸子集中的一个或多个包含对人KIF11基因中的区域特异的引物,优选地其中多个寡核苷酸子集中的至少两个包含对人KIF11基因中的不同区域特异的引物,其中所述引物被设计成产生两个长度明显不同的KIF11扩增子。本文使用的术语“KIF11扩增子”是指KIF基因或KIF11区域的扩增子,其中扩增子分别是KIF11基因或KIF11区域的扩增反应的结果。“KIF11区域”是指KIF11基因的片段或部分。KIF11基因是指开放阅读框,并且包括5'和3'非翻译区(UTR)以及位于5'和3'的调节序列。因此,术语“KIF11基因的非编码区”意指5'和3'非翻译区(UTR)以及位于5'和3'的调控序列。
由于我们将KIF11鉴定为大多数癌症类型中令人惊讶地稳定的基因组区域,无论本文公开的方法、用途、试剂盒、部件的试剂盒、系统或组分如何,使用KIF11作为基因组参考靶标或管家基因参考在本文一般性地公开用于任何DNA或RNA扩增反应,特别是在癌症中。在具体实例中,KIF11中的区域位于KIF11基因的以下外显子6、8、18、21、内含子6、外显子21-内含子21边界或非编码区中的任一个中,并在此公开为合适的基因组参考靶标区域。
在一个实施方案中,KIF11或KIF11区域可用作评估gDNA完整性的参考基因。基因组DNA(gDNA)完整性对于gDNA质量的定义起着至关重要的作用,并可能影响下游分子应用,例如PCR、比较基因组杂交(CGH)或全基因组测序方法。有几个因素影响gDNA的完整性,主要是由于分析前的程序,例如样品DNA储存、反复冻融、保留在试管中、蒸发和/或变性。其他因素诸如湿度、温度和温度变化、核酸酶和其他化学试剂的持续存在以及运输期间和gDNA提取过程中可能出现的其他次优条件也会损害gDNA的完整性。gDNA的完整性是实验的稳健性和可重复性的决定因素,尤其是对于避免假阴性而言。高质量的gDNA(例如完整性未受损的gDNA)是指基本上纯的、完整的、双链的、高度浓缩的和/或未被污染的gDNA,但至少适用于基于gDNA的预期的实验程序。本文提供的使用KIF11的方法特别适用于确定gDNA片段化。如本文所用,“gDNA片段化的不存在”意指用本发明的方法没有可检测到的gDNA片段化,包括没有gDNA片段化,例如完整的gDNA。
KIF11基因中的区域和用于产生KIF11扩增子的KIF11特异性引物对的成员(例如正向和反向引物)的位置以及用于本发明的KIF11扩增子的长度可以根据本领域技术人员的需要进行确定。例如,如果gDNA靶标的扩增子长度大约是这个短KIF11扩增子的长度,则可以包括短的KIF11扩增子作为阳性对照。如果靶标的扩增子长度可变,本领域技术人员可选择包括两个具有可辨别的长度的KIF11扩增子,例如“短”和“长”KIF11扩增子,例如分别在50-140个碱基和141-280个碱基之间的扩增子。或者,本领域技术人员可选择包括两个具有可辨别的长度的KIF11扩增子,其中第一个KIF11扩增子从完全位于KIF11基因的编码区中的KIF11区域产生,第二个扩增子从位于非编码区中的KIF11区域产生。
本领域技术人员完全了解如何设计合适的引物和PCR条件以用于产生本发明的KIF11扩增子,例如具有明显不同长度的KIF11扩增子。优选地,目标是长度在50和280个碱基之间,优选60和250个碱基之间,例如62个碱基、89个碱基、98个碱基、136个碱基、204个碱基或甚至280个碱基的KIF11扩增子。在设计用于产生KIF11扩增子的适当引物时,技术人员可以考虑以下因素。优选地,在扩增子中避免具有低-ΔG值的茎环二级结构。优选地,扩增子在结构稳定的部分内。优选地,在扩增子中避免回文序列。优选地,在扩增子中避免富含G:C的区域,例如目标是大约50%的G:C含量。优选地,在扩增子中避免重复区域。优选地,预期在内含子-外显子边界上或非编码区中的靶区域。令人惊奇地发现,内含子序列,例如内含子6区以及KIF11编码序列的3'非编码序列异常稳定。在可能的实施方案中,人KIF11基因中的区域位于KIF11基因的以下外显子6、8、18、21,外显子21-内含子21边界或内含子6或非编码序列中的任一个中。表5中提供了正向和反向引物的优选子集。
在分析细胞游离DNA或细胞游离肿瘤DNA时,确保没有gDNA污染非常重要,特别是如果使用的测定不区分gDNA和cf/ctDNA序列时。为避免污染性gDNA,建议进行适当的血浆样品制备和储存。然而,这种样品制备可能不是100%有效或容易出现测定或操作错误。为了质量控制没有或只有低水平的gDNA,发现确定如本文所述的KIF11扩增子的存在对于评估gDNA(其具有良好的完整性)的不存在非常方便。此外,在分析某个靶标的表达水平或通过代理确定RNA水平时,确保没有gDNA污染非常重要,特别是如果使用的测定不区分gDNA和cDNA序列时。为了去除污染性gDNA,建议使用DNaseI对样品进行酶处理。然而,这种酶处理可能不是100%有效或容易出现测定或操作错误。为了质量控制gDNA的去除,发现确定如本文所述的KIF11扩增子的存在对于评估gDNA的不存在非常方便。
在另一方面,公开了试剂盒、部件的试剂盒、系统或其组分,包括作为单独的组分提供的:
-多个寡核苷酸子集的混合,每个所述子集对遗传靶标是特异的并且包含对所述子集独特的通用序列标签,
其中每个所述子集适应于在核酸扩增条件下和在遗传靶标的存在下产生包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物;和
-集成的流体卡盒,其包括:
(i)用于接受生物样品的入口;可能地用于接受混合物的第二个入口;
(ii)位于入口下游的核酸分离室,
可能地所述核酸分离室包含或布置成与至少用于核酸分离室的试剂(例如卡盒内的液化缓冲液)流体连接;
(iii)用于核酸扩增的试剂;
(iv)位于核酸分离室(例如核酸提取室)下游的一个或多个核酸扩增室,和
(v)多个通用报告分子,其中多个通用报告分子中的每一个包含对独特通用序列标签之一(其对寡核苷酸子集是独特的并且包含在可检测的核酸产物之一中)特异的通用序列并且适应于在包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物存在的情况下产生信号。
聚合酶延伸阻断剂是指通过向寡核苷酸(例如引物)的3'末端添加碱基使其不可延伸的寡核苷酸,该碱基与靶序列不互补,因此不碱基配对且不能被酶促延伸,和/或在延伸过程中抑制聚合酶而本身不作为引物参与。实施例部分举例说明了各种聚合酶延伸阻断剂,例如3SpC3,但可以使用本领域已知的任何聚合酶延伸阻断剂,例如3'-Spacer C3、3'-Phosphat、3'-ddC、3'-Inverted End。
在一些实例中,提供了试剂盒、部件的试剂盒、系统或其组分,其中多个通用报告分子被固定在卡盒内。
在进一步的实例中,提供了试剂盒、部件的试剂盒、系统或其组分,其中来自多个寡核苷酸子集的混合物的寡核苷酸子集至少包含引物和介体探针,并且优选地其中引物是ARMS引物。在一些实施方案中,提供了进一步的实例,其中ARMS引物包含茎环结构并且其中介体探针序列与所述茎环结构中包含的序列至少部分重叠。
在一些其他实例中,提供了试剂盒、部件的试剂盒、系统或其组分,其中多个寡核苷酸子集中的一个或多个包含对人KIF11基因中的区域特异的引物,优选地其中多个寡核苷酸中的至少两个子集包含对人KIF11基因中的不同区域特异的引物,其中所述引物被设计为产生两个长度明显不同的KIF11扩增子。在可能的实施方案中,人KIF11基因中的区域位于以下外显子6、8、18、21或外显子21-内含子21边界中的任一个中。
还公开了所公开的方法、试剂盒、部件的试剂盒、系统或其组分的检测可能在来自癌症患者的样品中的多个遗传靶标的用途,可能作为NGS分析后患者监测或微小残留病监测的一部分。
实施例
1.普遍适用的基因组参考基因座的鉴定
由于本申请的目标是提供一个通用平台,该平台能够处理用于非常通用且可能基因组不稳定的疾病和靶标的多种定制设计的测试组,我们首先尝试鉴定稳健的基因组参考基因座或基因。特别是肿瘤疾病经常受到基因组重排的影响,并且在我们广泛的肿瘤学实践中,我们已经测试了许多不同的管家基因座,并相信对于每个测定,参考基因或一组参考基因最好根据肿瘤类型的来进行选择。然而,鉴于本文所需应用的一般性质,我们已着手筛选在广泛的癌症类型中受不同遗传变异(包括点突变和拷贝数变化)影响最小的基因座。我们广泛的文献和对我们和其他人数据的计算机分析使我们能够对100个潜在的肿瘤学“稳定”基因进行排名。这些排名靠前的潜在参考基因座在通过公共门户网站https://www.cbioportal.org查询的癌症基因组图谱(TCGA)数据库中进一步分析了体细胞变异。
该分析允许进一步将选择范围缩小到较少数量的靶标,因此我们已经鉴定并广泛验证KIF11似乎是一个非常有前途的基因组参考基因,在我们迄今为止测试或筛选的肿瘤样品中很少受到体细胞突变或拷贝数改变的影响。KIF11作为泛癌“稳定”参考对照的适用性也可以在我们分析时包含在TCGA中的228项研究的多种肿瘤中得到证实,只有2-7%的前列腺癌(TCGA报告了扩增或缺失,具体取决于研究)和9%的神经鞘瘤(扩增)略有例外。后一种分析似乎证实了以前未报告的基因组参考基因KIF11用作非常广泛的基因组不稳定样品(如肿瘤样品)的一般稳定对照基因座的令人惊讶的适用性。我们的发现更加令人惊讶,因为KIF11表达增加已在许多不同的癌症类型中得到广泛报道,甚至有人提出它是不同癌症类型中的致癌基因或潜在肿瘤标志物(Daigo等人,2018Int J Oncol 52:155–165;Pei等人,2017Oncol Lett6618-6626https://doi.org/10.3892/ol.2017.7053;Imai等人,2016Pathobiology 84:16–24)。尽管报道了转录过表达,但基于我们的调查和TCGA获得的数据,KIF11基因组基因座看起来异常稳定,只有在设计用于前列腺癌或神经鞘瘤的测定时,才会建议进行额外的研究以降低KIF11作为选择的对照区域的基因组稳定性的风险。
为了进一步证实我们的发现,我们在广泛的样品和在线数据库中广泛测试了选定的KIF11区域的稳定性。特别是,对于常见的遗传变异(SNP),我们特别关注内含子6、外显子6、21、后者周围的内含子-外显子边界,以及能够容纳长扩增子(分别243bp和280bp)的两个最长的外显子8和18。
总之,就可获得公共数据的几乎所有癌症类型的拷贝数改变和体细胞突变而言,以及就研究的外显子和外显子21-内含子21边界的SNP而言,KIF11似乎具有高度基因组稳定性。因此,KIF11似乎是一种非常有前途的通用对照,很可能在全球任何人群中提供一致的性能。
2.使用通用报告分子选择多重扩增化学
为了选择包含通用报告分子的原理验证核酸扩增策略,评估了几种方法。实例包括但不限于,Biocartis NV的WO2020/165180中描述的各向异性环状发夹引物,例如在EP2753717、EP2817421和EP1948822中描述的SpeeDx Ltd的PASS引物和MNAzyme技术的可能组合,或如Albert Ludwig University of Freiburg的EP2776585中所述介体探针化学,如图2中示意性显示的。
考虑到执行高靶标数多重检测(可能包含数十个或更多靶特异性引物对和可能地探针)的期望目标,我们开发了基于ARMS引物和介体探针化学的组合的测定。迄今为止,介体探针化学仅与标准引物(即不是突变或变体选择性的并且扩增核酸区域而不管其中是否存在感兴趣的突变/SNP的引物)结合使用。因此,迄今为止,在对变体特异性检测感兴趣时,介体探针将被设计为与感兴趣的突变或SNP部分重叠。然而,我们发现所述方法需要对介体探针进行广泛优化,以确保其稳健的等位基因选择性。特别是,这通常不允许达到用于SNP检测的1%或更低的灵敏度,使其不适用于敏感突变检测测定。因此,我们以ARMS引物用于突变靶分子的选择性扩增,并且介体探针不与感兴趣的突变重叠的方式修改了基于介体探针化学的测定。ARMS引物可以包含例如摆动和/或环,我们假设其可以允许在复杂的多重设置中微调针对更具挑战性的靶标的灵敏度/特异性结果。
显示本文提出的方法具有很强的辨别力的结果如图3所示,说明了结合使用ARMS引物和介体探针用于EGFR基因中的SNP和插入缺失的高灵敏度检测的3重测定的性能。结果表明,在10.000个拷贝的基因组野生型背景中,合成突变靶标的滴定系列被稳健地扩增并清晰地检测到。对于3重测定的一些靶标,3重测定能够检测到低至10个突变靶拷贝,与空白极限(LOB,图中用实心方块表示)有足够的区别。
3.原型通用卡盒的配置
通用卡盒原型是基于Biocartis NV专有的流体样品处理卡盒制备的,并与其自动化分子测试系统IdyllaTM兼容。标准卡盒被制造成一个单一的一次性实体,其包含样品入口和多个用于试剂和废物的内部隔室,这些隔室与流体路径连通以用于根据选择的策略进行样品处理和核酸分离。流体路径终止于五个独立的核酸PCR扩增室,其预载有扩增试剂并且被配置成接受在流体路径的上游部分中分离的一部分核酸。扩增室配有透明壁,其使得能够检测在核酸扩增(例如用表明存在感兴趣的遗传靶标的发光染料进行的PCR)过程中产生的信号。一旦将样品提供到卡盒中并将卡盒送入IdyllaTM系统,整个样品到结果的处理程序将在系统内部以全自动方式编排,包括生物样品破碎、通过例如液化或固相萃取进行核酸分离,然后是靶核酸扩增和信号检测。
为了创建第一个原理验证通用卡盒原型,如上所述的IdyllaTM卡盒装载有试剂和针对固定的固体组织样品(例如FFPE样品)的液化优化的缓冲液,如Biocartis NV的EP2958997中所述的。接下来,根据制造商的方案,在卡盒的5个扩增室的每一个中,对5种不同标记的独特通用报告分子的斑点溶液以及PCR试剂(包括dNTP、Taq聚合酶等)进行点样和干燥。PCR所需的Mg2+和缓冲剂整合在用于液化的缓冲液中。
与通用卡盒原型分开地,61个靶特异性寡核苷酸子集的混合物如下设计。混合物中61个子集的每个靶特异性寡核苷酸子集包含一种正向引物、一种反向引物和一种介体探针。除了特异于作为阳性对照靶标的KIF11的子集外,正向引物通常被设计为等位基因选择性ARMS引物,即特异性结合一种感兴趣的等位基因的61种引物。在这个实例中,一个特定的等位基因被视为靶标,即使它可能涉及与混合物中另一个子集所靶向的另一个等位基因相同的基因。因此,可能的是不同的靶标-等位基因特异性子集可能共有具有相同序列的寡核苷酸,如本实施例中所示。也就是说,每个子集中的反向引物和介体探针大多是非等位基因选择性的,而是被设计为与接近感兴趣的等位基因的基因中的区域结合。在这个实验中,61个靶特异性寡核苷酸子集的混合物包含具有不同序列的61种正向引物(定义包含不同基因和同一基因的不同等位基因的61个遗传靶标)、9种不同的反向引物和9种不同的介体探针。这是因为几个反向引物和介体探针被设计成构成特异于同一基因中不同等位基因靶标的子集的一部分,不同的等位基因被ARMS正向引物的特异性所区分。下表1的第3-5列中给出了卡盒布局,并指示了其中可以检测到9个特定靶标的位置。寡核苷酸的序列显示在表2中。混合物中的浓度可根据要求从Biocartis NV获得,但可由本领域技术人员确定。
表1
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表2:
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与通用卡盒原型的扩增室中点样的恰好一个通用报告探针互补(即与通用报告分子的独特通用序列标签结合位点互补)的每个介体序列(或“游离介体”包含独特通用序列标签或由独特通用序列标签组成)共价偶联到靶特异性序列以一起形成9个介体探针之一。介体序列可以例如设计为长度为10-30个核苷酸的零聚物(nullomer)(即不存在于人类基因组中的乱序序列),但也可以考虑非零聚物。介体序列的长度可以变化,但如果预测它们通过与其相应的通用报告分子相互作用而给出特定信号并且不与其他通用报告分子发生交叉反应,则该长度被认为在可接受的范围内。在Wadle等人(2015,BiomolecularDetection and Quantification 7:1-8,Real-time PCR probe optimization usingdesign of experiments approach)中可以找到此类介体序列的实例。如本文所使用的作为介体序列的序列也可以根据要求从Biocartis获得。
为了验证具有介体化学的61-plex是否适合在通用卡盒原型中生成靶特异性信号,将以下组分通过其样品入口一起添加到每个原型卡盒的裂解室中:
(i)27ul的包含引物对和介体探针的61个靶特异性寡核苷酸子集的混合物;
(ii)从FFPE切片、基因组DNA提取物或对应于无样品对照的milliQ水中选择的模拟样品材料;
(iii)包含感兴趣的突变的合成靶标(每个PCR室10-50-100个拷贝)或没有合成靶标(阴性对照)。
然后将通用原型卡盒插入IdyllaTM仪器并启动全自动化测试。在这些测试期间,IdyllaTM平台将样品制备缓冲液泵入裂解室,并对裂解室的内容物进行加热和高频超声(HiFU)处理,以获得均匀的液化物。在下一步中,液化物通过缓慢泵送通过加热区域而被热灭活,然后将包含核酸靶标和靶特异性寡核苷酸子集的混合物的一部分热灭活液化物转移到5个平行扩增室中的每一个。此时,开始适用于61-plex与寡核苷酸混合物的PCR循环方案,如果给定的液化部分中存在适当的靶基因或等位基因,则其在本文呈现的设置中会导致产生游离介体。游离介体与其各自的在扩增室中点样的互补的通用报告探针杂交。杂交事件导致产生在退火/延伸步骤中测量的荧光信号,然后进行标准后处理以针对偏移和漂移校正数据,并确定可以检测到扩增的第一个循环。使用具有2个简单参数的决策树来移除荧光信号太低(比较平台处的信号相对基线处的信号的比率应>0.1)或Cq不在预期范围(比较15<Cq<36)的曲线。
为测试灵敏度,使用合成靶标HER2 ex20ins在每个PCR室0-10-50-100个拷贝的滴定系列(当用于每个PCR室含有7000个基因组拷贝的样品中时对应于0.0-0.1-0.7-1.4%的突变体拷贝)处执行上述程序。将合成的靶标与每个PCR室包含7000个基因组拷贝或每个PCR室包含1000个基因组DNA拷贝的高背景临床样品(两者都预先确认对感兴趣的突变呈阴性)混合。示例性获得的扩增曲线如图4和图5所示。
表3提供了上述实施例中使用的扩增引物、介体探针和通用报告分子的序列。
表3
SEQ ID NO | 寡核苷酸名称 | 5>3序列 |
40 | 5HER2_T2_9 | GGAAGCATACGTGATGGCATAC |
51 | 3HER2_T1_7 | GCTGCACCGTGGATGTCA |
60 | 5HER2_MP1_MHS14_M3 | CGGAGGACTGTCGCGTATATGCCCAGAAGGCGGGAGACATA/3Phos/ |
首先,数据出乎意料地表明,使用本文提供的方法,可以检测低至10个拷贝/PCR的标志物,如图4中的HER2 ex20ins所示。考虑到多重检测复杂性,该方法因此出人意料地灵敏。此外,由于在测试的50多个原型卡盒中未检测到假阳性,因此可以得出结论,本方法也符合严格的特异性标准。
此外,数据表明,有可能在特定腔室中检测到一种特定标志物,即使该标志物在所有扩增室中在具有与生物样品一起提供的引物对和介体探针的平行的、相同的多重反应中被扩增。例如,EGFR G719A在腔室A的通道2中检测到,但在其他腔室中未检测到;EGFRS768I在腔室B的通道2中检测到,但在其他腔室中未检测到。类似地,EGFR L858R在腔室C的通道1中检测到,但在其他腔室中未检测到;KRAS G12C在腔室D的通道1中检测到,但在其他腔室中未检测到。数据进一步表明,可以区分同一腔室内的两个突变体。即,C797S在腔室B的通道4中检测到,而在腔室B的其他通道中未检测到;EGFR S768I在腔室B的通道2中检测到,而在腔室B的其他通道中未检测到。最后,数据还重要地表明,可以使用不同的通用报告分子在单个扩增室中同时检测多个标志物。为了说明这一点,本文讨论的每个靶标总是与阳性对照基因组参考基因(其在所有扩增室中用作样品处理对照)组合检测。
4.用于多重扩增的改进的引物-探针系统的开发
在一些情况下,区分相邻突变可能很有价值,因为它们可能导致不同的临床作用。这方面的一个实例包括如果需要使用突变测定来检测可能对特定KRAS G12C靶向治疗有反应的KRAS突变肿瘤,需要将KRAS G12C与其他KRAS G12或G13突变区分开来。传统上,在具有多个腔室的样品到结果平台中,这是通过在不同的腔室中点样与用于其他KRAS G12或G13突变的ARMS引物不同的用于KRAS G12C扩增的ARMS引物来安排的。然而,当在所有靶特异性寡核苷酸通过样品入口添加在一起的情况下工作时,不可能保持特定ARMS引物之间的空间分离。因此,我们进一步修饰了ARMS引物以包含茎环结构,其中茎可以任选地由靶序列组成。我们进一步修饰介体探针,使其与修饰后的ARMS引物至少部分重叠,而在标准介体探针设计中,探针始终位于用于扩增的引物的下游。图6显示了介体探针的结合位点完全落在ARMS引物内的情况的概念,但可以设想介体探针的结合位点的一部分落在ARMS引物之外。ARMS引物的茎的3'组分可以具有源自靶序列的序列,或者可以是另一个序列。当靶标未被扩增时,介体探针无法与靶序列结合,因此无法产生信号。介体探针也不能与其在ARMS引物内的互补序列结合,该序列位于茎环配置内部,因此介体探针无法接近。当靶标被扩增时,聚合酶可以展开茎结构,从而为介体探针创建结合位点。一旦结合,游离的介体随着另一个引物的延伸而释放,游离介体可以与点样的通用报告分子结合并产生信号。
本领域技术人员将理解,2个或更多个介体探针的使用显著增加了检测潜力。例如,在2个介体探针的情况下,可以彼此区分4个不同的条件,例如
结果显示在图7中,表明该概念的稳健性以及无处不在的实用性,即该概念不限于本发明的通用卡盒,而是可广泛用于多重扩增反应。
5.FuseTag的开发
在实施例4中描述的引物-探针系统的进一步开发中,发明人着手简化系统以进一步提高稳健性,同时降低成本。这是通过将茎环引物和介体探针2组合成一个“FuseTag”引物,从而与实施例4的改进的引物-探针系统相比减少了组分的数量来实现的。此外,FuseTag引物不包含修饰,例如昂贵的聚合酶延伸阻断剂(由图中的方框指示),其能够实现快速合成和迭代。当使用FLEX通用检测卡盒进行工作时,FuseTag允许区分相邻标志物。
图6C显示了能够区分相邻标志物的“FuseTag”概念。修饰后的正向ARMS引物(“FuseTag”引物)现在从5'到3'包括:第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”),当释放时,它在图6C中被指示为游离介体2;茎环结构;和第二部分,其中第二部分与靶标互补(并且优选地是等位基因特异性的)。当未通过FuseTag引物扩增特定靶标时,不会释放独特的通用序列标签(介体2),因此无法产生信号。然而,介体探针1仍可被多重反应混合物中存在的另一种正向引物水解。
聚合酶对FuseTag引物的延伸导致介体探针1的靶特异性组分的水解和游离介体1的释放。在随后的PCR循环中,聚合酶对反向(RE)引物的延伸导致FuseTag引物的双链部分的水解,导致独特通用序列标签(游离介体2)的释放。
游离介体1和游离介体2都可以结合到它们对应的通用报告分子。注意,荧光团和猝灭剂可以互换(图6C中未显示)。在游离介体的延伸后,通过猝灭剂或荧光团修饰的置换和/或猝灭剂或荧光团连接的核苷酸的水解产生荧光信号(未显示)。注意,未水解的介体探针和通用报告分子不能通过聚合酶进行延伸(如方块示意性指示的)。
该概念首先在单重设置中进行了测试。图10显示了用于四个不同的靶标的在96孔格式qPCR仪器中在单重PCR(即仅包含扩增1个靶标所需的引物)中使用FuseTag引物进行突变检测的性能。在PCR反应(其始终包含2,000个基因组野生型DNA拷贝,以及通用报告分子,和聚合酶、dNTP和PCR盐(包括MgCl2))中添加200个拷贝的靶标作为合成突变靶标。测试了具有不同靶标的四种不同组合,即BRAF V600E、EGFR E709K、EGFR S768I和EGFR L861Q。各种FuseTag引物的序列如表4所示。
表4
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(这些FuseTag实验中没有使用探针)
gDNA背景中200个拷贝的扩增结果在图10中用黑线表示。对照反应用灰色线表示,其中存在基因组野生型DNA,但未添加合成突变靶标。结果证明了对阴性对照的靶特异性。
用KRAS G12C、EGFR C797S的两个突变变体、EGFR T790M的两个突变变体和EGFR G719S重复该实验,它们都给出基本相同的结果,即相对于阴性对照的靶特异性(数据未显示)。
总之,结果证明了“FuseTag”概念作为可独立用于靶标的通用标签的普遍可行性。
为了进一步证明“FuseTag”概念的普遍实用性,检查了多重PCR中突变检测的性能。特别地,在96孔格式qPCR仪器中测试了包含含有扩增多个靶标所需的引物的寡核苷酸池以及介体探针的混合物。将靶标作为各种浓度的合成突变靶标与包含引物和介体探针的混合物以及103个拷贝的基因组野生型DNA一起添加。将通用报告分子、聚合酶、dNTP和PCR盐(包括MgCl2)与含有从FFPE样品释放DNA所需组分的液化缓冲液一起添加到每个反应中。“FuseTag”引物FEB_FMG_BRAF_T2_F041如表4所示(其他组分未显示)
gDNA背景中500(三角形)、100(实心圆)和20(菱形)个拷贝的扩增结果如图11所示。对照反应由实心方块表示,其中存在基因组野生型DNA,但未添加合成的突变靶标(0个拷贝)。结果证明了在多重检测背景中相对于阴性对照的靶特异性。
总之,结果证明了“FuseTag”概念在广泛应用中的有效性和特异性。
6.用于DNA片段化评估的使用KIF11的质量控制(QC)扩增的开发
对于某些特定的应用,例如核酸片段化的确定或来自血浆的短的细胞游离游离DNA被来自白细胞的基因组DNA的污染的评估,我们最初设想了基于三种不同管家基因(包括ABCB、RNaseP和TFRC)的质量控制三链体。然而,观察到这些和其他测试的基因没有表现出令人满意的稳定性水平,并且在将KIF11鉴定为一个令人惊讶的无突变和稳定的基因组区域后,我们重新开发了基于KIF11的不同外显子的初始三链体片段化测定。假设切换到单个稳定区域有利于避免拷贝数变异,如果使用几个不同的参考基因,可能会发生这种情况。因此,KIF11的不同外显子被用于开发分别用于三个长度明显不同的扩增子(分别为62bp、98bp和136bp)的扩增和检测的引物和探针。循环的条件可由本领域技术人员容易地确定,尽管如此,IdyllaTM卡盒内部的循环条件可应要求从Biocartis获得。QC三链体在具有不同DNA片段化程度的样品上进行了测试,包括来源于FFPE样品的DNA、来自血液的核小体DNA、完整的基因组DNA等。如图8所示,基于KIF11的QC三链体给出了片段化的程度以及因此特定样品中存在的DNA的质量的可靠指示。
表5提供了上述实施例中使用的扩增引物、介体探针和通用报告分子的序列。
表5
/>
SEQ:*-SEQ ID NO:
7.在基于介体化学的qPCR中使用KIF11的DNA片段化的确定
下一步是基于KIF11的DNA片段化控制qPCR扩增的开发,及其使用适用于上述原型通用卡盒的介体化学读出的检测。为此,设计了靶向KIF11的不同外显子的短的(82bp)和长的(204bp)PCR扩增子以及对应于其的两个介体探针。每个介体探针都被设计为靶向其特定的通用报告分子,这些报告分子分别与基于通道5和通道1的不同发光染料缀合。两个报告分子都在每个原型卡盒的相同扩增室中提供,使得与两个扩增子和介体相关的qPCR信号可以在相同的反应中检测到。长扩增子和短扩增子qPCR曲线之间的Cq差异(ΔCq)的确定被用作DNA片段化的量度。“KIF11 DNA片段化双链体”的性能是在一组临床FFPE样品上确定的,其中的DNA片段化水平先前是使用基于正交ddPCR的方法确定的。作为阳性对照,该测定还对源自白细胞(Promega)的高质量基因组DNA(gDNA)(其预计其是未片段化的)进行了测试。结果如图9所示,其中带圆圈的线代表短扩增子,规则线代表长扩增子。使用阈值(水平线)确定Cq值。结果清楚地表明,由介体化学检测到的长和短KIF11扩增子之间的ΔCq值与评估的FFPE样品中的DNA片段化程度密切相关,并且本文开发的片段化双链体很容易用于本文提出的概念的通用卡盒。这种双链体非常适合不仅为个性化寡核苷酸测试组提供阳性扩增对照,而且由于其检测片段化样品的能力,它还可以提供最终结果在样品质量方面的可靠性的指示。然后,由于FFPE样品中的广泛片段化与脱氨伪影相关,由于两者都是由福尔马林固定引起的,因此本发明的KIF11双链体测定法也可能适用于脱氨伪影的预测。最后,对于从血浆的基于cfDNA的测定,例如靶向循环胎儿、肿瘤或器官供体DNA靶标检测组的测定,此处呈现的片段化测定可能也适用于提供有关例如血浆样品中来自白细胞的基因组DNA的污染的信息。
总之,我们在此提供了一种用于快速通道和极其通用的诊断测定和产品开发的非常不寻常的方法的工作原理验证演示。我们相信,本文提出的概念具有巨大的潜力以为快速、定制和个性化的分子测试策略开辟一个全新的场所,因为它消除了对定制卡盒的设计、制造和QC释放的需要。特别地,本文公开的方法、试剂盒、部件的试剂盒和用途可以显著降低开发成本和为患者带来新测定的时间。尤其是现在,极其需要这种开发加速,正如2020年突然爆发的全球大流行病所表明的那样,其中全球范围内基本医疗和诊断产品的生产停滞和延迟,延误了治疗决策和许多有需要的人获得适当医疗服务的机会。
序列表
<110> 拜奥卡蒂斯生物股份有限公司
<120> 用于多重核酸检测的通用卡盒和方法
<130> A-2001-WO_NLO-P6106765PCT
<150> EP20204806
<151> 2020-10-29
<150> EP20214901
<151> 2020-12-17
<160> 88
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 1
aaaagatcaa agtgctggc 19
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<213> 合成DNA
<400> 2
gaattcaaaa agatcaaagt gcaga 25
<210> 3
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<400> 3
aattcaaaaa gatcaaagtg cggt 24
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<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 13
cgtcgctatc aaggaatctc 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 14
tcgctatcaa ggaaccaac 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 15
cgtcgctatc aaggttccg 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 16
ccgtcgctat caaggcatc 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 17
gtcgctatca aggaaccgaa 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 18
cgtcgctatc aaggaaccat c 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 19
cgtcgctatc aaggaagca 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 20
cgtcgctatc aaggagccaa c 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 21
cgtcgctatc aaggaatcat c 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 22
tcccgtcgct atcaaaatat ct 22
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 23
tcccgtcgct atcaagtct 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 24
gtcgctatca aggaacagaa 20
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 25
ccgtcgctat caaggctcc 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 26
cgtcgctatc aaggatccg 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 27
gtcgctatca aggagcaat 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 28
gaagcctacg tgatgggcat 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 29
ctccaggaag ccttccagga 20
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 30
ctcatgccct tcggctc 17
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 31
gctcatgccc ttcggca 17
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 32
gtcaagatca cagattttgg tcg 23
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 33
gtcaagatca cagattttgg gcgt 24
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 34
gattttgggc tggccaaaca 20
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 35
taggtgattt tggtctagct tcaa 24
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 36
ggtgattttg gtctagctag aga 23
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 37
aacttgtggt agttggagct t 21
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 38
aacttgtggt agttggaggt gt 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 39
aacttgtggt agttggaggt ga 22
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 40
ggaagcatac gtgatggcat ac 22
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 41
ggaagcatac gtgatggctt ac 22
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 42
ggctggtgtg ggctccccgg 20
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 43
gaacctctaa gtcaagagcc atctgt 26
<210> 44
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 44
gcctgtgcca gggacct 17
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 45
ccccacacag caaagcagaa 20
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 46
gtggaggtga ggcagatgc 19
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 47
cacacaccag ttgagcaggt act 23
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 48
cttactttgc ctccttctgc 20
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 49
cacaaaatgg atccagacaa ctg 23
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 50
catattcgtc cacaaaatga ttctg 25
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 51
gctgcaccgt ggatgtca 18
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 52
gacatacctg gaaaaatgga acc 23
<210> 53
<211> 44
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 53
ccgatctacg tcgagcgcgt tcggcacggt gtataaggta aggt 44
<210> 54
<211> 45
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 54
gcgagtctta cgctcggaca aggaaatcct cgatgtgagt ttctg 45
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 55
gtagatgcat agcctaccgg acaaccccca cgtgtgccg 39
<210> 56
<211> 46
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 56
tggggagtta ctgtaccgat ggactatgtc cgggaacaca aagaca 46
<210> 57
<211> 46
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 57
gcaacatcag atatcgcgtg cggaagagaa agaataccat gcagaa 46
<210> 58
<211> 45
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 58
cgagctaact acggtacgtc tcgatggagt gggtcccatc agttt 45
<210> 59
<211> 43
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 59
gtgtcactcg attacgcgca agagtgcctt gacgatacag cta 43
<210> 60
<211> 41
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 60
cggaggactg tcgcgtatat gcccagaagg cgggagacat a 41
<210> 61
<211> 44
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 61
gtactgagtc gccgaatctg gtgtggattg ttcatcaatt ggcg 44
<210> 62
<211> 80
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 62
actagtcatc gcgtaatcgc cggggcccct tttttggggc cccggccagt aaaaataggt 60
gattttggtc tagctagaga 80
<210> 63
<211> 70
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 63
cgtgtctgaa gcgcgcgagg ggcccctttt ttggggcccc tcgaccaagc tctcttgagg 60
atcttgatga 70
<210> 64
<211> 67
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 64
gctatctgta cgcgattcga cggggcccct tttggggccc cgtccaggaa gcctacgtga 60
tggcgat 67
<210> 65
<211> 64
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 65
tcgttctggg ctctacgacg gggccccttt tggggccccg tccagatttt gggctggcca 60
atca 64
<210> 66
<211> 72
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 66
actagtcatc gcgtaatcgc cggggcccct tttttggggc cccggcatag gtgattttgg 60
tctagctaca ga 72
<210> 67
<211> 39
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 67
gtgtcactcg attacgcgct ccaactaccg acgtatcgg 39
<210> 68
<211> 52
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 68
gctgaaaatg actgaatata aacttacccc gatacgtcgg tagttggagc tt 52
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 69
cgggaagtca gacgggtca 19
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 70
gagaggtacc ggcaggagca 20
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 71
ggaagcccag gataaaatgt ggct 24
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 72
aagtgcctca gggacccctt ca 22
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 73
gccatagtct cttccctagc cccat 25
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 74
gccaattacc aatgacccct cctt 24
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 75
gaacctctaa gtcaagagcc atctgt 26
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 76
gacatacctg gaaaaatgga acc 23
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 77
gccgttctgg agctgttgat a 21
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 78
gagagatgca ggagaaattg ttgc 24
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 79
tctaagtcaa gagccatctg ta 22
<210> 80
<211> 26
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 80
gatatgacat acctggaaaa atggaa 26
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 81
ccccagaccc cggctgcagc gc 22
<210> 82
<211> 32
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 82
ctaaggaggt aagcctcaga gcgtcccatt cc 32
<210> 83
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 83
cgtgacccac ataccctgac ccacccc 27
<210> 84
<211> 45
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 84
actgagtcgc cgaatcgctg gtgtggattg ttcatcaatt ggcgg 45
<210> 85
<211> 48
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 85
ctcgtctgct tgtacactga ctcgggaagc tggaaatata aatcaatc 48
<210> 86
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 86
accccgccaa ttgatgaaca atcca 25
<210> 87
<211> 51
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 87
cagccggcca agacgcgccg gcttggcgat tcggcgactc agtactatca g 51
<210> 88
<211> 50
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 88
cagccggcca agacgcgccg gcttgggatc agtgtacaag cagacgagaa 50
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于检测多个遗传靶标的方法,所述方法包括:
-提供多个寡核苷酸子集的混合物,每个所述子集对遗传靶标是特异的并且包含对所述子集独特的通用序列标签(独特通用序列标签),
其中每个所述子集适应于在核酸扩增条件下和在遗传靶标的存在下产生包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物;
-与所述混合物分开地,提供包含以下的卡盒:
(i)用于接受生物样品和/或混合物的入口,
(ii)位于入口下游的核酸分离室,
(iii)用于核酸扩增的试剂;
(iv)位于核酸分离室下游的一个或多个核酸扩增室,和
(v)多个通用报告分子,其中多个通用报告分子中的每一个包含对包含在可检测的核酸产物之一中的独特通用序列标签(“UGST”)特异的通用序列,并且适应于在所述可检测的核酸产物的存在下产生信号;
其中生物样品和混合物由用户插入卡盒中,所述方法还包括:
-在插入生物样品和混合物之后操作卡盒,其中操作包括从生物样品进行核酸分离,然后进行包含混合物的多重核酸扩增;
-如果从所述扩增产生至少一种可检测的核酸产物,则检测从包含在卡盒内部的多个通用报告分子中的至少一个产生的信号。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述多个寡核苷酸子集中的至少一个对在对来自从中获得生物样品的个体的样品进行的下一代测序(NGS)分析中鉴定的遗传靶标是特异的。
3.根据上述权利要求中任一项所述的方法,其中从生物样品分离的核酸和多个寡核苷酸子集的混合物被移动到集成的流体卡盒内部,进入至少两个或更多个不同的扩增室。
4.根据权利要求3所述的方法,其中在不同的扩增室中提供不同的通用报告分子。
5.根据上述权利要求中任一项所述的方法,其中多个寡核苷酸子集中的一个或多个包含至少一种引物和至少一种介体探针,所述介体探针从5'到3'包含:
i)第一部分,其中第一部分包含UGST,其中UGST的序列与通用报告分子的UGST结合位点互补;
ii)第二部分,其中第二部分与待扩增的遗传靶标的第一链互补;
其中可检测的核酸产物是包含所述独特通用序列标签的切割的第一部分。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述至少一种引物是ARMS引物。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述ARMS引物包含茎环结构,并且优选地其中介体探针序列与所述茎环结构中包含的序列或其互补物至少部分重叠。
8.根据上述权利要求中任一项所述的方法,其中在存在多个寡核苷酸子集的混合物的情况下进行从生物样品中分离核酸。
9.根据上述权利要求中任一项所述的方法,其中至少一部分寡核苷酸子集是通过包括机器学习的计算机实施方法设计的。
10.根据上述权利要求中任一项所述的方法,其中多个寡核苷酸子集中的一个包含对人KIF11基因中的区域特异的引物,其中用所述引物产生的KIF11扩增子用作基因组参考基因。
11.一种试剂盒,其包括作为单独的组分提供的:
-多个寡核苷酸子集的混合物,每个所述子集对遗传靶标是特异的并且包含对所述子集独特的独特通用序列标签,其被定义为不存在于从其检测遗传靶标的生物体的遗传信息中的序列,
其中每个所述子集适应于在核酸扩增条件下和在遗传靶标的存在下产生包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物;和
-集成的流体卡盒,其包含
(i)用于接受生物样品和/或混合物的入口;
(ii)位于入口下游的核酸分离室;
(iii)用于核酸扩增的试剂;
(iv)位于核酸分离室下游的一个或多个核酸扩增室,和
(v)多个通用报告分子,其中多个通用报告分子中的每一个包含对独特通用序列标签之一特异的通用序列,并且适应于在包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物的存在下产生信号。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,其中来自多个寡核苷酸子集的混合物的寡核苷酸子集至少包含引物和介体探针,并且优选地,其中所述引物是ARMS引物。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述ARMS引物包含茎环结构并且其中介体探针序列与所述茎环结构中包含的序列至少部分重叠。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的试剂盒,其中所述多个寡核苷酸子集中的一个或多个包含对人KIF11基因中的区域特异的引物,优选地其中所述多个寡核苷酸子集中的至少两个包含对人KIF11基因中的不同区域特异的引物,其中所述引物被设计成产生两个长度明显不同的KIF11扩增子。
15.权利要求1-10的方法或权利要求11-14的试剂盒用于优选在从癌症患者获得的样品中,更优选作为NGS分析后患者监测的一部分或在最小残留疾病监测中检测多个遗传靶标的用途。
16.一种系统或系统的一部分,所述系统包括作为单独的组分的:
可与自动化系统接合的卡盒,所述卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室;
其中入口与核酸分离室流体连接,并且其中核酸分离室与核酸扩增室流体连接;
其中核酸扩增室包含通用报告分子,其中通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其被配置用于靶核酸的扩增;任选地,靶特异性引物对中的至少一个成员是等位基因特异性的;
b)介体探针,其中介体探针从5'到3'包含:
i)第一部分,其中第一部分包含UGST,其中UGST的序列与通用报告分子的UGST结合位点互补;
ii)第二部分,其中第二部分与待扩增的靶核酸序列的第一链互补;
iii)任选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
17.一种系统或系统的一部分,所述系统包括作为单独的组分的:
可与自动化系统接合的卡盒,所述卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室;
其中入口与核酸分离室流体连接,并且其中核酸分离室与核酸扩增室流体连接;
其中核酸扩增室包含通用报告分子,其中通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其中靶特异性引物对的至少一个成员在与靶标结合时包含茎环结构,任选地,靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的,和;
b)介体探针,其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)第二部分,其中第二部分与引物的茎环结构或其互补物互补;
iii)任选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
18.一种系统或系统的一部分,所述系统包括作为单独的组分的:
被配置成接受卡盒的仪器,
所述卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室;
其中入口与核酸分离室流体连接,并且其中核酸分离室与核酸扩增室流体连接;
其中核酸扩增室包含通用报告分子,
其中通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其被配置用于靶核酸的扩增;任选地,靶特异性引物对中的至少一个成员是等位基因特异性的;
b)介体探针,其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含UGST,其中UGST的序列与通用报告分子的UGST结合位点互补;
ii)第二部分,其中第二部分与待扩增的靶核酸序列的第一链互补;
iii)任选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的系统,其中所述卡盒的核酸扩增室包含用于核酸扩增的试剂(PCR混合物)。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的系统,其中所述卡盒在核酸扩增室中包含多个通用报告分子,其中多个通用报告分子的每个UGST结合位点是不同的。
21.根据权利要求20所述的系统,其中所述多个通用报告分子中的每一个包含不同的标签。
22.根据权利要求16-21中任一项所述的系统,其中所述寡核苷酸混合物包含:
多个靶特异性扩增引物对,其中每个引物对对不同靶标具有特异性;和
多个介体探针,其中
i)每个介体探针的第一部分包含与多个通用报告分子中的一个通用报告分子的UGST结合位点互补的UGST;
ii)每个介体探针的第二部分与待扩增的多个靶核酸序列的不同靶核酸的第一链互补,
iii)任选地,每个介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
23.一种系统,其包括:
被配置成接受卡盒的仪器,所述卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室,
其中入口与核酸分离室流体连接,并且
其中核酸分离室与核酸扩增室流体连接;
其中核酸扩增室包含通用报告分子,其中通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其中靶特异性引物对的至少一个成员在与靶标结合时包含茎环结构,任选地,靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的,和
b)介体探针,其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)第二部分,其中第二部分与引物的茎环结构或其互补物互补;和
iii)任选地,聚合酶延伸阻断剂。
24.根据权利要求23所述的系统,其中所述卡盒的核酸扩增室包含用于核酸扩增的试剂(PCR混合物)。
25.根据权利要求23或24所述的系统,其中所述卡盒在核酸扩增室中包含多个通用报告分子,其中所述多个通用报告分子的每个UGST结合位点是不同的。
26.根据权利要求25所述的系统,其中所述多个通用报告分子中的每一个包含不同的标签。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的系统,其中所述寡核苷酸混合物包含:
多个靶特异性扩增引物对,其中每个引物对对不同靶标具有特异性;和
多个介体探针,其中
i)每个介体探针的第一部分包含与多个通用报告分子中的一个通用报告分子的UGST结合位点互补的UGST;
ii)每个介体探针的第二部分与待扩增的多个靶核酸序列的不同靶核酸的第一链互补;和
iii)任选地,每个介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
28.根据前述权利要求16-27中任一项所述的系统,其中所述等位基因特异性引物包括ARMS引物。
29.根据权利要求1-10中任一项所述的方法、根据权利要求16-28中任一项所述的系统、或根据权利要求11-14中任一项所述的试剂盒,其包含来自选自以下的引物对的至少一种引物:
(1)EGFR引物对,其中
EGFR正向引物选自SEQ ID NO:1-34,并且
EGFR反向引物选自SEQ ID NO:44-48;
优选地,EGFR扩增子由SEQ ID NO:53-57中的任一个检测;
(2)BRAF引物对,其中
BRAF正向引物选自SEQ ID NO:35和36,并且
BRAF反向引物是SEQ ID NO:49;
优选地,BRAF扩增子通过SEQ ID NO:58检测;
(3)KRAS引物对,其中
KRAS正向引物选自SEQ ID NO:37-39和67-68,并且
KRAS反向引物是SEQ ID NO:50;
优选地,KRAS扩增子由SEQ ID NO:59检测;
(4)HER2引物对,其中
HER2正向引物选自SEQ ID NO:40-42,并且
HER2反向引物是SEQ ID NO:51;
优选地,HER2扩增子通过SEQ ID NO:60检测。
Claims (47)
1.一种用于检测多个遗传靶标的方法,所述方法包括:
-提供多个寡核苷酸子集的混合物,每个所述子集对遗传靶标是特异的并且包含对所述子集独特的通用序列标签(独特通用序列标签),
其中每个所述子集适应于在核酸扩增条件下和在遗传靶标的存在下产生包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物;
-与所述混合物分开地,提供包含以下的卡盒:
(i)用于接受生物样品和/或混合物的入口,
(ii)位于入口下游的核酸分离室,
(iii)用于核酸扩增的试剂;
(iv)位于核酸分离室下游的一个或多个核酸扩增室,和
(v)多个通用报告分子,其中多个通用报告分子中的每一个包含对包含在可检测的核酸产物之一中的独特通用序列标签(“UGST”)特异的通用序列,并且适应于在所述可检测的核酸产物的存在下产生信号;
其中生物样品和混合物由用户插入卡盒中,所述方法还包括:
-在插入生物样品和混合物之后操作卡盒,其中操作包括从生物样品进行核酸分离,然后进行包含混合物的多重核酸扩增;
-如果从所述扩增产生至少一种可检测的核酸产物,则检测从包含在卡盒内部的多个通用报告分子中的至少一个产生的信号。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述多个寡核苷酸子集中的至少一个对在对来自从中获得生物样品的个体的样品进行的下一代测序(NGS)分析中鉴定的遗传靶标是特异的。
3.根据上述权利要求中任一项所述的方法,其中从生物样品分离的核酸和多个寡核苷酸子集的混合物被移动到集成的流体卡盒内部,进入至少两个或更多个不同的扩增室。
4.根据权利要求3所述的方法,其中在不同的扩增室中提供不同的通用报告分子。
5.根据上述权利要求中任一项所述的方法,其中多个寡核苷酸子集中的一个或多个包含至少一种引物和至少一种介体探针,所述介体探针从5'到3'包含:
i)第一部分,其中第一部分包含UGST,其中UGST的序列与通用报告分子的UGST结合位点互补;
ii)第二部分,其中第二部分与待扩增的遗传靶标的第一链互补;
其中可检测的核酸产物是包含所述独特通用序列标签的切割的第一部分。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述至少一种引物是ARMS引物。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述ARMS引物包含茎环结构,并且优选地其中介体探针序列与所述茎环结构中包含的序列或其互补物至少部分重叠。
8.根据上述权利要求中任一项所述的方法,其中在存在多个寡核苷酸子集的混合物的情况下进行从生物样品中分离核酸。
9.根据上述权利要求中任一项所述的方法,其中至少一部分寡核苷酸子集是通过包括机器学习的计算机实施方法设计的。
10.根据上述权利要求中任一项所述的方法,其中多个寡核苷酸子集中的一个包含对人KIF11基因中的区域特异的引物,其中用所述引物产生的KIF11扩增子用作基因组参考基因。
11.一种试剂盒,其包括作为单独的组分提供的:
-多个寡核苷酸子集的混合物,每个所述子集对遗传靶标是特异的并且包含对所述子集独特的独特通用序列标签,其被定义为不存在于从其检测遗传靶标的生物体的遗传信息中的序列,
其中每个所述子集适应于在核酸扩增条件下和在遗传靶标的存在下产生包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物;和
-集成的流体卡盒,其包含
(i)用于接受生物样品和/或混合物的入口;
(ii)位于入口下游的核酸分离室;
(iii)用于核酸扩增的试剂;
(iv)位于核酸分离室下游的一个或多个核酸扩增室,和
(v)多个通用报告分子,其中多个通用报告分子中的每一个包含对独特通用序列标签之一特异的通用序列,并且适应于在包含独特通用序列标签的可检测的核酸产物的存在下产生信号。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,其中来自多个寡核苷酸子集的混合物的寡核苷酸子集至少包含引物和介体探针,并且优选地,其中所述引物是ARMS引物。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述ARMS引物包含茎环结构并且其中介体探针序列与所述茎环结构中包含的序列至少部分重叠。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的试剂盒,其中所述多个寡核苷酸子集中的一个或多个包含对人KIF11基因中的区域特异的引物,优选地其中所述多个寡核苷酸子集中的至少两个包含对人KIF11基因中的不同区域特异的引物,其中所述引物被设计成产生两个长度明显不同的KIF11扩增子。
15.权利要求1-10的方法或权利要求11-14的试剂盒用于优选在从癌症患者获得的样品中,更优选作为NGS分析后患者监测的一部分或在最小残留疾病监测中检测多个遗传靶标的用途。
16.一种系统或系统的一部分,所述系统包括作为单独的组分的:
可与自动化系统接合的卡盒,所述卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室;
其中入口与核酸分离室流体连接,并且其中核酸分离室与核酸扩增室流体连接;
其中核酸扩增室包含通用报告分子,其中通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其被配置用于靶核酸的扩增;任选地,靶特异性引物对中的至少一个成员是等位基因特异性的;
b)介体探针,其中介体探针从5'到3'包含:
i)第一部分,其中第一部分包含UGST,其中UGST的序列与通用报告分子的UGST结合位点互补;
ii)第二部分,其中第二部分与待扩增的靶核酸序列的第一链互补;
iii)任选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
17.一种系统或系统的一部分,所述系统包括作为单独的组分的:
可与自动化系统接合的卡盒,所述卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室;
其中入口与核酸分离室流体连接,并且其中核酸分离室与核酸扩增室流体连接;
其中核酸扩增室包含通用报告分子,其中通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其中靶特异性引物对的至少一个成员在与靶标结合时包含茎环结构,任选地,靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的,和;
b)介体探针,其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)第二部分,其中第二部分与引物的茎环结构或其互补物互补;
iii)任选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
18.一种系统或系统的一部分,所述系统包括作为单独的组分的:
被配置成接受卡盒的仪器,
所述卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室;
其中入口与核酸分离室流体连接,并且其中核酸分离室与核酸扩增室流体连接;
其中核酸扩增室包含通用报告分子,
其中通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其被配置用于靶核酸的扩增;任选地,靶特异性引物对中的至少一个成员是等位基因特异性的;
b)介体探针,其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含UGST,其中UGST的序列与通用报告分子的UGST结合位点互补;
ii)第二部分,其中第二部分与待扩增的靶核酸序列的第一链互补;
iii)任选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的系统,其中所述卡盒的核酸扩增室包含用于核酸扩增的试剂(PCR混合物)。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的系统,其中所述卡盒在核酸扩增室中包含多个通用报告分子,其中多个通用报告分子的每个UGST结合位点是不同的。
21.根据权利要求20所述的系统,其中所述多个通用报告分子中的每一个包含不同的标签。
22.根据权利要求16-21中任一项所述的系统,其中所述寡核苷酸混合物包含:
多个靶特异性扩增引物对,其中每个引物对对不同靶标具有特异性;和
多个介体探针,其中
i)每个介体探针的第一部分包含与多个通用报告分子中的一个通用报告分子的UGST结合位点互补的UGST;
ii)每个介体探针的第二部分与待扩增的多个靶核酸序列的不同靶核酸的第一链互补,
iii)任选地,每个介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
23.一种系统,其包括:
被配置成接受卡盒的仪器,所述卡盒包括:
a)入口,
b)核酸分离室;
c)核酸扩增室,
其中入口与核酸分离室流体连接,并且
其中核酸分离室与核酸扩增室流体连接;
其中核酸扩增室包含通用报告分子,其中通用报告分子是单链DNA,并且包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)独特通用序列标签(“UGST”)结合位点;
v)聚合酶延伸阻断剂;
寡核苷酸混合物,其包括:
a)靶特异性扩增引物对,其中靶特异性引物对的至少一个成员在与靶标结合时包含茎环结构,任选地,靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的,和
b)介体探针,其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)第二部分,其中第二部分与引物的茎环结构或其互补物互补;和
iii)任选地,聚合酶延伸阻断剂。
24.根据权利要求23所述的系统,其中所述卡盒的核酸扩增室包含用于核酸扩增的试剂(PCR混合物)。
25.根据权利要求23或24所述的系统,其中所述卡盒在核酸扩增室中包含多个通用报告分子,其中所述多个通用报告分子的每个UGST结合位点是不同的。
26.根据权利要求25所述的系统,其中所述多个通用报告分子中的每一个包含不同的标签。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的系统,其中所述寡核苷酸混合物包含:
多个靶特异性扩增引物对,其中每个引物对对不同靶标具有特异性;和
多个介体探针,其中
i)每个介体探针的第一部分包含与多个通用报告分子中的一个通用报告分子的UGST结合位点互补的UGST;
ii)每个介体探针的第二部分与待扩增的多个靶核酸序列的不同靶核酸的第一链互补;和
iii)任选地,每个介体探针包含聚合酶延伸阻断剂。
28.根据前述权利要求16-27中任一项所述的系统,其中所述等位基因特异性引物包括ARMS引物。
29.一种检测来自受试者的靶核酸的方法,其包括:
使用靶特异性引物对扩增来自受试者的核酸样品,并且其中扩增反应在介体探针和通用报告分子的存在下进行;
a)其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)第二部分,其中第二部分与靶核酸的第一链互补;
iii)任选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂;
b)其中通用报告分子包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)UGST结合位点,其与介体探针的UGST互补;
v)聚合酶延伸阻断剂;
其中荧光团/猝灭剂对的成员经由茎环结构定位以猝灭荧光团;和
检测在靶核酸存在的情况下由荧光团/猝灭剂对的荧光团产生的信号,从而检测靶核酸的存在。
30.一种检测来自受试者的靶核酸的方法,其包括:
使用靶特异性引物对扩增来自受试者的核酸样品,
其中靶特异性引物对的至少一个成员在与靶标结合时包含茎环结构,任选地,靶特异性引物对的至少一个成员是等位基因特异性的,并且
其中扩增反应在介体探针和通用报告分子的存在下进行;
a)其中介体探针从5’到3’包含:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)第二部分,其中第二部分与引物的茎环结构或其互补物互补;
iii)任选地,介体探针包含聚合酶延伸阻断剂;
b)其中通用报告分子包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)UGST结合位点,其与介体探针的UGST互补;
v)聚合酶延伸阻断剂;
其中荧光团/猝灭剂对的成员经由茎环定位以猝灭荧光团;和
检测在靶核酸存在的情况下由荧光团/猝灭剂对的荧光团产生的信号,从而检测靶核酸的存在。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述等位基因特异性引物包括ARMS引物。
32.一种检测来自受试者的靶核酸的方法,其包括:
使用靶特异性引物对扩增来自受试者的核酸样品,
其中靶特异性引物对的至少一个成员在与靶标结合时包含茎环结构并且任选地是等位基因特异性的(“FuseTag”),
其中扩增反应在通用报告分子的存在下进行;
a)其中FuseTag从5’到3’包括:
i)第一部分,其中第一部分包含独特通用序列标签(“UGST”);
ii)茎环结构;
iii)第二部分,其中第二部分与靶标互补,并且优选地是等位基因特异性的;
b)其中通用报告分子包含:
i)荧光团/猝灭剂对的第一个成员;
ii)茎环结构;
iii)荧光团/猝灭剂对的第二个成员;
iv)UGST结合位点,其与FuseTag的UGST互补;
v)聚合酶延伸阻断剂;
其中荧光团/猝灭剂对的成员经由茎环结构定位以猝灭荧光团;
检测在靶核酸存在的情况下由荧光团/猝灭剂对的荧光团产生的信号,从而检测靶核酸的存在。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述FuseTag选自SEQ ID NO:62-66。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述通用报告分子选自SEQ ID NO:87和88。
35.根据前述权利要求中任一项所述的系统或方法,其包括对照反应,所述对照反应包括KIF11检测。
36.根据权利要求32所述的系统或方法,其包括SEQ ID NO:69-88。
37.一种用于相对于样品中的KIF11核酸定量样品中的靶核酸的数量的方法,其包括:
1.在KIF11扩增反应中使用KIF11特异性引物对扩增样品中包含的KIF11核酸,
i.其中KIF11特异性引物对的每个成员彼此独立地与位于KIF11基因的外显子、内含子或非编码序列中的KIF11区域互补;
ii.其中KIF11扩增反应在KIF11检测探针的存在下进行;
2.检测KIF11检测探针在KIF11扩增反应中产生的信号;
3.定量2.的信号;
4.在靶扩增反应中使用靶特异性引物对从样品扩增靶核酸;
其中靶扩增反应是在存在靶检测探针的情况下进行的;和
5.检测靶检测探针在靶扩增反应中产生的信号;
6.定量5.的信号;
7.将6.的定量的信号针对3.的定量的信号进行标准化,从而相对于样品中的KIF11核酸定量样品中的靶核酸的数量。
38.一种用于确定样品中的gDNA污染的方法,其包括:
1.在KIF11扩增反应中使用第一和第二KIF11特异性引物对扩增样品中包含的KIF11核酸,
a.其中第一KIF11特异性引物对的至少一个成员与KIF11基因的KIF11内含子或非编码序列互补;
b.其中使用第一KIF11特异性引物对的扩增反应在第一KIF11检测探针的存在下进行;
c.其中第二KIF11特异性引物对的每个成员位于KIF11外显子中;
d.其中使用第二KIF11特异性引物对的扩增反应在第二KIF11检测探针的存在下进行;
2.检测第一和第二KIF11检测探针在第一和第二KIF11扩增反应中产生的信号;
3.对第一和第二KIF11扩增反应的信号进行定量;
4.将第一扩增反应的定量的信号针对第二扩增信号的定量的信号进行标准化,从而确定样品中的gDNA污染,优选样品为线粒体DNA、cDNA、mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、microRNA、lncRNA、cfDNA、细胞游离肿瘤DNA或siRNA样品。
39.一种用于确定样品中核酸的完整性的方法,其包括:
1.在KIF11扩增反应中使用第一和第二KIF11特异性引物对扩增样品中包含的KIF11核酸,
a.其中第一KIF11特异性引物对的每个成员彼此独立地与位于KIF11基因的外显子、内含子或非编码序列中的KIF11区域互补;
b.其中使用第一KIF11特异性引物对的扩增反应在第一KIF11检测探针的存在下进行;
c.其中第二KIF11特异性引物对的每个成员彼此独立地与位于KIF11基因的外显子、内含子或非编码序列中的KIF11区域互补;
d.其中使用第二KIF11特异性引物对的扩增反应在第二KIF11检测探针的存在下进行;
e.优选地,由第一和第二KIF11特异性引物对的扩增反应产生的扩增子位于足够远的位置以不干扰,例如扩增子为至少600个碱基对(bp),例如至少700bp、800bp、900bp或甚至更多,例如至少1千碱基对;
2.通过以下步骤确定每个所述核酸扩增反应中的阈值:
i.在扩增反应期间的多个不同时间测量至少一种信号,其强度与反应中扩增的核酸序列的量相关;和
ii.确定与导数特征相关联的循环数,其代表阈值;
3.比较第一和第二KIF11扩增反应的阈值(阈值循环数);
4.其中第一和第二KIF11扩增反应的阈值循环数(ΔCq)之间的差异是基因组DNA完整性的量度。
40.一种用于确定gDNA片段化的方法,其包括:
i.通过第一、第二和第三扩增反应,优选通过PCR产生具有可辨别的长度的3个(第一、第二和第三)KIF11扩增子;
ii.确定所述第一、第二和第三扩增反应的Cq值;
iii.比较所述第一、第二和第三扩增反应的Cq;
其中所述第一、第二和第三扩增反应之间的Cq值的差异是gDNA片段化的指示。
41.一种用于确定gDNA片段化的方法,其包括:
i.通过第一扩增反应产生第一KIF11扩增子(“短”);和
ii.通过第二扩增反应产生第二KIF11扩增子(“长”);
iii.确定所述第一扩增反应和所述第二扩增反应的Cq值;
iv.确定所述第一扩增反应和所述第二扩增反应的ΔCq值;
其中ΔCq是gDNA片段化的指示。
42.试剂盒用于扩增基因组参考基因KIF11的区域的用途,所述试剂盒包含引物和包括扩增方案和结果分析的说明书,其中引物是选自以下的引物对:
i.SEQ ID NO:69和70;
ii.SEQ ID NO:71和72;
iii.SEQ ID NO:73和74;
iv.SEQ ID NO:75和76;
v.SEQ ID NO:77和78;和
vi.SEQ ID NO:79和80,
优选地,扩增的区域通过选自SEQ ID NO:81-86的探针检测,优选通过选自SEQ ID NO:87和88的通用报告分子检测。
43.一种用于对处理、分离和扩增过程进行质量控制的方法,其包括:
i.样品处理;
ii.核酸分离;
iii.通过扩增反应生成3个长度明显不同的KIF11扩增子;
iv.确定每个所述KIF11扩增子的Cq值;
其中KIF11扩增子的Cq值是处理、分离和扩增的质量控制的量度。
44.一种用于使用KIF11作为对照的试剂盒,所述试剂盒包括:
i.被设计用于与KIF11基因的扩增子退火的至少一种探针;
ii.进行退火反应所需的产品和试剂;和
iii.使用说明;
其中探针是其至少一部分对如本文所述的扩增子特异的探针。
45.一种用于生物样品的自动化处理的系统,所述系统包括:
a.被配置成包含一个或多个样品处理模块的外壳,每个样品处理模块被配置成容纳如本文所述的可拆卸卡盒,其中所述系统被配置成操作样品处理模块以执行PCR以确定一种或多种靶基因的存在和/或数量并任选地确定相应可拆卸样品卡盒内的一种或多种靶DNA序列的水平,其中对相应可拆卸样品卡盒内的样品的所述处理执行包括以下的方法:在用于接收所述卡盒的生物样品的入口中提供样品;和使用所述卡盒;
b.用于从入口接收的生物样品分离核酸的工具,所述工具能够与用于接收生物样品的所述入口流体连通;
c.与用于接收生物样品的所述入口流体连接并定位在所述入口的下游的包含用于执行PCR的试剂和/或缓冲液的多个腔室;
i.所述多个腔室包括含有PCR混合物的腔室;
ii.所述多个腔室包括含有用于扩增KIF11基因的全部或区域的引物的至少一个腔室;和
iii.所述多个腔室包括含有用于检测所述KIF11基因的全部或区域的探针的腔室,
d.在所述腔室中进行核酸扩增以检测和/或定量所述靶核酸,
其中所述KIF11基因用作内部对照,从而检测和/或定量所述靶核酸。
46.一种用于进行PCR以检测和/或定量一种或多种靶基因并任选地检测和/或定量核酸的试剂盒,所述试剂盒包括含有如本文所述的卡盒和任选地使用说明的容器。
47.根据权利要求1-10、29-41和43中任一项所述的方法、根据权利要求16-28中任一项所述的系统、根据权利要求11-14中任一项所述的试剂盒,其包含来自选自以下的引物对的至少一种引物:
(1)EGFR引物对,其中
EGFR正向引物选自SEQ ID NO:1-34,并且
EGFR反向引物选自SEQ ID NO:44-48;
优选地,EGFR扩增子由SEQ ID NO:53-57中的任一个检测;
(2)BRAF引物对,其中
BRAF正向引物选自SEQ ID NO:35和36,并且BRAF反向引物是SEQ ID NO:49;
优选地,BRAF扩增子通过SEQ ID NO:58检测;
(3)KRAS引物对,其中
KRAS正向引物选自SEQ ID NO:37-39和67-68,并且KRAS反向引物是SEQ ID NO:50;
优选地,KRAS扩增子由SEQ ID NO:59检测;
(4)HER2引物对,其中
HER2正向引物选自SEQ ID NO:40-42,并且HER2反向引物是SEQ ID NO:51;
优选地,HER2扩增子通过SEQ ID NO:60检测。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN117144067A (zh) * | 2023-10-31 | 2023-12-01 | 中国医学科学院北京协和医院 | 用于多重化核酸检测的组合物和方法 |
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2021
- 2021-10-29 CN CN202180087829.8A patent/CN116783308A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117144067A (zh) * | 2023-10-31 | 2023-12-01 | 中国医学科学院北京协和医院 | 用于多重化核酸检测的组合物和方法 |
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