CN110964814B - 用于核酸序列变异检测的引物、组合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学及领域。具体而言,本发明提供了一种用于测定核酸序列变异的数字PCR引物对、其组合物及其用于检测核酸序列变异的方法。本发明改进的数字PCR引物对的正向引物包含上游检测区和靶序列结合区,且靶序列结合区含有扩增决定位点和上游错配区,而上游检测区分别包含与探针具有相同序列的区域和与第二正向引物具有相同序列的的区域。与现有技术相比,本发明具有显著提高的灵敏度和高度特异性,并且大幅降低了引物和测试成本,具有极高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,用于进行核酸序列变异检测的数字PCR引物及其组合物。更具体地,本发明涉及一种在核酸序列变异检测中提高不同核酸之间的区分度的数字PCR引物,其组合物、及含有该引物的试剂盒及用途。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体而对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务,例如基因克隆、实验动物表型鉴定、转录组研究、遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、亲子鉴定等等。由于其无可比拟的复制和精确能力,PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。上世纪90年代后期,美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR,qPCR)技术及相关产品更是将PCR发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的核酸序列分析技术。
但是,在PCR扩增过程中影响其扩增效率的因素有很多,不能保证在反应过程中扩增效率保持不变和实际样品与标准样品以及不同样品之间的扩增效率是相同的,由此导至其定量分析所依赖的基础——循环阈值(Ct)不是恒定不变的。因此qPCR的定量只是“相对定量”,其准确度和重现性依然不能够满足分子生物学定量分析的要求。
数字PCR(digital PCR,dPCR)技术是一种核酸分子绝对定量技术,其利用极限稀释的原理将一个荧光定量PCR反应体系分配到成千上万份单独的纳升级微反应器中,使得每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子(DNA靶标),再同时进行单分子模板PCR扩增。不同于荧光定量PCR在每个扩增循环进行时采集荧光的方法,数字PCR在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行独立采集,最后通过泊松分布的原理及阳性/阴性的反应单元的比例得出目标分子的原始拷贝数或浓度。
相较于荧光定量PCR,数字PCR不依靠Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测,具有灵敏度高以及精确度高的优势。由于数字PCR在进行结果判读时仅判断“有/无“两种扩增状态,因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点,完全不依赖于Ct值的鉴定,所以数字PCR反应和结果判读受扩增效率的影响大大降低,对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高。此外,数字PCR实验中对反应体系进行分配的过程可以极大程度上在局部降低与靶标序列有竞争作用的背景序列浓度。因此,由于数字PCR具有更高的灵敏度和精确度,在需要以高灵敏度对拷贝量低的差异性核酸分子进行定量和检测时,体现出相比于传统的荧光定量PCR的显著优势。尤其是在复杂背景中检测稀有突变,常见于肿瘤液体活检、无创产前检测、器官移植监测、病毒载量的精确定量、转基因作物的成分检测等,例如在肿瘤患者外周血中检测稀有突变标志物,或是基因表达差异研究等等。
目前现有的核酸序列变异检测试剂,多采用TaqMan竞争探针法或是扩增阻滞系统(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)。其中TaqMan探针的基本原理是利用扩增过程中Taq酶的5’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针,该探针5’端标记荧光报告基团,3’端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针延伸,当引物延伸至寡核苷酸探针结合位置时,Taq酶可以将其切割成小片段,使得荧光报告基团与淬灭基团分开,从而发出荧光。将其运用在核酸差异性检测中,通常会采用两条竞争性探针,一条针对突变型的靶核酸序列,另一条针对野生型的靶核酸序列。然而,传统的Taqman探针用于检测时往往存在交叉反应的问题,特别是在核酸序列差异较小、较难区分的情况下,例如在点突变检测中,野生型与突变型仅仅只有一个碱基的差异,探针的交叉反应容易影响检测试剂的特异性,造成假阴性或假阳性结果。鉴于此,有一些检测方法采用小沟结合剂(MinorGroove Binder,MGB)修饰竞争性探针或是采用锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)探针来提高探针的特异性从而减少或避免交叉反应。然而这些探针修饰方法均属于国外专利,价格昂贵,不利于大规模的推广使用。
另一方面,ARMS利用DNA聚合酶缺乏3’外切酶活性的特点,如果引物的3’末端碱基不能与靶核酸序列正确的互补配对,那么靶核酸序列就不能被有效的扩增。在进行点突变的检测时,使用两条竞争性的ARMS正向引物,分别扩增突变型和野生型的靶核酸序列,两者共用一条水解探针以及一条反向引物,因此难以在一个反应管中实现突变型与野生型的同时检测,所以通常使用两个单独的反应体系分别检测突变型或野生型。然而实践中往往受制于实验取材的难度,或是在临床检测中来自患者的生物标本通常十分有限,特别是在液体活检时采集的外周血、尿液、灌洗液、脑脊液等样品中所含的靶核酸浓度极低,分管检测将极大的降低检测灵敏度,同时增加检测成本,不利于临床应用。同时,普通的ARMS引物往往无法阻滞非特异性的模板扩增,在检测时容易产生假阳性的结果,尤其是在数字PCR系统中,突变型和野生型的在扩增终点时的荧光信号往往很难区分,因此导致检测的特异性不足。
在数字PCR技术的应用中,由于其不依靠Ct值和标准曲线,仅通过终点荧光信号强度进行结果判读,无法通过ΔCt来区分突变型与野生型,所以对引物探针的特异性要求极高,应尽可能的避免交叉反应,使得待检测的靶标在扩增终点时的荧光信号强度与其它背景信号或非特异性信号可以完全的区分。因此需要设计出一种灵敏度高,特异性好,成本低的引物探针来满足数字PCR技术检测的需要。
发明内容
为此,本发明提供了一种新的数字PCR引物、包含该引物的组合物和试剂盒,及其用途。本发明解决了现有的数字PCR引物-探针组合在核酸序列变异检测中存在的交叉反应问题,相比于现有技术兼具特异性和灵敏度的显著优势。又一方面,本发明的引物设计方式及其使用方法能够在提高核酸序列变异检测的精确度的情况下保持较低的成本。
具体而言,在第一个方面,本发明提供了一种用于测定核酸序列变异的数字PCR引物对,其包括第一正向引物(简称F1)和反向引物(简称R),所述第一正向引物从5’端至3’端依次包含上游检测区和靶序列结合区,其中:
(1)靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点,所述扩增决定位点与靶序列上的变异检测位点互补,且扩增决定位点的上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区;及
(2)上游检测区从5’至3’端包含:与第二正向引物(简称F2)具有相同序列的(a)部分,以及与探针(简称P)具有相同序列的(b)部分。
在一些实施方案中,所述反向引物可以是与靶序列变异检测位点下游的序列互补的常规引物,例如根据碱基互补配对原理以本领域公知的常规技术手段设计的引物。优选地,所述第一正向引物或第二正向引物可以与同一种反向引物分别组成引物对。在一些更优选的实施方案中,反向引物与靶序列的互补区位于正向引物与靶序列的互补区的下游0-200bp区域内,例如可以是0-100bp,进一步可以是0-50bp。在一些实施方案中,所述正向引物与反向引物的命名可以基于正义/反义链的关系转换而互换。
在一些实施方案中,第一正向引物与第二正向引物的Tm值不同。在一些优选实施方案中,第一正向引物靶序列结合区的Tm值比第二正向引物的Tm值更高。在一些优选实施方案中,第一正向引物靶序列结合区的Tm值比第二正向引物的Tm值高5℃-20℃,优选为高10℃-15℃。
在一些实施方案中,靶序列结合区中的所述错配区长度为1-15个碱基,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、1 4或15个碱基。在一些实施方案中,所述扩增决定位点与所述上游的错配区距离可以为0-20个碱基。在本发明的一些实施方案中,所述扩增决定位点的3’端即为第一正向引物的3’末端;换言之,所述扩增决定位点位于第一正向引物的3’末端,且该位点下游无其他碱基。在本发明的另一些实施方案中,所述扩增决定位点的下游还有1-10个碱基。
在一些实施方案中,所述上游检测区中的(a)部分与(b)部分之间间隔有一个或多个碱基。在另一些实施方案中,所述上游检测区中的(a)部分与(b)部分之间没有其他碱基间隔。在一些优选的实施方案中,所述上游检测区不与靶序列相同或互补配对或在高严格条件下杂交。
在一些实施方案中,探针带有报告基团。在优选的实施方案中,只有在所述探针被水解后,所述报告基团才是可检测的。在进一步的实施方案中,所述探针上带有报告基团和淬灭基团。在更进一步的实施方案中,所述报告基团可以是选自下组的荧光基团:FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5、Cy3等;所述淬灭基团可以选自下组:TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、QXL、DDQI等。在一些实施方案中,所述探针除报告基团和淬灭基团外不带有任何其他修饰,所述其他修饰例如MGB、LNA、PNA、BNA、SuperBase等。在一个优选实施方案中,本发明的探针为Taqman探针。在一个优选实施方案中,所述报告基团位于探针的5’端,淬灭基团位于探针的3’端。
在一些实施方案中,所述核酸序列变异可以是选自下组的一项或多项:碱基置换突变、插入突变、缺失突变、和倒位突变。在一些实施方案中,所述核酸序列变异是碱基置换突变,即待检测的两种靶序列(例如野生型和突变型)之间没有碱基数目的差别,但其中一个或多个碱基的类型不同,例如其中一个或多个碱基的类型不同。在一些实施方案中,所述核酸序列变异是点突变,即只有1个碱基的类型不同。
在一些实施方案中,第一正向引物长度可以是50-120个碱基。优选为60-90个碱基。在一些实施方案中,第一正向引物的靶序列结合区的Tm值可以是40℃-90℃,优选为50℃-80℃,GC含量为30%-80%。
在一些实施方案中,第二正向引物长度可以是10-40个碱基,优选为14-30个碱基。在一些实施方案中,第二正向引物的Tm值可以是35℃-85℃,优选为45℃-75℃,GC含量为30%-80%。
在一些实施方案中,探针的长度为12-30个碱基。在进一步的实施方案中,探针的Tm值为55℃-75℃。在更进一步的实施方案中,探针的GC含量40%-80%。
在一些实施方案中,反向引物的长度为15-30个碱基。在进一步的实施方案中,反向引物的Tm值为55℃-75℃。在更进一步的实施方案中,反向引物的GC含量40%-80%。
在第二个方面,本发明提供了一种利用数字PCR测定核酸序列变异的方法,包括如下步骤:
(i)提供包含靶核酸的待测定样品,对样品进行极限稀释并随机分配至770-10,000,000个反应单元中,随后对所有反应单元进行统一的热循环扩增;
(ii)在第一退火温度处,以第一正向引物(简称F1)和反向引物(简称R)作为引物对进行靶核酸序列的预扩增;
(iii)在第二退火温度处,以第二正向引物(简称F2)、反向引物、和探针(简称P)继续扩增步骤(ii)中所得的预扩增产物,其中所述探针带有报告基团;和(iv)在步骤(iii)后检测反应体系中报告基团所发出的信号,根据信号对样品中的靶核酸进行定量;
其中,只有所述探针被水解后,所述报告基团才是可检测的;
且其中所述第一正向引物从5’端至3’端依次包含上游检测区和靶序列结合区,其中:
(1)靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点,所述扩增决定位点与靶序列上的变异检测位点互补,且扩增决定位点的上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区;及
(2)上游检测区从5’至3’端包含:与第二正向引物具有相同序列的(a)部分,以及与探针具有相同序列的(b)部分。
在一些实施方案中,所述反向引物可以是与靶序列变异检测位点下游的序列互补的常规引物,例如根据碱基互补配对原理以本领域公知的常规技术手段设计的引物。优选地,步骤(i)与(ii)中所述的反向引物是相同的。在一些更优选的实施方案中,反向引物与靶序列的互补区位于正向引物与靶序列的互补区的下游50-200bp区域内。在一些实施方案中,所述正向引物与反向引物的命名可以基于正义/反义链的关系转换而互换。
在一些实施方案中,第一退火温度和第二退火温度是不同的。在一些实施方案中,第一正向引物与第二正向引物的Tm值不同。在一些优选实施方案中,第一正向引物的Tm值比第二正向引物的Tm值更高。在一些优选实施方案中,第一正向引物靶序列结合区的Tm值比第二正向引物的Tm值高5℃-20℃,优选为高10℃-15℃。
在一些实施方案中,靶序列结合区中的所述错配区长度为1-15个碱基,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碱基。在一些实施方案中,所述扩增决定位点与所述上游的错配区距离可以为0-20个碱基。在本发明的一些实施方案中,所述扩增决定位点的3’端即为第一正向引物的3’末端;换言之,所述扩增决定位点位于第一正向引物的3’末端,且该位点下游无其他碱基。在本发明的另一些实施方案中,所述扩增决定位点的下游还有1-10个碱基。
在一些实施方案中,所述上游检测区中的(a)部分与(b)部分之间间隔有一个或多个碱基。在另一些实施方案中,所述上游检测区中的(a)部分与(b)部分之间没有其他碱基间隔。在一些优选的实施方案中,所述上游检测区不与靶序列相同或互补配对或在高严格条件下杂交。
在一些实施方案中,所述探针上带有报告基团和淬灭基团。在更进一步的实施方案中,所述报告基团可以是选自下组的荧光基团:FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5、Cy3等;所述淬灭基团可以选自下组:TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、QXL、DDQI等。在一些实施方案中,所述探针除报告基团和淬灭基团外不带有任何其他修饰,所述其他修饰例如MGB、LNA、PNA、BNA、SuperBase等。在一个优选实施方案中,本发明的探针为Taqman探针。在一个优选实施方案中,所述报告基团位于探针的5’端,淬灭基团位于探针的3’端。
在一些实施方案中,所述核酸序列变异可以是选自下组的一项或多项:碱基置换突变、插入突变、缺失突变、和倒位突变。在一些实施方案中,所述核酸序列变异是碱基置换突变,即待检测的两种靶序列(例如野生型和突变型)之间没有碱基数目的差别,但其中一个或多个碱基的类型不同,例如其中一个或多个碱基的类型不同。在一些实施方案中,所述核酸序列变异是点突变,即只有1个碱基的类型不同。
在一些实施方案中,同一反应体系中仅使用一种第一正向引物。例如,同一反应体系仅测定突变型靶序列,或仅测定野生型靶序列。在另一些实施方案中,同一反应体系中使用多种(例如2种或更多种)第一正向引物(例如同一反应单元中具有多种第一正向引物),以及多种(例如2种或更多种)探针(例如同一反应单元中具有多种探针)。优选地,所述多种第一正向引物的扩增决定位点不同、且上游检测区的(b)部分不同;所述多种探针具有相互不同的序列和报告基团;任选地,所述上游检测区的(a)部分也可以不同。例如,所述方法可用于同时测定野生型和突变型靶序列,或是同时测定多种突变型靶序列。在使用多种F1引物及探针的一些实施方案中,不同的第一正向引物可以共用同一种反向引物。
在一些实施方案中,第一正向引物长度可以是50-120个碱基。优选为60-90个碱基。在一些实施方案中,第一正向引物的靶序列结合区的Tm值可以是40℃-90℃,优选为50℃-80℃,GC含量为30%-80%。在一些实施方案中,第二正向引物长度可以是10-40个碱基,优选为14-30个碱基。在一些实施方案中,二正向引物的Tm值可以是35℃-85℃,优选为45℃-75℃,GC含量为30%-80%。在一些实施方案中,探针的长度为12-30个碱基。在进一步的实施方案中,探针的Tm值为55℃-75℃。在更进一步的实施方案中,探针的GC含量40%-80%。在一些实施方案中,反向引物的长度为15-30个碱基。在进一步的实施方案中,反向引物的Tm值为55℃-75℃。在更进一步的实施方案中,反向引物的GC含量40%-80%。
在一些具体实施方案中,F1和R引物进行预扩增的循环数为3-10个循环;更优选地,F1引物进行预扩增的循环数为5-8个循环。在一些具体实施方案中,本发明中F2引物以及探针P进行扩增和测定的循环数为35-50个循环,更优选的,F2引物以及探针P进行扩增和测定的循环数为40-45个循环。
在一些具体实施方案中,所述预扩增比继续扩增的退火温度高5℃-20℃,更优选为高10℃-15℃。
数字PCR扩增所适用的程序及常用反应条件(如变性温度、时间等)是本领域所熟知的。例如,在一些示例性的实施方案中,步骤(ii)和步骤(iii)中的具体扩增反应条件可以是:92℃-96℃预变性5-15分钟;92℃-95℃变性10-60秒,55℃-75℃退火及延伸30-90秒,共进行3-10个循环;92℃-95℃变性10-60秒,45℃-65℃退火及延伸30-90秒,共进行35-50个循环;94℃-98℃灭活5-15分钟;4℃-15℃终止反应。
本发明中所述的反应体系中引物和探针的浓度可以通过本领域常规实验来确定。在一些示例性的实施方案中,反应体系中F1引物的浓度为15nM-150nM,F2引物的浓度为150nM-1500nM,探针P的浓度为50nM-800nM,R引物的浓度为150nM-1800nM。在一些更优选的实施方案中,反应体系中F1引物的浓度为30nM-60nM,F2引物的浓度为300nM-600nM,探针P的浓度为150nM-400nM,引物R的浓度为300nM-900nM。
本发明中所述的信号检测方法采用了TaqMan探针法的原理,即利用DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性使探针水解进而产生荧光信号。由于探针与模板的特异性结合,所以在数字PCR反应中,发出荧光信号的微滴数量就代表了反应体系中模板的数量,最后通过泊松修正即可得到模板的浓度。对于TaqMan探针作为荧光信号产生方式而言,探针的设计方法和传统PCR方法相同。
在一些实施方案中,提供靶序列的样品可以是生物样品,例如生物体液、活体组织、冷冻组织、石蜡切片等。在一些优选的实施方案中,所述样品是,例如外周血、尿液、灌洗液、脑脊液、粪便、唾液等。
在第三个方面,本发明提供了一种数字PCR引物及探针组合物,其包含一种或多种第一正向引物(简称F1)、第二正向引物(简称F2)、反向引物(简称R)和探针(简称P),所述第一正向引物从5’端至3’端依次包含上游检测区和靶序列结合区,其中:
(1)靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点,所述扩增决定位点与靶序列上的变异检测位点互补,且扩增决定位点的上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区;及
(2)上游检测区从5’至3’端包含:与第二正向引物具有相同序列的(a)部分,以及与探针(简称P)具有相同序列的(b)部分;
且其中所述探针带有报告基团,只有在所述探针被水解后,报告基团才是可检测的。
在一些实施方案中,所述反向引物可以是与靶序列变异检测位点下游的序列互补的常规引物,例如根据碱基互补配对原理以本领域公知的常规技术手段设计的引物。优选地,所述第一正向引物或第二正向引物可以与同一种反向引物分别组成引物对。在一些更优选的实施方案中,反向引物与靶序列的互补区位于正向引物与靶序列的互补区的下游0-200bp区域内,例如可以是0-100bp,进一步可以是0-50bp。在一些实施方案中,所述正向引物与反向引物的命名可以基于正义/反义链的关系转换而互换。
在一些实施方案中,第一正向引物与第二正向引物的Tm值不同。在一些优选实施方案中,第一正向引物的Tm值比第二正向引物的Tm值更高。在一些优选实施方案中,第一正向引物靶序列结合区的Tm值比第二正向引物的Tm值高5℃-20℃,优选为高10℃-15℃。
在一些实施方案中,靶序列结合区中的所述错配区长度为1-15个碱基,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碱基。在一些实施方案中,所述扩增决定位点与所述上游的错配区距离可以为0-20个碱基。在本发明的一些实施方案中,所述扩增决定位点的3’端即为第一正向引物的3’末端;换言之,所述扩增决定位点位于第一正向引物的3’末端,且该位点下游无其他碱基。在本发明的另一些实施方案中,所述扩增决定位点的下游还有1-10个碱基。
在一些实施方案中,所述上游检测区中的(a)部分与(b)部分之间间隔有一个或多个碱基。在另一些实施方案中,所述上游检测区中的(a)部分与(b)部分之间没有其他碱基间隔。在一些优选的实施方案中,所述上游检测区不与靶序列相同或互补配对或在高严格条件下杂交。
在一些实施方案中,所述探针上带有报告基团和淬灭基团。在更进一步的实施方案中,所述报告基团可以是选自下组的荧光基团:HEX、FAM、FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5、Cy3等;所述淬灭基团可以选自下组:TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、QXL、DDQI等。在一些实施方案中,所述探针除报告基团和淬灭基团外不带有任何其他修饰,所述其他修饰例如MGB、LNA、PNA、BNA、SuperBase等。在一个优选实施方案中,所述报告基团位于探针的5’端,淬灭基团位于探针的3’端。
在一些实施方案中,所述核酸序列变异可以是选自下组的一项或多项:碱基置换突变、插入突变、缺失突变、和倒位突变。在一些实施方案中,所述核酸序列变异是碱基置换突变,即待测定的两种靶序列(例如野生型和突变型)之间没有碱基数目的差别,但其中一个或多个碱基的类型不同,例如其中一个或多个碱基的类型不同。在一些实施方案中,所述核酸序列变异是点突变,即只有1个碱基的类型不同。
在一些实施方案中,第一正向引物长度可以是50-120个碱基。优选为60-90个碱基。在一些实施方案中,第一正向引物的靶序列结合区的Tm值可以是40℃-90℃,优选为50℃-80℃,GC含量为30%-80%。
在一些实施方案中,第二正向引物长度可以是10-40个碱基,优选为14-30个碱基。在一些实施方案中,二正向引物的Tm值可以是35℃-85℃,优选为45℃-75℃,GC含量为30%-80%。
在一些实施方案中,探针的长度为15-30个碱基。在进一步的实施方案中,探针的Tm值为55℃-75℃。在更进一步的实施方案中,探针的GC含量40%-80%。
在一些实施方案中,反向引物的长度为15-30个碱基。在进一步的实施方案中,反向引物的Tm值为55℃-75℃。在更进一步的实施方案中,反向引物的GC含量40%-80%。
在本发明的第四个方面,本发明提供了一种用于测定核酸序列变异的数字PCR试剂盒,其包含前述任一实施方案所述的引物及探针组合物。在一些实施方案中,本发明提供了一种用于测定肿瘤相关基因变异的数字PCR试剂盒。在一些实施方案中,所述变异为点突变。
在一些实施方案中,所述试剂盒进一步包含反应缓冲液、阴性对照、阴性对照和/或空白对照。在一些实施方案中,所述反应缓冲液含有KCl、MgCl2、Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、多种dNTP以及DNA聚合酶。
在本发明的第五个方面,提供了一种诊断基因变异相关疾病或评估受试者患上该疾病风险的方法,包括如下步骤:
(i)从受试者获取包含靶核酸的待测样品,对样品进行极限稀释并随机分配至770-10,000,000个反应单元中,随后对所有反应单元进行统一的热循环扩增;
(ii)在第一退火温度处,以第一正向引物(简称F1)和反向引物(简称R)作为引物对进行靶核酸序列的预扩增;
(iii)在第二退火温度处,用第二正向引物(简称F2)、反向引物、和探针(简称P)继续扩增步骤(ii)中所得的扩增产物,其中所述探针带有报告基团;
(iv)在步骤(iii)后检测反应体系中报告基团所发出的信号,根据信号对样品中的靶核酸进行定量;和
(v)根据步骤(iv)中核酸的定量结果,诊断所述受试者为罹患或未罹患该疾病,或评估该受试者换上该疾病的风险;
其中,只有所述探针被水解后,所述报告基团才是可检测的;
且其中所述第一正向引物从5’端至3’端依次包含上游检测区和靶序列结合区,其中:
(1)靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点,所述扩增决定位点与靶序列上的变异检测位点互补,且扩增决定位点的上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区;及
(2)上游检测区从5’至3’端包含:与第二正向引物具有相同序列的(a)部分,以及与探针具有相同序列的(b)部分。
在一些实施方案中,所述反向引物可以是与靶序列变异检测位点下游的序列互补的常规引物,例如根据碱基互补配对原理以本领域公知的常规技术手段设计的引物。优选地,步骤(i)与(ii)中所述的反向引物是相同的。在一些更优选的实施方案中,反向引物与靶序列的互补区位于正向引物与靶序列的互补区的下游50-200bp区域内。在一些实施方案中,所述正向引物与反向引物的命名可以基于正义/反义链的关系转换而互换。
在一些实施方案中,所述第一退火温度和第二退火温度是不同的。在一些实施方案中,第一正向引物与第二正向引物的Tm值不同。在一些优选实施方案中,第一正向引物的Tm值比第二正向引物的Tm值更高。在一些优选实施方案中,第一正向引物靶序列结合区的Tm值比第二正向引物的Tm值高5℃-20℃,优选为高10℃-15℃。
在一些实施方案中,靶序列结合区中的所述错配区长度为1-15个碱基,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碱基。在一些实施方案中,所述扩增决定位点与所述上游的错配区距离可以为0-20个碱基。在本发明的一些实施方案中,所述扩增决定位点的3’端即为第一正向引物的3’末端;换言之,所述扩增决定位点位于第一正向引物的3’末端,且该位点下游无其他碱基。在本发明的另一些实施方案中,所述扩增决定位点的下游还有1-10个碱基。
在一些实施方案中,所述上游检测区中的(a)部分与(b)部分之间间隔有一个或多个碱基。在另一些实施方案中,所述上游检测区中的(a)部分与(b)部分之间没有其他碱基间隔。在一些优选的实施方案中,所述上游检测区不与靶序列相同或互补配对或在高严格条件下杂交。
在一些实施方案中,所述探针上带有报告基团和淬灭基团。在更进一步的实施方案中,所述报告基团可以是选自下组的荧光基团:FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5、Cy3等;所述淬灭基团可以选自下组:TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、QXL、DDQI等。在一些实施方案中,所述探针除报告基团和淬灭基团外不带有任何其他修饰,所述其他修饰例如MGB、LNA、PNA、BNA、SuperBase等。在一个优选实施方案中,本发明的探针为Taqman探针。在一个优选实施方案中,所述报告基团位于探针的5’端,淬灭基团位于探针的3’端。
在一些实施方案中,所述核酸序列变异可以是选自下组的一项或多项:碱基置换突变、插入突变、缺失突变、和倒位突变。在一些实施方案中,所述核酸序列变异是碱基置换突变,即待测定的两种靶序列(例如野生型和突变型)之间没有碱基数目的差别,但其中一个或多个碱基的类型不同,例如其中1-X个碱基的类型不同。在一些实施方案中,所述核酸序列变异是点突变,即只有1个碱基的类型不同。
在一些实施方案中,同一反应体系中仅使用一种第一正向引物。例如,同一反应体系中仅测定突变型靶序列,或仅测定野生型靶序列。在另一些实施方案中,同一反应体系中使用多种(例如2种或更多种)第一正向引物(例如同一反应单元中具有多种第一正向引物),以及多种(例如2种或更多种)探针(例如同一反应单元中具有多种探针)。优选地,所述多种第一正向引物的扩增决定位点不同、且上游检测区的(b)部分不同;所述多种探针具有相互不同的序列和报告基团;任选地,所述上游检测区的(a)部分也可以不同。例如,所述方法可用于同时测定野生型和突变型靶序列,或是同时测定多种突变型靶序列。在使用多种F1引物及探针的一些实施方案中,不同的第一正向引物可以共用同一种反向引物。
在在一些实施方案中,第一正向引物长度可以是50-120个碱基。优选为60-90个碱基。在一些实施方案中,第一正向引物的靶序列结合区的Tm值可以是40℃-90℃,优选为50℃-80℃,GC含量为30%-80%。在一些实施方案中,第二正向引物长度可以是10-40个碱基,优选为14-30个碱基。在一些实施方案中,二正向引物的Tm值可以是35℃-85℃,优选为45℃-75℃,GC含量为30%-80%。在一些实施方案中,探针的长度为12-30个碱基。在进一步的实施方案中,探针的Tm值为55℃-75℃。在更进一步的实施方案中,探针的GC含量40%-80%。在一些实施方案中,反向引物的长度为15-30个碱基。在进一步的实施方案中,反向引物的Tm值为55℃-75℃。在更进一步的实施方案中,反向引物的GC含量40%-80%。
在一些具体实施方案中,F1和R引物进行预扩增的循环数为3-10个循环;更优选地,F1引物进行预扩增的循环数为5-8个循环。在一些具体实施方案中,本发明中F2引物以及探针P进行扩增和测定的循环数为35-50个循环,更优选的,F2引物以及探针P进行扩增和测定的循环数为40-45个循环。
在一些具体实施方案中,所述预扩增比继续扩增的退火温度高5℃-20℃,更优选为高10℃-15℃。
数字PCR扩增所适用的程序及常用反应条件(如变性温度、时间等)是本领域所熟知的。例如,在一些示例性的实施方案中,步骤(ii)和步骤(iii)中的具体扩增反应条件可以是:92℃-96℃预变性5-15分钟;92℃-95℃变性10-60秒,55℃-75℃退火及延伸30-90秒,共进行3-10个循环;92℃-95℃变性10-60秒,45℃-65℃退火及延伸30-90秒,共进行35-50个循环;94℃-98℃灭活5-15分钟;4℃-15℃终止反应。
本发明中所述的反应体系中引物和探针的浓度可以通过本领域常规实验来确定。在一些示例性的实施方案中,反应体系中F1引物的浓度为15nM-150nM,F2引物的浓度为150nM-1500nM,探针P的浓度为50nM-800nM,R引物的浓度为150nM-1800nM。在一些更优选的实施方案中,反应体系中F1引物的浓度为30nM-60nM,F2引物的浓度为300nM-600nM,探针P的浓度为150nM-400nM,引物R的浓度为300nM-900nM。
在一些实施方案中,提供靶序列的样品可以是生物样品,例如生物体液、活体组织、冷冻组织、石蜡切片等。在一些优选的实施方案中,所述样品是,例如外周血、尿液、灌洗液、脑脊液、粪便、唾液等。
在第六个方面,本发明提供一种基于基因多态性进行疾病用药指导的方法,其包括如下步骤:
(vi)用前述任一项实施方案所述的核酸序列变异检测方法检测来自受试者的样品;和
(vii)根据检测结果确定受试者的基因型,并根据针对该基因型的公知常识制定该受试者的用药方案。
在一些实施方案中,提供了本发明任一实施方案所述的引物或引物及探针组合物在制备用于诊断基因变异相关疾病的试剂盒中的用途。在又一些实施方案中,提供了本发明任一实施方案所述的引物或引物及探针组合物在制备用于检测核酸序列变异的试剂盒中的用途。
具体地,本发明还涉及如下各项:
项1.一种用于测定核酸序列变异的数字PCR引物对,其包括第一正向引物和反向引物,所述第一正向引物从5’端至3’端依次包含上游检测区和靶序列结合区,其中:
(1)靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点,所述扩增决定位点与靶序列上的变异检测位点互补,且扩增决定位点的上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区;及
(2)上游检测区从5’至3’端包含:与第二正向引物具有相同序列的(a)部分,以及与探针具有相同序列的(b)部分。
项2.如项1所述的引物对,其中所述第一正向引物和第二正向引物所对应的反向引物是相同的。
项3.如项1所述的引物对,所述反向引物与靶序列的互补区位于正向引物与靶序列的互补区的下游50-200bp区域内。
项4.如项1-3任一项所述的引物对,其中所述第一正向引物与第二正向引物的Tm值不同。
项5.如前述任一项所述的引物对,其中所述靶序列结合区中的错配区长度为1-15个碱基。
项6.如前述任一项所述的引物对,其中所述扩增决定位点与上游的错配区距离为0-20个碱基。
项7.如前述任一项所述的引物对,其中所述上游检测区不与靶序列相同或互补配对或在高严格条件下杂交。
项8.如前述任一项所述的引物对,其中所述探针上带有报告基团和淬灭基团。
项9.如项8所述的引物对,其中所述探针除报告基团和淬灭基团外不带有任何其他修饰。
项10.如前述任一项所述的引物对,其中所述核酸序列变异是碱基置换突变;优选地,所述核酸序列变异是点突变。
项11.一种利用数字PCR测定核酸序列变异的方法,包括如下步骤:
(i)提供包含靶核酸的待测定样品,对样品进行极限稀释并随机分配至770-10,000,000个反应单元中,随后对所有反应单元进行统一的热循环扩增;
(ii)在第一退火温度处,以第一正向引物和反向引物作为引物对进行靶核酸序列的预扩增;
(iii)在第二退火温度处,以第二正向引物、反向引物、和探针继续扩增步骤(ii)中所得的预扩增产物,其中所述探针带有报告基团;和
(iv)在步骤(iii)后检测反应体系中报告基团所发出的信号,根据信号对样品中的靶核酸进行定量;
其中,只有所述探针被水解后,所述报告基团才是可检测的;
且其中所述第一正向引物从5’端至3’端依次包含上游检测区和靶序列结合区,其中:
(1)靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点,所述扩增决定位点与靶序列上的变异检测位点互补,且扩增决定位点的上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区;及
(2)上游检测区从5’至3’端包含:与第二正向引物具有相同序列的(a)部分,以及与探针具有相同序列的(b)部分。
项12.如项11所述的方法,其中所述第一正向引物和第二正向引物所对应的反向引物是相同的。
项13.如项11所述的方法,所述反向引物与靶序列的互补区位于正向引物与靶序列的互补区的下游50-200bp区域内。
项14.如项11-13任一项所述的方法,其中所述靶序列结合区中的错配区长度为1-15个碱基。
项15.如项11-13任一项所述的方法,其中所述扩增决定位点与上游的错配区距离为0-20个碱基。
项16.如项11-13任一项所述的方法,其中所述上游检测区不与靶序列相同或互补配对或在高严格条件下杂交。
项17.如项11所述的方法,其中所述第一退火温度和第二退火温度是不同的。
项18.如项17所述的方法,其中所述第一正向引物与第二正向引物的Tm值不同。
项19.如项11-18任一项所述的方法,其中所述探针上带有报告基团和淬灭基团。
项20.如项19所述的方法,其中所述探针除报告基团和淬灭基团外不带有任何其他修饰。
项21.如项11所述的方法,其中所述第一正向引物和反向引物进行预扩增的循环数为3-10个循环,第二正向引物以及探针进行扩增和测定的循环数为35-50个循环。
项22.如项11-21任一项所述的方法,其中所述核酸序列变异是碱基置换突变;优选地,所述核酸序列变异是点突变。
项23.如项11-21任一项所述的方法,其中在同一反应体系中仅使用一种第一正向引物。
项24.如项11-21任一项所述的方法,其中在同一反应体系中使用多种第一正向引物,以及多种探针。
项25.一种数字PCR引物及探针组合物,其包含项1-10任一项所述的引物对。
项26.一种用于测定核酸序列变异的数字PCR试剂盒,其包含项1-10任一项所述的引物对或项25所述的引物及探针组合物。
项27.如项26所述的试剂盒,其进一步包含反应缓冲液、阴性对照、阴性对照和/或空白对照。
发明详述
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
如本文中所用,术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换地使用,并且是指核苷酸单体的单链和/或双链聚合物,包括(但不限于)通过核苷酸间磷酸二酯键连接或核苷酸间类似物连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。核酸中的核苷酸单体可称为“核苷酸残基”。核酸可以完全由脱氧核糖核苷酸构成、完全由核糖核苷酸构成或由其嵌合混合物构成,并且可以包括核苷酸类似物。核苷酸单体单元可以包含本文中所述的核苷酸中的任一个,包括(但不限于)核苷酸和/或核苷酸类似物。核酸的大小通常从几个核苷酸残基到几千个核苷酸残基不等。其中“寡核苷酸”通常指长度相对较短的核苷酸聚合物,例如1-80个。除非另外指出,否则每当呈现核酸序列时,都应了解,核苷酸从左到右是按5'到3'的顺序。非另行指出,否则“A”表示脱氧腺苷,“C”表示脱氧胞苷,“G”表示脱氧鸟苷,“T”表示脱氧胸苷,并且“U”表示脱氧尿苷。
根据本领域习惯用语,核酸的长度可表示为碱基、碱基对(缩写“bp”)、核苷酸/核苷酸残基(缩写为“nt”)或千碱基(“kb”)。在上下文允许的情况下,术语“碱基”、“核苷酸”、“核苷酸残基”可以描述单链或双链的多核苷酸。当该术语应用于双链分子时,其用于指整个长度,并且应理解为相当于术语“碱基对”。
术语“引物”表示这样的寡核苷酸:其与靶核酸中的序列杂交,且能够充当沿着核酸的互补链合成(在适合于这样的合成的条件下)的起始点。本文中使用的术语“探针”表示这样的寡核苷酸:其与靶核酸中的序列杂交,且通常被可检测地标记。探针可以具有修饰(诸如3’-端修饰和/或5’-端修饰,其使探针可以被检测到或是被核酸聚合酶水解等),所述修饰也可包括一个或多个生色团。
本文中使用的术语“靶序列”、“靶核酸”或“靶标”可互换使用且意指要扩增、检测或扩增并检测的核酸序列部分,其可在杂交、退火或扩增条件下与探针或引物进行退火或杂交。术语“杂交”表示两个核酸之间的碱基配对相互作用,其导致双链体的形成。不要求2个核酸在它们的全长上具有100%互补性才可实现杂交。
本文使用的术语“正向引物”是指与靶DNA的一条特定链退火的寡核苷酸,所述特定链通常指反义链。本文使用的术语“反向引物”是指与靶DNA的相反链退火的寡核苷酸,所述相反链通常指正义链。应理解,当正义链和反义链的指定发生互换时,对应的正向和反向引物命名也可随之互换。
本文所用的术语“上游”、“位于/在……上游”、“上游具有……”等,在描述核酸序列的语境下是表示在同一核酸序列上比指代区域更靠近5’端的部分,例如可以是紧邻指代区域,也可以与指代区域有一个或多个碱基的间隔。本文所用的术语“下游”、“位于/在……下游”、“下游具有……”等,在描述核酸序列的语境下是表示在同一核酸序列上比指代区域更靠近3’端的部分,例如可以是紧邻指代区域,也可以与指代区域有一个或多个碱基的间隔。应了解,除另有说明外,在描述的核酸为双链核酸时,“上游”和“下游”的表示方法通常以正义链的5’端和3’端为准。
本文所用的术语“靶序列结合区”、“上游检测区”、“扩增决定位点”、“错配区”、“(a)部分”和“(b)部分”是位于F1引物上的不同区段,其中扩增决定位点和错配区位于靶序列结合区内,(a)部分和(b)部分位于上游检测区内。应了解,所述靶序列结合区表示该区域用于与靶序列杂交或退火,而并不意指该区域必然与靶序列能实现100%碱基互补配对,且靶序列结合区内可以存在错配区。术语“变异检测位点”位于靶序列上,在本文中是指待检测的不同靶序列之间存在差异的区段,例如野生型和突变型之间具有序列差异的区段。变异检测位点的长度可以是一个或多个碱基对。常见地,所述变异可以是例如(与野生型相比的)点突变、缺失突变、插入突变、碱基倒置突变等等。
本文中术语“Taqman探针(TaqMan probe)”与“水解探针(hydrolysis probe)”可互换使用。Taqman探针是在Real-time PCR技术平台发展出的荧光检测技术,探针的5’端含有荧光报告基团,3’端含有荧光淬灭基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,当进行PCR扩增时,Taq DNA聚合酶的5’端到3’端的外切酶活性将探针酶切降解,使得报告基团和淬灭基团分离,发出荧光信号,从而达到荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。具体地,报告基团可利用FAM、FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5、Cy3等,淬灭基团可利用TAMRA、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、QXL、DDQI,但并不局限于此。此外,Taqman探针还衍生出其他修饰形式,例如Taqman-MGB探针是在3’端具有小沟结合分子(minor groove binder,MGB)的Taqman探针,提高了探针的Tm值,缩短探针长度,便于多突变位点的同时检测。
在本发明的上下文中,简称“F1”和“第一正向引物”可互换使用,“F2”和“第二正向引物”可互换使用,“R”和“反向引物”可互换使用,“P”和“探针”可互换使用。
本说明书所述的“严格条件”,可以为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”,如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、32℃的条件;此外,“中严格条件”,如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、42℃的条件;“高严格条件”,如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、50℃的条件。在这些条件下,预期温度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸,如DNA。虽然影响杂交的严格度的因素有多种,如温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等,但本领域技术人员可通过适当选择这些要素得到类似的严格度。
本文所用术语“突变丰度”是指突变型靶标基因的相对或绝对定量值,在检测中一般将“突变丰度”定义为突变型靶标基因分子数在总的DNA分子数中所占比例。
本文所用术语“样品”表示含有核酸或推测含有核酸的任何组合物。样品可来源于生物来源(“生物样品”),例如组织(例如活组织检查样品)、提取物或培养物和生物或生理流体等。例如,样品可包括皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪水、血细胞、器官和肿瘤。并且,样品还可包括从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品或经固定化的样品,例如福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)和从其分离的核酸分离物。
有益效果
本发明的引物、组合物和方法与现有技术相比,具有如下优势:
(1)靶核酸序列短:与本发明所述引物探针设计方法相比,TaqMan探针法以及ARMS法更加受限于靶核酸待测片段的序列。而本发明所述引物探针设计方法相较于常规的TaqMan探针法以及ARMS法需要的靶核酸待测片段长度更短,最短可短至40bp以下。这一优势可以体现在不同的检测场景中,例如在高度片段化的游离DNA检测中,由于DNA的片段化是随机的,更短的检测片段可以检出更多的DNA靶标,进而大大提高检测的灵敏度。
(2)对靶核酸序列要求较低:与上述优点类似,本发明所述引物探针设计,在对于复杂的靶核酸序列检测时,本发明所述引物探针的设计方法可以避开GC不平衡区域。同时,本发明也使得设计具体探针序列的难度相对于TaqMan探针法以及ARMS法也都更低。
(3)高灵敏度:本发明所述的引物、组合物及方法在复杂背景中检出靶核酸序列的最低灵敏度可达0.01%,更优选的,本发明所述试剂盒能稳定在复杂背景中检出靶核酸序列的灵敏度为0.05%,即可保证在>95%的检测中能够在20,000拷贝的总核酸背景中可稳定检出10拷贝的靶核酸序列,或在30,000拷贝的总核酸背景中可稳定检出15拷贝的靶核酸序列。本发明可以实现低浓度样品以及低突变丰度样品的稳定检测,以满足临床对肿瘤患者外周血循环游离DNA样品的监测,反映患者肿瘤当前的状态,指导靶向用药以及用于预后监测。
(4)高特异性:本发明所述的引物、组合物及方法可以良好地避免交叉反应,即在检测突变型靶核酸序列时,无野生型或其它相近或具有同源性的靶核酸交叉反应。尤其在同时检测野生型与突变型时,两者交叉反应小,更有利于稀有突变的检测。
(5)适用范围广:本发明可用于检测小于200bp的短片段靶核酸,且对PCR抑制物的耐受良好,可以适用于多种样品类型的核酸检测,包括福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)样品、新鲜组织样品、外周血样品、尿液样品、灌洗液样品、脑脊液样品、人工培养的细胞系样品、人工合成的质粒样品等。
(6)样品消耗少:本发明可实现在一个反应体系或一个反应单元中同时检测突变型与野生型靶核酸序列,并对两者进行绝对定量及突变丰度统计。在用于稀少样品时,如外周血循环肿瘤DNA样品的检测中尤其对现有技术具有显著优势。
(7)成本低:本发明所述引物及其反应体系组分无需经过昂贵的MGB修饰或LNA修饰,大大减少引物探针使用成本,同时还拥有更好的检测性能。
附图说明
图1为本发明所述的引物探针的一种实施方式示意图。其中,图1A为第一正向引物(F1)的结构图,从5’端至3’端依次包含上游检测区和靶序列结合区,其中靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点,所述扩增决定位点与靶序列上的变异检测位点互补,且扩增决定位点的上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区;上游检测区从5’至3’端包含:与第二正向引物具有相同序列的(a)部分,以及与探针具有相同序列的(b)部分。图1B为本发明所述试剂盒的反应原理,首先利用第一正向引物F1和反向引物R特异性地富集待检测的靶核酸序列,并新增一段与第一正向引物“上游检测区”互补的序列,供后续的第二正向引物F2及探针P进行配对识别。靶核酸模板富集后,利用退火温度的变化,使得第二正向引物F2及探针P识别预扩增产物上与第一正向引物“上游检测区”互补的序列,然后与反向引物R形成引物对并进行模板扩增,通过TaqMan水解探针原理释放荧光信号。
图2和图3显示了采用本发明引物(设计1个错配碱基)对BRAF基因点突变的检测结果。图2为阴性样品(仅含野生型基因)测量散点图,图3为理论稀释度为0.1%的阳性样品测量散点图。其中,划分出的左上象限为突变型(仅突变型阳性信号),右下象限为野生型(仅野生型阳性信号),右上象限为突变型+野生型(双阳性信号),左下象限为空白(双阴性)。在本发明上下文中所有涉及散点图之处,均适用上述象限划分方式。
图4显示了采用本发明引物体系(图4A)与Bio-Rad公司对比试剂盒(图4B)针对同一样品进行BRAF突变检测的结果对比。圈中的散点为野生型+突变型点,可以看出本发明对于右上和右下象限的准确划分具有明显优势。
图5显示了采用本发明引物(设计14个错配碱基)对BRAF基因点突变的检测结果。图5A为阴性样品测量散点图,图5B阳性样品测量散点图。
图6是使用EGFR基因L858R检测体系体系1对片段化的NCI-H1975细胞系DNA样本(理论突变丰度12%)的检测结果散点图。
图7显示了使用EGFR基因L858R检测体系体系1、体系2、体系3分别对片段化的NCI-H1975细胞系DNA样本(理论突变丰度12%)检测的数据分析结果。其中图7A为野生型靶核酸浓度定量结果,图7B为突变型靶核酸浓度定量结果,图7C为突变丰度(突变型浓度/突变型浓度+野生型浓度)定量结果。
图8显示了采用本发明引物和对比试剂针对EGFR基因19号外显子缺失突变的检测结果。图8A为对比试剂测量散点图,图8B为本发明引物测量散点图。
图9是尝试的另一种引物设计方式的结构示意图。
图10是利用结构图9所示的引物对理论突变丰度为65.8%的片段化Colo 205细胞系DNA样本检测结果,其中荧光定量PCR检测结果如图10A所示,数字PCR检测结果如图10B所示。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
实验设备及材料
设备/材料 | 厂家/型号 |
2X ddPCR Supermix for Probes | Bio-Rad,货号1863010 |
微滴发生卡 | Bio-Rad,货号1864008 |
ddPCR微滴发生油 | Bio-Rad,货号1863005 |
密封条 | Bio-Rad,货号1863009 |
微滴分析油 | Bio-Rad,货号1863004 |
半裙边96孔板 | Eppendorf,货号30128575 |
微滴发生仪 | Bio-Rad,货号1864002 |
封膜仪 | Bio-Rad,货号1814000 |
PCR热循环仪 | Bio-Rad,货号1851197 |
微滴分析仪 | Bio-Rad,货号1864003 |
Colo 205细胞系 | 科佰生物,货号CBP-60026 |
引物 | 由生工生物合成 |
探针 | 由生工生物合成 |
核酸片段化酶(KAPA Frag Kit) | Roche,货号7962495001 |
分析软件 | Bio-Rad,QuantaSoft数字PCR分析软件 |
实施例1
在本实施例中,选取一种常见的核酸变异为例对本发明的引物及检测体系进行了测试。具体地,采用了人类BRAF基因的V600E突变为例模拟临床样品来评估了本发明检测体系的性能。
大约8%的人类肿瘤中发现有BRAF基因突变的现象,BRAF的突变会驱动肿瘤的增殖、生长和分化,尤其在结直肠癌(5%~8%)、甲状腺癌(5%~20%)和黑色素瘤(40%~68%),在肺癌、肝癌及胰腺癌等也均发现有不同比例的BRAF突变现象。约有89%的突变发生在第15位外显子的激活区,大多数的是第1799氨基酸的碱基T突变为A导致BRAF中的缬氨酸被谷氨酸替代(V600E)。
对此类点突变的检测一般针对患者外周血中的循环肿瘤DNA(ctDNA)来进行,进而实现对肿瘤患者的早期筛查、用药指导、预后判断以及复发监测。但由于外周血样品背景复杂,ctDNA含量稀少,对于低丰度以及稀有序列的检测,荧光定量PCR法、分子杂交法、毛细管电泳以及二代测序均容易受到背景DNA的干扰,使得检测灵敏度及精确度都达不到精确定量的要求;而现有的数字PCR引物及方法在检测灵敏度、阈值划分等方面仍存在一定缺陷,且均需要对探针加以锁核酸或MGB等修饰,使得检测成本大幅提高。
有鉴于此,本实施例采用改进的引物体系对BRAF基因V600E突变进行了数字PCR定量检测,以测试本发明的使用效果。
1.样品准备:
使用经过数字PCR定量的片段化Colo 205细胞系DNA样品,含突变丰度为65.8%的BRAF基因V600E突变,模拟临床循环肿瘤DNA。
具体而言,用QIAGEN公司DNA Mini Kit按照该试剂盒的操作说明书对含有BRAF基因V600E突变的Colo 205细胞系进行核酸提取,得到BRAF基因V600E突变细胞系基因组DNA。使用KAPA Frag Kit对提取后的BRAF基因V600E突变细胞系DNA进行酶切打断,得到片段长度在120-130bp左右的片段化突变型DNA,模拟临床循环肿瘤DNA的片段大小。
同样准备来自于健康人的基因组DNA,经二代测序确定不含有BRAF基因V600E突变后,同样进行酶切打断,得到片段化野生型DNA,模拟临床游离DNA样品。
将已制备好的片段化突变型DNA与片段化野生型DNA按一定比例混合后,采用数字PCR对其进行定量后,利用片段化野生型DNA对突变型DNA进行稀释,得到理论突变丰度为5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%的系列稀释样品,其总DNA浓度均为20,000拷贝/μL。并使用同样浓度的片段化野生型DNA制备成阴性对照。阳性对照为片段化的Colo 205突变细胞系DNA样品,阴性对照为片段化的野生型基因组DNA样本,空白对照为无DNA的Tris-EDTA缓冲液。
2.反应体系制备
2.1引物及探针
引物及探针由生工生物工程股份有限公司合成制备而成。
其中,设计的引物及探针具体序列如下:
突变型F1引物的序列为SEQ ID NO:1,野生型F1引物序列为SEQ ID NO:2,突变型F2的序列为SEQ ID NO:3,野生型F2的序列为SEQ ID NO:4,突变型探针P的序列为SEQ IDNO:5,野生型探针P的序列为SEQ ID NO:6,反向引物R的序列为SEQ ID NO:7。由SEQ ID NO:5所示的突变型探针在5’端标记有FAM,3’端标记有BHQ1。由SEQ ID NO:6所示的野生型探针在5’端标记有HEX,3’端标记有BHQ1。其中,突变型F1引物(SEQ ID NO:1)全长62bp,野生型F1引物(SEQ ID NO:2)全长61bp,两者的3’端23个碱基为靶序列结合区,3’末端最后一个碱基为BRAF基因V600E突变位点,在3’端的第3个碱基位置引入了1个增强扩增阻滞的错配碱基。
表1
突变型和野生型F1引物5’端的16个碱基为上游检测区的(a)部分,其分别与对应F2引物(SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4)的碱基序列相同。在突变型F1引物5’端第18个碱基至第37个碱基序列为上游检测区的(b)部分,其序列与对应的突变型探针P(SEQ ID NO:5)的碱基序列相同。在野生型F1引物5’端第18个碱基至第36个碱基序列为上游检测区的(b)部分,其序列与对应的野生型探针P(SEQ ID NO:6)的碱基序列相同。因此在突变型F1引物以及野生型F1引物分别对靶核酸进行特异性扩增后,生成的扩增产物会被添加一段来自F1引物5’端的碱基序列及其互补序列,然后F2引物以及探针P才可以与对应的靶核酸模板配对结合并水解发出荧光信号。
2.2反应体系
按照如下浓度配制PCR反应混合液(以20μL体系为例)
表2
2.3反应单元制备
将如上表配制完成的PCR反应液取20μL加入到微滴发生卡的样品孔中,然后加入70μL微滴发生油至微滴发生卡的油孔中,最后使用密封条对微滴发生卡进行密封。
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中,开始微滴生成。大约2分钟后,微滴制备完成,取出卡槽,从最上排孔中小心的转移出约40μL的微滴悬浊液至96孔PCR板。
3.扩增读取
将96孔板进行封膜后,放置于PCR热循环仪中进行PCR扩增。所使用程序为:95℃预变性10分钟;94变性30秒,65℃退火延伸60秒,共进行5个循环;94℃变性30秒,55℃退火延伸60秒,共进行40个循环;98℃灭活10分钟;10℃终止反应。
待PCR扩增结束,将96孔板放置于微滴分析仪中选择FAM/HEX通道进行信号读取。
4.分析统计
使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析,得到BRAF基因V600E突变型的拷贝数及浓度,以及BRAF基因V600野生型的拷贝数和浓度。可以根据荧光信号的有无,判断阴性/阳性微滴所占比例,得到靶核酸突变型样品以及野生型样品浓度,进而计算出该样品中靶核酸序列的突变丰度。
[(突变型浓度)/(突变型浓度+野生型浓度)]*100%
例如:在待测样品中检出BRAF基因V600E突变型靶核酸浓度为50拷贝/μL,同时检出BRAF基因V600野生型靶核酸浓度为9950拷贝/μL,则该待测样品中BRAF基因V600E突变的丰度为:
[(50拷贝/μL)/(50拷贝/μL+9950拷贝/μL)]*100%=0.5%
使用本发明所述试剂盒对阴性对照品的检测结果如图2,使用本发明所述试剂盒对理论稀释度为0.1%的阳性样品的检测结果如图3。
使用本发明所述试剂盒,通过对阴性对照品进行21次重复检测,根据临床实验室标准化协会推荐的计算方法,即CLSI EP17-2文件所述方法,计算得到本发明中所述试剂盒的检测空白限为0.016%,即突变丰度大于0.016%的样品被判断为阳性。
使用本发明所述试剂盒,通过对低值样品(理论突变丰度为0.05%的稀释样品)进行21次重复检测,同样采用CLSI EP17-2文件所述方法,运用公式LoD=LoB+DSβ,计算得到本发明中所述试剂盒的最低检出限为0.038%。
使用本发明所述试剂盒,通过对突变丰度为0.1%、0.2%、0.5%进行21次重复检测,得到定量结果CV<20%的最低突变丰度为0.2%,即可视为在突变丰度低至0.2%时该检测方法的定量精密度和正确度可接受,因此本发明中所述试剂盒的定量限为0.2%。
上述“空白限”的定义为一定概率下(一般为95%)测量空白样本时可能得到的最高测量结果;上述“最低检出限”的定义为该检测方法可检测出的最低被测物浓度;上述“定量限”的定义为该检测方法能够得到可靠结果的被测物浓度,且在规定实验条件下,其精密度和正确度可接受。
使用本发明所述试剂盒,检测系列稀释样品(5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%),每个稀释度使用本发明中所述试剂盒进行3次重复检测,得到本发明中所述试剂盒的线性相关系数R2>0.99。
使用本发明所述试剂盒,通过对理论突变丰度0.2%的稀释样品进行21次相互独立的重复测试,得到本发明中所述试剂盒的测量精密度在理论突变丰度为0.2%的样品中,定量结果的CV值为16.22%,在理论突变丰度为0.5%的样品中,定量结果的CV值为13.02%,均小于20%。
使用本发明所述试剂盒,阴性对照品及空白对照品的检测结果阴性符合率为100%;对理论突变丰度低至0.05%的稀释样品检测结果阳性符合率为100%。
通过上述验证实验可知,本发明所述试剂盒的最低检出限可低至0.038%突变丰度,而现有的数字PCR试剂灵敏度一般在0.1%突变丰度以上,现有的荧光定量PCR试剂灵敏度一般只有1%突变丰度,说明本发明所述试剂盒灵敏度远高于同类或现有的基因突变检测试剂盒。
通过上述验证实验可知,本发明所述试剂盒的定量限可低至0.2%突变丰度,同时在5%-0.05%突变丰度的线性范围区间可保持R2>0.99。现有的基因突变检测试剂盒通常只能进行定性分析,而无法对特定突变的突变丰度进行定量分析,即使是同类的科研类产品,其定量限通常也高于1%突变丰度。因此说明本发明所述试剂盒的定量精密度和正确度远高于同类或现有的基因突变检测试剂盒。
实施例2
在本实施例中,使用Colo 205细胞系DNA样品(BRAF V600E突变)对比了同类厂商试剂盒的测试效果。
1.样品准备:与实施例1相同,不同之处仅在于使用了含突变丰度为65.8%的BRAF基因V600E突变的片段化Colo 205细胞系DNA样本,而没有进行样本的系列稀释及配制。
2.反应体系
本发明引物体系配制与实施例1相同。
对比试剂盒使用来自Bio-Rad公司的“PrimePCRTMddPCR Mutation Assay Kit:BRAF WT for p.V600E,and BRAF p.V600E”市售试剂盒(货号1863100)作为本发明对比试剂盒,使用流程按照其使用说明书进行,反应配制如表3所示。
表3
3.反应单元制备
将配制完成的PCR反应液取20μL加入到微滴发生卡的样品孔中,然后加入70μL微滴发生油至微滴发生卡的油孔中,最后使用密封条对微滴发生卡进行密封。
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中,开始微滴生成。大约2分钟后,微滴制备完成,取出卡槽,从最上排孔中小心的转移出约40μL的微滴悬浊液至96孔PCR板。
4.扩增读取
将96孔板进行封膜后,放置于PCR热循环仪中进行PCR扩增。本发明所述试剂盒所使用程序为:95℃预变性10分钟;94℃变性30秒,65℃退火延伸60秒,共进行5个循环;94℃变性30秒,55℃退火延伸60秒,共进行40个循环;98℃灭活10分钟;10℃终止反应。
Bio-Rad公司对比试剂盒所使用程序为:95℃预变性10分钟;94℃变性30秒,55℃退火延伸60秒,共进行40个循环;98℃灭活10分钟;10℃终止反应。
待PCR扩增结束,将96孔板放置于微滴分析仪中选择FAM/HEX通道进行信号读取。
5.分析统计
使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析,得到BRAF基因V600E突变型的拷贝数及浓度,以及BRAF基因V600野生型的拷贝数和浓度,并计算出突变丰度。
使用本发明所述试剂盒对片段化细胞系样品的检测结果如图4A,使用Bio-Rad公司对比试剂盒对相同样品的检测结果如图4B。图示均为2-D散点图,其左下角的象限表示“双阴性”的微滴,即不含野生型靶核酸模板也不含突变型靶核酸模板;其左上角的象限表示“突变阳性”的微滴,即不含野生型靶核酸模板只含有突变型靶核酸模板的微滴;其右下角的象限表示“野生阳性”的微滴,即只含有野生型靶核酸模板而不含突变型靶核酸模板的微滴;其右上角的象限表示“双阳性”的微滴,即这些微滴中既含有野生型靶核酸模板也含有突变型靶核酸模板。由于野生型靶核酸模板与突变型靶核酸模板之间仅有一个碱基的差异,因此“双阳性”的微滴中野生型信号与突变型信号容易交叉干扰,从而造成阈值划分的不准确。而从图4A与图4B的对比中可以看出,本发明所述试剂盒在“双阳性”的微滴检测时,更不容易造成交叉干扰,从而使得阈值划分更精确,对极低浓度的靶核酸检测的准确度更高。
使用本发明所述试剂盒对片段化Colo 205细胞系样品检测并定量的突变丰度为65.8%,使用Bio-Rad公司对比试剂盒对相同样品检测并定量的突变丰度为65.7%,两者无显著差异。
使用本发明所述试剂盒无需对探针进行特殊修饰,因此检测成本大大降低,其中引物探针的成本大约只需要Bio-Rad公司对比试剂盒中引物探针成本的百分之一。
实施例3
在本实施例中,测试了错配区更长的F1引物的检测效果。其具体步骤如下:
1.样品准备:与实施例1相同
2.反应体系制备
2.1引物及探针
引物及探针由生工生物工程股份有限公司合成制备而成。
其中,设计的引物具体序列如下:
表4
其中,使用的引物探针分别为:突变型F1(SEQ ID NO:8)、野生型F1(SEQ ID NO:9)、突变型F2(SEQ ID NO:3)、野生型F2(SEQ ID NO:4)、突变型探针P(SEQ ID NO:5)、野生型探针(SEQ ID NO:6)以及反向引物R(SEQ ID NO:7)。突变型F1引物全长78bp,野生型F1引物全长77bp,两者的3’端39个碱基为靶核酸结合区,3’末端为BRAF基因V600E突变位点,在3’端的第8个碱基至第21个碱基的位置引入了14个错配碱基以增强阻滞作用。在F1引物的5’端添加的序列(包括F2序列及探针P序列)与第一种实施方案相同。
2.2反应体系:PCR反应体系与实施例1相同。
2.3反应单元制备
将如上表配制完成的PCR反应液取20μL加入到微滴发生卡的样品孔中,然后加入70μL微滴发生油至微滴发生卡的油孔中,最后使用密封条对微滴发生卡进行密封。
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中,开始微滴生成。大约2分钟后,微滴制备完成,取出卡槽,从最上排孔中小心的转移出约40μL的微滴悬浊液至96孔PCR板。
3.扩增读取
将96孔板进行封膜后,放置于PCR热循环仪中进行PCR扩增。所使用程序为:95℃预变性10分钟;94℃变性30秒,65℃退火延伸60秒,共进行5个循环;94℃变性30秒,55℃退火延伸60秒,共进行40个循环;98℃灭活10分钟;10℃终止反应。
待PCR扩增结束,将96孔板放置于微滴分析仪中选择FAM/HEX通道进行信号读取。
4.分析统计
使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析,得到BRAF基因V600E突变型的拷贝数及浓度,以及BRAF基因V600野生型的拷贝数和浓度,并计算出突变丰度。
使用本发明所述试剂盒对阴性对照品的检测结果如图5A,使用本发明所述试剂盒对理论稀释度为65.8%的片段化Colo 205细胞系DNA样品的检测结果如图5B。如图所示,使用本实施例所述的引物对进行BRAF基因V600E突变检测与实施例1及实施例2中所述的引物对检测效果基本一致。
实施例4
为了进一步验证本发明引物及方法的效果,本实施例针对另一种基因变异(人EGFR基因L858R突变)进行了检测。EFGR是非小细胞肺癌的常见驱动基因,其突变主要发生在18/19/20/21外显子,而45%以上的EGFR驱动突变都是由21外显子编码的第858个氨基酸从亮氨酸(L)变成了精氨酸(R)引起的,上述突变引起EGFR下游通路的持续激活,导致肿瘤的发生。同时,在靶向治疗的过程中,由EGFR基因L858R突变引起的肿瘤被发现对第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)类药物敏感,因此对于EGFR基因L858R突变的定量检测以及持续跟踪对于靶向治疗尤为重要。
本实施例设置3个不同的引物扩增体系,对本发明引物的扩增子长度及模板检出能力进行了探索。
1.样品制备:
按照如上文所述的方法,使用经过数字PCR定量的片段化NCI-H1975细胞系DNA样品,含突变丰度为75%的EGFR基因L858R突变,模拟临床循环肿瘤DNA。
同时准备来自于健康人的基因组DNA,经二代测序确定不含有EGFR基因L858R突变后,同样进行酶切打断,得到片段化野生型DNA,模拟临床游离DNA样品。
将已制备好的片段化突变型DNA与片段化野生型DNA按一定比例混合后,采用数字PCR对其进行定量后,利用片段化野生型DNA对突变型DNA进行稀释,得到理论突变丰度为12%的稀释样品,其总DNA浓度为20,000拷贝/μL。
2.反应体系制备
2.1引物及探针
本实施例设置了3个平行的扩增检测体系,其各自引物及探针如下
体系1:引物及探针具体序列如表5所示
表5
/>
其中,两条不同的F1引物分别用于扩增突变型与野生型靶核酸序列。突变型F1(SEQ ID NO:10)在靠近3’端的第3个至第9个碱基处引入了7个错配碱基以增强阻滞作用,提高引物的特异性。野生型F1(SEQ ID NO:11)在靠近3’端的第7个至第13个碱基处引入了7个错配碱基以增强阻滞作用,提高引物的特异性。同时,两条F2引物与两条探针P不与F1引物配对结合,也不与任何靶标序列配对结合,仅在F1引物对靶核酸序列进行特异性的预扩增后,F2引物与探针P才能与预扩增后的产物进行配对结合,从而开始水解探针并将报告基团与淬灭基团相互分离,释放可检测的信号。
体系2:使用来自Bio-Rad公司的PrimePCRTMddPCR Mutation Assay Kit:EGFR WTfor p.L858R,and EGFR p.L858R市售试剂盒(货号1863104)。
体系3:与体系1基本相同,其区别仅在于体系3所用的反向引物R(SEQ ID NO:17)不同,因此与体系1得到的扩增子长度不同。
表6
由于血浆中的游离DNA以及循环肿瘤DNA是高度片段化的,其中游离DNA的平均长度约为160bp,循环肿瘤DNA的平均长度约为130bp,因此检测体系的扩增子长度越短,对模板的检出率就越高。各反应体系中扩增子长度以及理论的模板检出率如下表:
表7:
其中每个反应体系分别对理论突变丰度为12%的稀释样本进行4次重复检测。
2.2反应体系:体系1、3与实施例1中所述反应体系相同;体系2与实施例2中所述Bio-Rad对比试剂盒的反应体系相同,不同之处仅在于使用了PrimePCRTMddPCR MutationAssay Kit:EGFR WT for p.L858R,and EGFR p.L858R试剂盒。
2.3反应单元制备
将配制完成的PCR反应液取20μL加入到微滴发生卡的样本孔中,然后加入70μL微滴发生油至微滴发生卡的油孔中,最后使用密封条对微滴发生卡进行密封。
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中,开始微滴生成。大约2分钟后,微滴制备完成,取出卡槽,从最上排孔中小心的转移出约40μL的微滴悬浊液至96孔PCR板。
3.扩增读取
将96孔板进行封膜后,放置于PCR热循环仪中进行PCR扩增。体系1、3所使用程序为:95℃预变性10分钟;94℃变性30秒,65℃退火延伸60秒,共进行5个循环;94℃变性30秒,52℃退火延伸60秒,共进行40个循环;98℃灭活10分钟;10℃终止反应。
体系2所使用程序为:95℃预变性10分钟;94℃变性30秒,55℃退火延伸60秒,共进行40个循环;98℃灭活10分钟;10℃终止反应。
待PCR扩增结束,将96孔板放置于微滴分析仪中选择FAM/HEX通道进行信号读取。
4.分析统计
使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析,得到EGFR基因L858R突变型的拷贝数及浓度,以及EGFR基因L858野生型的拷贝数和浓度,并计算出突变丰度。
使用本发明所述体系1对片段化的NCI-H1975细胞系DNA样本(理论突变丰度12%)的检测结果散点图如图6。
使用本发明所述体系1、体系2、体系3分别对片段化的NCI-H1975细胞系DNA样本(理论突变丰度12%)检测的结果数据统计如下表:
表8
使用本发明所述体系1、体系2、体系3分别对片段化的NCI-H1975细胞系DNA样本(理论突变丰度12%)检测的数据分析结果如图7。其中图7A为野生型靶核酸浓度定量结果,体系1、体系2、体系3分别进行配对t检验,可得知p值分别为0.004(体系1vs体系2)、0.020(体系2vs体系3),均具有显著差异。其中图7B为突变型靶核酸浓度定量结果,体系1、体系2、体系3分别进行配对t检验,可得知p值分别为0.006(体系1vs体系2)、0.019(体系2vs体系3),均具有显著差异。其中图7C为突变丰度(突变型浓度/突变型浓度+野生型浓度)定量结果,体系1、体系2、体系3分别进行配对t检验,可得知p值分别为0.074(体系1vs体系2)、0.886(体系2vs体系3),均不具有显著差异(ns)。
从图7中可以看出,不同的扩增子长度对于定量检测的结果有显著差异,在对片段化的DNA模板定量检测时,更短的扩增子长度可以检出更多的靶核酸模板,从而在结果中得出更高的浓度及拷贝数,但同时保证了突变丰度的一致性。使用本发明所述的引物探针设计方法,可以有效减少靶核酸待测片段长度,提高对片段化靶核酸模板的检出率,因此对于稀有突变的检测,尤其是在外周血或其它体液中进行肿瘤突变靶标的检测时,本发明所述引物及试剂盒拥有更好的检测性能。
实施例5
在本实施例中,使用NCI-H1650细胞系DNA样品针对人EGFR基因19号外显子突变(以亚型EGFR p.E746_750del(c.2235_2249del15)为例),测试了本发明引物体系对于缺失突变的检测效果。
1.样品制备:
使用QIAGEN公司DNA Mini Kit按照该试剂盒的操作说明书对含有EGFR基因19外显子突变缺失的NCI-H1650细胞系进行核酸提取,得到EGFR基因19外显子突变缺失细胞系基因组DNA。
2.反应体系
2.1引物及探针
本发明引物及探针由生工生物工程股份有限公司合成制备而成。
其中,设计的引物及探针具体序列如下:
表9
其中突变型F1引物(SEQ ID NO:18)针对EGFR19外显子常见的突变缺失类型(EGFRp.E746_750del(c.2235_2249del15)),错配碱基设置在3’端第12位(如下划线表示);野生型F1引物(SEQ ID NO:19)错配碱基设置在3’端第17位(如下划线表示)。突变型/野生型F1引物5’端的18/20个碱基分别与对应F2引物(SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21)的碱基序列相同。在突变型F1引物5’端第20个碱基至第39个碱基序列与对应的突变型探针P(SEQ ID NO:22)的碱基序列相同。在野生型F1引物5’端第23个碱基至第43个碱基序列与对应的野生型探针P(SEQ ID NO:23)的碱基序列相同。
2.2反应体系
本发明引物反应体系与实施例1相同。
2.3对比试剂
设置平行对比实验,使用来自Bio-Rad公司的PrimePCR ddPCR Mutation AssayKit:EGFR WT for p.E746_A750del,and EGFR p.E746_A750del市售试剂盒(货号1863105)作为对比试剂,其反应体系按照产品说明书进行配制。
3.反应单元制备
将配制完成的PCR反应液取20μL加入到微滴发生卡的样本孔中,然后加入70μL微滴发生油至微滴发生卡的油孔中,最后使用密封条对微滴发生卡进行密封。
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中,开始微滴生成。大约2分钟后,微滴制备完成,取出卡槽,从最上排孔中小心的转移出约40μL的微滴悬浊液至96孔PCR板。
4.扩增读取
本发明方法使用程序为将96孔板进行封膜后,放置于PCR热循环仪中进行PCR扩增。所使用程序为:95℃预变性10分钟;94℃变性30秒,65℃退火延伸60秒,共进行5个循环;94℃变性30秒,52℃退火延伸60秒,共进行40个循环;98℃灭活10分钟;10℃终止反应。
Bio-Rad公司对比试剂盒所使用程序为:95℃预变性10分钟;94℃变性30秒,55℃退火延伸60秒,共进行40个循环;98℃灭活10分钟;10℃终止反应。
待PCR扩增结束,将96孔板放置于微滴分析仪中选择FAM/HEX通道进行信号读取。
5.分析统计和结果
使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析,得到EGFR基因19外显子缺失突变型的拷贝数及浓度,以及EGFR基因19外显子野生型的拷贝数和浓度,并计算出突变丰度。
分析统计:
使用Bio-Rad公司对比试剂盒对NCI-H1650细胞系样本的检测结果如图8A,使用本发明试剂盒对同一样本的检测结果如图8B。两者阈值划分明确,检测性能接近。
使用本发明试剂盒及Bio-Rad公司对比试剂盒对同一NCI-H1650细胞系样本检测并定量,两者定量的突变丰度均值分别为68.82%和68.20%,无显著差异(P=0.287)。
实验结果如图所示。图8A为对比试剂盒的检测结果,图8B为本发明试剂盒的检测结果。如灰圈所示,本发明试剂盒的双阳性荧光信号(右上象限)与单阳的突变型信号(左上象限)更易区分,在同时检测野生型与突变型时交叉反应更小,双阳性微滴的荧光信号强度受到的干扰更小,更有利于检测稀有突变的靶标。
实施例6
本发明在研发早期设计并试用过多种实验方案,以上实施例主要呈现了筛选出的最优实施方式及对比。本实施例举其中一例早期的实施方案,其具体如下:
1.样品准备
使用经过数字PCR定量的片段化Colo 205细胞系DNA样本,理论突变丰度为65.8%的BRAF基因V600E突变,模拟临床循环肿瘤DNA。
同时准备来自于健康人的基因组DNA,经二代测序确定不含有BRAF基因V600E突变后,同样进行酶切打断,得到片段化野生型DNA,模拟临床游离DNA样本。
2.反应体系
2.1引物及探针
所使用的引物探针设计方法如图9所示,其中两条不同的正向引物F分别用于扩增突变型与野生型靶核酸序列,其3’末端的靶核酸序列突变位点或SNP位点不足以阻滞扩增反应,因此在靠近3’端增添1-15个错配碱基以加强阻滞作用,提高引物的特异性。在正向引物F的5’端添加一段不与模板配对的序列,与探针P的序列完全互补配对,因此两条不同的探针P,分别与对应的突变型与野生型正向引物F的5’端相互配对。在正向引物F的下游50-200bp处设计一条反向引物R,在反向引物R的扩增延伸过程中,理论上推测可以水解与正向引物F的5’端互补配对的探针P,并释放荧光信号。
所使用的引物探针序列如下表:
表10
2.2反应体系:PCR反应体系与实施例1相同。
2.3反应单元制备
将配制完成的PCR反应液取20μL加入到微滴发生卡的样本孔中,然后加入70μL微滴发生油至微滴发生卡的油孔中,最后使用密封条对微滴发生卡进行密封。
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中,开始微滴生成。大约2分钟后,微滴制备完成,取出卡槽,从最上排孔中小心的转移出约40μL的微滴悬浊液至96孔PCR板。
3.扩增读取
将96孔板进行封膜后,放置于PCR热循环仪中进行PCR扩增。所使用程序为:95℃预变性10分钟;94℃变性30秒,55℃退火延伸60秒,共进行40个循环;98℃灭活10分钟;10℃终止反应。
待PCR扩增结束,将96孔板放置于微滴分析仪中选择FAM/HEX通道进行信号读取。
4.荧光定量PCR验证
同时,使用荧光定量PCR法对该设计方法进行验证,所配制的反应体系如下表:
表11
所使用的荧光定量PCR仪器为Applied Biosystems 7500实时荧光定量PCR系统,使用的PCR程序为:95℃预变性10分钟;94℃变性30秒,55℃退火延伸60秒,共进行40个循环;98℃灭活10分钟;10℃终止反应。
待PCR程序结束后,使用ABI-7500Software v2.3分析软件对荧光定量PCR的反应结果进行分析处理,得到该反应体系中突变型及野生型靶核酸的扩增曲线。
5.分析统计
使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析,得到BRAF基因V600E突变型的拷贝数及浓度,以及BRAF基因V600野生型的拷贝数和浓度,并计算出突变丰度。
对理论突变丰度为65.8%的片段化Colo 205细胞系DNA样本的荧光定量PCR检测结果如图10A。对理论突变丰度为65.8%的片段化Colo 205细胞系DNA样本的数字PCR检测结果如图10B。
两者均反映出同一问题,即无法检测到阳性信号。而观察后可知由于探针直接与引物互补配对,造成即使在没有靶核酸模板存在的情况下,探针也会释放荧光信号,导致所有检测结果没有阴性的背景信号,即无法区分阳性与阴性样本。
发明人进行了进一步的方案改进,使探针不直接与任何引物互补配对,即可避免在没有靶核酸模板的情况下探针依然释放信号的情况。从而优化形成了本发明所述的引物探针设计方法及反应体系。
应该理解到,本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可在不悖离本发明主旨的情况下变化。还应理解本文所述的实施例仅仅是出于描述具体实施方案的目的,而非意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅由所附的权利要求限定。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 迈克生物股份有限公司
<120> 用于核酸序列变异检测的引物、组合物及方法
<130> MB20181041
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accgacagtg gtacgcaacg attcctatgc tcgctgtcgg gtgattttgg tctagctact 60
ga 62
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgtcacgtc ctgaagcagt cgtttcgcag atcgctcggg tgattttggt ctagctacgg 60
t 61
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accgacagtg gtacgc 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgtcacgtc ctgaag 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgattccta tgctcgctgt 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtcgtttcg cagatcgct 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctcaattct taccatccac aa 22
<210> 8
<211> 78
<212> DNA
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<400> 8
accgacagtg gtacgcaacg attcctatgc tcgctgtcgc ctcacagtaa aaataggaat 60
catcaacatc tctacaga 78
<210> 9
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcgtcacgtc ctgaagcagt cgtttcgcag atcgctcgcc tcacagtaaa aataggtatc 60
cataatactc ctacagt 77
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taccgacagt ggtacgcaac gattcctatg ctcgctgtcg gtcaagatca cagattttgg 60
actagtccg 69
<210> 11
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacagtcgtg cctccatcat cgcacctacc gcagactcgc atgtcaagat cacagattac 60
atgtctgggc t 71
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
accgacagtg gtacgc 16
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cacagtcgtg cctccatca 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acgattccta tgctcgctgt 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
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<400> 15
cgcacctacc gcagactcg 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atggtattct ttctcttccg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctccttactt tgcctccttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cttgctctcc gctcatctcc taaccgttcc gcctgttcct ggtcgctatc caaacatctc 60
cg 62
<210> 19
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccattcgtcc tactctcatc atctctcgtc tcagcctcca tccacgctat catggaatta 60
agagaagca 69
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cttgctctcc gctcatct 18
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<211> 20
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<400> 21
ccattcgtcc tactctcatc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
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ctaaccgttc cgcctgttcc 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctctcgtctc agcctccatc c 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caaagcagaa actcacatcg 20
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agccactgct cgcacagatt ttggtctagc tactga 36
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cccgtctcgc aggaacgatt ttggtctagc tacggt 36
<210> 27
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgcgagcagt ggc 13
<210> 28
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcctgcgaga cgg 13
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cctcaattct taccatcc 18
Claims (5)
1.一种数字PCR引物及探针组合物,其包含引物对,所述引物对包括第一正向引物、第二正向引物和反向引物,
所述第一正向引物为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列所示的核苷酸序列;
所述第二正向引物为如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4序列所示的核苷酸序列;
所述探针P为如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列所示的核苷酸序列;
所述反向引物为如SEQ ID NO.7序列所示的核苷酸序列;
或者,
所述第一正向引物为如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9序列所示的核苷酸序列;
所述第二正向引物为如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4序列所示的核苷酸序列;
所述探针P为如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列所示的核苷酸序列;
所述反向引物为如SEQ ID NO.7序列所示的核苷酸序列;
或者,
所述第一正向引物为如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11序列所示的核苷酸序列;
所述第二正向引物为如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13序列所示的核苷酸序列;
所述探针P为如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15序列所示的核苷酸序列;
所述反向引物为如SEQ ID NO.16序列所示的核苷酸序列;
或者,
所述第一正向引物为如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19序列所示的核苷酸序列;
所述第二正向引物为如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21序列所示的核苷酸序列;
所述探针P为如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23序列所示的核苷酸序列;
所述反向引物为如SEQ ID NO.24序列所示的核苷酸序列。
2.一种用于测定核酸序列变异的数字PCR试剂盒,其包含权利要求1所述的引物及探针组合物。
3.如权利要求2所述的数字PCR试剂盒,其进一步包含反应缓冲液、阴性对照、阴性对照和/或空白对照。
4.一种利用数字PCR测定核酸序列变异的方法,所述方法为非疾病诊断与治疗方法,包括如下步骤:
(i)提供包含靶核酸的待测定样品,对样品进行极限稀释并随机分配至770-10,000,000个反应单元中,随后对所有反应单元进行统一的热循环扩增;
(ii)在第一退火温度处,以第一正向引物和反向引物作为引物对进行靶核酸序列的预扩增;
(iii)在第二退火温度处,以第二正向引物、反向引物、和探针继续扩增步骤(ii)中所得的预扩增产物,其中所述探针带有报告基团;和
(iv)在步骤(iii)后检测反应体系中报告基团所发出的信号,根据信号对样品中的靶核酸进行定量;
其中,只有所述探针被水解后,所述报告基团才是可检测的;
其中,所述第一正向引物为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列所示的核苷酸序列;
所述第二正向引物为如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4序列所示的核苷酸序列;
所述探针P为如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列所示的核苷酸序列;
所述反向引物为如SEQ ID NO.7序列所示的核苷酸序列;
或者,
所述第一正向引物为如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9序列所示的核苷酸序列;
所述第二正向引物为如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4序列所示的核苷酸序列;
所述探针P为如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列所示的核苷酸序列;
所述反向引物为如SEQ ID NO.7序列所示的核苷酸序列;
或者,
所述第一正向引物为如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11序列所示的核苷酸序列;
所述第二正向引物为如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13序列所示的核苷酸序列;
所述探针P为如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15序列所示的核苷酸序列;
所述反向引物为如SEQ ID NO.16序列所示的核苷酸序列;
或者,
所述第一正向引物为如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19序列所示的核苷酸序列;
所述第二正向引物为如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21序列所示的核苷酸序列;
所述探针P为如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23序列所示的核苷酸序列;
所述反向引物为如SEQ ID NO.24序列所示的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述第一正向引物和反向引物进行预扩增的循环数为3-10个循环,第二正向引物以及探针进行扩增和测定的循环数为35-50个循环。
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