CN103866002A - 牦牛肉嫩度候选基因检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

牦牛肉嫩度候选基因检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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CN103866002A CN201410024220.8A CN201410024220A CN103866002A CN 103866002 A CN103866002 A CN 103866002A CN 201410024220 A CN201410024220 A CN 201410024220A CN 103866002 A CN103866002 A CN 103866002A
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Abstract

本发明涉及动物生物技术领域中的牦牛分子标记辅助育种技术，具体涉及到牦牛肉嫩度候选基因检测试剂盒。一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测试剂盒，其特征是包括有PCR反应液，CAPN3*B和CAPN3*C的DNA标准样；SSCP检测试剂，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0。本发明的优点是本发明对牦牛的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。

Description

牦牛肉嫩度候选基因检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及动物生物技术领域中的牦牛分子标记辅助育种技术，具体涉及到牦牛肉嫩度候选基因等位基因检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
钙蛋白酶（Calpain,CAPN）是一类存在于脊椎动物细胞质中的钙依赖性半胱氨酸中性蛋白水解酶，与钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin,CAST）和钙蛋白酶激活蛋白（CalpainActivator）构成依赖于钙离子的蛋白水解酶系统，对动物宰后肌肉成熟嫩化有重要作用。哺乳动物已发现16种钙蛋白酶，其中CAPN1、2、4、5、7、10、13、14、15和16在动物组织中广泛表达，而CAPN3、6、8、9、11和12为组织特异性钙蛋白酶。
普通牛CAPN3基因位于第10号染色体，瘤牛及普通牛CAPN3基因SNPs与肉嫩度相关性存在一定差异，草原红牛及日本和牛（天一岗山黑牛）CAPN3基因与大理石花纹及嫩度等肉质性状相关。
牦牛是青藏高原及其周边高寒牧区的特产家畜，也是当地牧民重要的生产和生活资源。目前CAPN3已成为肉嫩度候选基因而被国内外广泛研究，并在分子遗传育种标记方面加以应用。牦牛肉嫩度相关基因分子选种技术主要利用PCR-SSCP技术对待测牦牛的CAPN3基因第2内含子进行多态性分析，然后根据检测结果确定携带不同等位基因的牦牛个体肉嫩度强弱，从而判断是否可以留作种用。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测试剂盒。以解决快速、敏感性高、成本低用于牦牛肉嫩度候选基因分子选种技术。
本发明的又一目的在于提供一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测方法。
通过PCR-SSCP对不同年龄和性别的牦牛个体CAPN3基因第2内含子进行遗传多态性分析，并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合肉质嫩度相关的生产数据，确定嫩度较强的等位基因，为改善牦牛肉嫩度提供指导。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测引物，其主要特点在于包括有：
引物序列为：
CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'；
CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'。
一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测试剂盒，其主要特点在于包括有PCR反应液，CAPN3*B和CAPN3*C的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；
所述的PCR反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'和CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，，ddH2O补充体积至20μL。
所述的CAPN3*B的DNA标准样的核苷酸序列为：
Figure BDA0000458356310000021
Figure BDA0000458356310000031
所述的CAPN3*C的DNA标准样的核苷酸序列为：
所述的牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其步骤为：
（1）待检牦牛基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min进行扩增；
（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和CAPN3*B或CAPN3*C的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
（3）步骤（2）中检测到的带型与CAPN3*B或CAPN3*C标准样带型一致的样品为携带控制牦牛肉嫩度等位基因的个体。
一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测方法，其主要特点在于检测步骤为：
（1）样品采集：牦牛颈静脉采血10ml，ACD抗凝，-20℃冻存；
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
（3）聚合酶链式反应：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物CAPN3-F和CAPN3-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；
引物序列为：
CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'；
CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'；
（4）PCR产物的SSCP检测：
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，250V电压条件下，10℃电泳18h，银染法显色后拍照；
（5）结果判断：
对牦牛CAPN3基因第2内含子的PCR-SSCP检测，有3个等位基因，控制牦牛肉嫩度的等位基因为CAPN3*B的核苷酸和CAPN3*C核苷酸序列；对牦牛肉嫩度无影响的为CAPN3*A核苷酸序列；CAPN3*B的核苷酸序列为：cagagtctccaggacactcacacaccccactcagcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaatggctacccactccagcgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtg；
CAPN3*C核苷酸序列为：cagagtctccaggacactcacacaccccactcagcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaatggctacccactccaacgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtg；
对牦牛肉嫩度无影响的CAPN3*A核苷酸序列为：cagagtctccaggacactcacacaccccactcAgcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaacggctacccactccaacgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtg。
本发明的有益效果：反应灵敏、特异性强、易操作，适用于各级畜牧兽医教学科研单位，兽用生物制品厂以及各大、中型牦牛养殖企业的肉质嫩度的改良。
本发明利用PCR-SSCP对不同年龄和性别的牦牛个体CAPN3基因第2内含子进行遗传多态性分析，并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合肉质嫩度相关的生产数据，确定嫩度较强的等位基因，为改善牦牛肉嫩度提供指导。本发明通过对试验牦牛CAPN3基因第2内含子的SSCP分析，发现了3个（A、B、C）等位基因。其中，A等位基因对牦牛肉嫩度影响不显著。
本发明对牦牛肉嫩度的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。
附图说明：
图1是牦牛CAPN3基因第2内含子的PCR-SSCP检测凝胶图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面以甘南牦牛肉嫩度分子选种技术的建立为例，对本发明的内容进行详细的说明。
实施例1：一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测引物，其主要特点在于包括有：
引物序列为：
CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'；
CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'。
实施例2：一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测试剂盒，其主要特点在于包括有PCR反应液，CAPN3*B和CAPN3*C的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；
所述的PCR反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'和CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH2O补充体积至20μL。
所述的CAPN3*B的DNA标准样的核苷酸序列为：
Figure BDA0000458356310000061
所述的CAPN3*C的DNA标准样的核苷酸序列为：
实施例3：所述的牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其步骤为：
（1）待检牦牛基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min进行扩增；
（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和CAPN3*B或CAPN3*C的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
（3）步骤（2）中检测到的带型与CAPN3*B或CAPN3*C标准样带型一致的样品为携带控制牦牛肉嫩度等位基因的个体。
实施例4：一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测方法，其主要特点在于检测步骤为：
（1）样品采集：牦牛颈静脉采血10ml,ACD抗凝，-20℃冻存；
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
（3）聚合酶链式反应：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物CAPN3-F和CAPN3-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；
引物序列为：
CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'；
CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'。
（4）PCR产物的SSCP检测：
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，250V电压条件下，10℃电泳18h，银染法显色后拍照；
（5）结果判断：
对牦牛CAPN3基因第2内含子的PCR-SSCP检测，有3个等位基因，控制牦牛肉嫩度的等位基因为CAPN3*B的核苷酸和CAPN3*C核苷酸序列；对牦牛肉嫩度无影响的为CAPN3*A核苷酸序列；CAPN3*B的核苷酸序列为：cagagtctccaggacactcacacaccccactcagcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaatggctacccactccagcgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtg；
CAPN3*C核苷酸序列为：cagagtctccaggacactcacacaccccactcagcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaatggctacccactccaacgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtg；
对牦牛肉嫩度无影响的CAPN3*A核苷酸序列为：cagagtctccaggacactcacacaccccactcAgcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaacggctacccactccaacgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtg。
实验例1：
试验材料
牦牛选自甘肃省甘南藏族自治州夏河县（300头），颈静脉采血10ml，ACD抗凝，-20℃冻存。用酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA，溶于TE，4℃保存。在甘南藏族自治州夏河县屠宰场测定甘南牦牛胴体性状及肉质性状，包括胴体重、眼肌面积、嫩度、失水率、熟肉率，所测数据与血样记录一致并记录屠宰后牦牛的年龄和性别。
试验方法
1.引物设计和PCR扩增
根据GenBank中普通牛CAPN3基因DNA序列（登录号:AC000167.1），用Primer5.0及Oligo6.0软件设计多态性检测引物，引物序列如下：
CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'；
CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'。
最佳反应体系及条件：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物CAPN3-F和CAPN3-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；
引物序列为：
CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'；
CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'。
得到316bp的特异性扩增产物，可直接进行SSCP检测。
2.SSCP检测
取步骤1中2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液[包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)]，98℃变性10min，立即冰浴10min。12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（Arc:Bis=37.5:1）250V电压条件下，10℃电泳18h，银染法显色后拍照。其中，对PCR扩增产物进行SSCP检测，结果在所检测的300头牦牛中检测到3个等位基因，分别命名为CAPN3*A、*B、*C。
甘南牦牛的CAPN3*B的DNA标准样的核苷酸序列为：
Figure BDA0000458356310000091
CAPN3*C的DNA标准样的核苷酸序列为：
Figure BDA0000458356310000092
3.不同等位基因的克隆测序
经SSCP检测后，利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收不同等位基因的PCR产物。回收后的片段用载体连接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α菌株，菌落PCR鉴定后送华大生物公司进行测序。
4.甘南牦牛CAPN3基因第2内含子等位基因频率及与肉质相关性分析
表1CAPN3基因第2内含子等位基因频率
Figure BDA0000458356310000102
表2牦牛CAPN3基因第2内含子各等位基因与胴体及肉质性状关联性
Figure BDA0000458356310000103
Figure BDA0000458356310000111
注：(P<0.01)表示差异极显著；(P<0.05)表示差异显著。
5.结果分析
运用等位基因“存在/缺失”的方法分析CAPN3基因第2内含子各等位基因对不同年龄段的甘南牦牛胴体及肉质性状影响（表2）。方差分析结果表明，等位基因A对3岁阉牛胴体重（P=0.014）及肉嫩度（P=0.012）有显著影响，对5岁母牦牛熟肉率（P=0.001）有极显著影响，携带等位基因A的个体胴体重平均值较未携带者低38.79kg，剪切力值较未携带者高1.07kg·f，熟肉率较未携带者高0.05，其它年龄段牦牛剪切力值及熟肉率变化也有此趋势。等位基因C对5岁阉牛熟肉率有显著影响（P=0.020），携带等位基因C的个体熟肉率平均值较未携带者低0.03。因此认为淘汰携带等位基因A的个体可改善甘南牦牛后代群体的胴体重及肌肉嫩度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>  甘肃农业大学
<120>  牦牛肉嫩度候选基因检测试剂盒及其检测方法
<130>
<160>  3
<170>  PatentIn version3.3
<210>  1
<211>  316
<212>  DNA
<213>  控制牦牛肉嫩度的等位基因为CAPN3*B的核苷酸序列
<400>  1
cagagtctcc aggacactca cacaccccac tcagcaagac aaaagccctg tttctagcag    60
gacccacctt ccttagaggg cttcccttgt gactcagtgg ttaagagttt gcctgccagt    120
gcaggagatg ggagtttgat ccctgggtca ggaagagtcc ctggagaagg aaatggctac    180
ccactccagc gttcttgcct ggtaaaatcc catggacaga ggagcctggc aggctaagtc    240
catggggtca cgaggagtca gacatgactt agagactaaa caacaacctt ccttagaagg    300
cagctctgaa attgtg                                                    316
<210>  2
<211>  316
<212>  DNA
<213>  控制牦牛肉嫩度的等位基因为CAPN3*C核苷酸序列
<400>  2
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gacccacctt ccttagaggg cttcccttgt gactcagtgg ttaagagttt gcctgccagt    120
gcaggagatg ggagtttgat ccctgggtca ggaagagtcc ctggagaagg aaatggctac    180
ccactccaac gttcttgcct ggtaaaatcc catggacaga ggagcctggc aggctaagtc    240
catggggtca cgaggagtca gacatgactt agagactaaa caacaacctt ccttagaagg    300
cagctctgaa attgtg                                                    316
<210>  3
<211>  316
<212>  DNA
<213>  对牦牛肉嫩度无影响的CAPN3*A核苷酸序列
<400>  3
cagagtctcc aggacactca cacaccccac tcagcaagac aaaagccctg tttctagcag    60
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cagctctgaa attgtg                                                    316

Claims (4)

1.一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测引物，其特征在于包括有：
引物序列为：
CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'；
CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'。
2.一种牦牛肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测试剂盒，其特征在于包括有PCR反应液，CAPN3*B或CAPN3*C的DNA标准样；，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；
所述的PCR反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'和CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH2O补充体积至20μL。
3.如权利要求2所述的牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤为：
（1）待检牦牛基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min进行扩增；
（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和CAPN3*B或CAPN3*C的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
（3）步骤（2）中检测到的带型与CAPN3*B或CAPN3*C标准样带型一致的样品为携带控制牦牛肉嫩度等位基因的个体。
4.一种牦牛肉嫩度候选基因PCR-SSCP检测方法，其特征在于检测步骤为：
（1）样品采集：牦牛颈静脉采血10ml,ACD抗凝，-20℃冻存；
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
（3）聚合酶链式反应：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物CAPN3-F和CAPN3-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；
引物序列为：
CAPN3-F:5'CAGAGTCTCCAGGACACTCACACA3'；
CAPN3-R:5'CCTTAGAAGGCAGCTCTGAAATTGTG3'。
（4）PCR产物的SSCP检测：
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，250V电压条件下，10℃电泳18h，银染法显色后拍照；
（5）结果判断：
对牦牛CAPN3基因第2内含子的PCR-SSCP检测，有3个等位基因，控制牦牛肉嫩度的等位基因为CAPN3*B的核苷酸和CAPN3*C核苷酸序列；对牦牛肉嫩度无影响的为CAPN3*A核苷酸序列。
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