CN109652560A - 与牦牛乳品质相关的遗传标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供与牦牛乳品质相关的遗传标记，其位于ACSL1基因第五内含子上，存在三个优势基因型GH、HH和PP，当牦牛个体的基因型为GH和HH时，它的乳脂率高；当牦牛个体的基因型为PP时，它的乳蛋白率和总固体物质含量高。本发明根据牦牛Gene Bank基因组序列设计一对引物，对牦牛基因组DNA进行PCR扩增后进行测序检测，通过基因序列比对确定SNPs突变位点，通过分析比对峰图确定牦牛ACSL1突变位点的基因型和等位基因，并分析牦牛ACSL1不同基因型个体对乳品质性状的影响，从而预测该牦牛乳脂率的高低，其优点是反应灵敏、特异性强、操作简单、精确度高，可进行快速检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及与牦牛乳品质相关的遗传标记及其应用。
背景技术
牦牛是以中国青藏高原为中心，及其毗邻高山、亚高山高寒地区的特有珍稀牛种之一，属于草食性反刍家畜。牦牛能适应高寒气候，是生活在世界上海拔最高处的(出人类外)哺乳动物，分布于中国青藏高原海拔3000米以上的地区。牦牛的藏语叫雅客，世界通称为“yak”，即藏语译音。牦牛为当地牧民提供肉、乳和毛绒等高原特色畜产品，是当地重要的生产和生活资源。牦牛乳营养丰富，风味独特，是加工高原特色乳产品的主要原料乳。牦牛乳中的乳脂率、乳蛋白率和总固体物质含量分别为5.45％-7.22％、4.86％-5.40％、16.91％-17.40％，均高于荷斯坦牛乳。
乳脂是乳的重要组成部分，在乳中的平均含量为3％-5％。乳脂肪中的98％-99％是甘油三酯，其组成主要是甘油和长链脂肪酸。ACSL1基因作为脂肪酸代谢中的关键酶，能够利用长链脂肪酸、三磷酸腺苷和辅酶A作为底物，生成长链脂酰辅酶A脂。只有经过这种酯化反应的脂肪酸才能够进行各种脂类代谢，如脂肪酸的β氧化、去饱和、延伸以及甘油酯、胆固醇和磷脂的生成。研究表明，ACSL1基因在脂肪组织中高丰度表达的酰基辅酶A合成酶，参与脂肪酸的摄入和甘油三酯的合成，说明其对乳品质性状有一定的影响。另外，ACSL1基因能够对细胞内的脂肪酸进行合成或降解反应，而且ACSL1基因也是影响牛肉骨骼肌脂肪酸组成最重要的位置和功能候选基因。
牦牛乳的主要特征是高乳脂率，但由于牦牛选育程度低，生产性能不高，近年来对其乳品质性状的遗传机制研究较少。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了与牦牛乳品质相关的遗传标记及其应用。
本发明提供与牦牛乳品质相关的遗传标记，其位于ACSL1基因第五内含子上，存在三个优势基因型GH、HH和PP，当牦牛个体的基因型为GH和HH时，它的乳脂率高；当牦牛个体的基因型为PP时，它的乳蛋白率和总固体物质含量高；
所述基因型GH，在ACSL1基因第五内含子g.24927处为A/G；
所述基因型HH，在ACSL1基因第五内含子g.24927处为G/G；
所述基因型PP，在ACSL1基因第五内含子g.25018处为G/G。
本发明提供用于检测权利要求1所述的遗传标记的引物对，所述引物对为：
ACSL1-5N-UP：5′-TGACTTCTAGTTGGATATCAGTG-3′，
ACSL1-5N-DN：5′-TACAGATCAGGCCACGACAG-3′。
本发明提供用于检测牦牛乳品质的试剂盒，所述试剂盒构造能够：
a、由核酸样本确定ACSL1基因第五内含子中位置g.24927处和g.25018处的多态性位点；
b、由步骤a的结果预测所述牦牛乳品质的高和低。
作为优选，所述试剂盒构造能够：
a、由核酸样本确定ACSL1基因第五内含子中位置g.24927处为A/A、A/G或GG；或者确定ACSL1基因第五内含子中位置g.25018处为G/G、G/A或A/A的多态性位点；
b、由步骤a的结果预测所述牦牛乳品质具有高乳脂率或高乳蛋白率和总固体物质含量。
作为优选，所述试剂盒还包括用于扩增ACSL1基因第五内含子区域的引物对，所述引物对为：
ACSL1-5N-UP：5′-TGACTTCTAGTTGGATATCAGTG-3′，
ACSL1-5N-DN：5′-TACAGATCAGGCCACGACAG-3′。
本发明提供上述遗传标记在鉴定牦牛乳品质中的应用，所述应用包括以下步骤：
(1)提取待测牦牛的基因组DNA；
(2)以待测牦牛的基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行鉴定，当基因型为GH和HH时，牦牛的乳脂率高；当基因型为PP时，牦牛的乳蛋白率和总固体物质含量高；
所述基因型GH，在ACSL1基因第五内含子g.24927处为A/G；
所述基因型HH，在ACSL1基因第五内含子g.24927处为G/G；
所述基因型PP，在ACSL1基因第五内含子g.25018处为G/G。
作为优选，步骤(3)中，将所述PCR扩增产物直接测序，通过序列比对及峰图判定基因型，根据结果对待测样本的牦牛乳品质进行判断。
本发明提供上述遗传标记在选留高乳脂率、高乳蛋白率和高总固体物质含量的牦牛中的应用。
本发明的有益效果为：本发明根据牦牛Gene Bank(NW_005395281)基因组序列设计一对引物，对牦牛基因组DNA进行PCR扩增后进行测序检测，通过基因序列比对确定SNPs突变位点，通过分析比对峰图确定牦牛ACSL1突变位点的基因型和等位基因，并分析牦牛ACSL1不同基因型个体对乳品质性状的影响，从而预测该牦牛乳脂率的高低，其优点是反应灵敏、特异性强、操作简单、精确度高，可进行快速检测。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为牦牛ACSL1基因一对引物PCR产物电泳图。
图2为本发明中牦牛ACSL1基因上部分第五内含子区第一个SNPs突变位点的序列比对基因分型图；g.24927 A>G。
图3为本发明中牦牛ACSL1基因上部分第五内含子区第二个SNPs突变位点的序列比对基因分型图。g.25018 G>A。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。下述以甘南牦牛ACSL1基因分型及乳脂率预测技术的建立为例，对本发明内容进行详细的说明。
实施例1
设计影响牦牛乳品质的基因ACSL1的引物，具体为：
ACSL1-5N-UP：5′-TGACTTCTAGTTGGATATCAGTG-3′，
ACSL1-5N-DN：5′-TACAGATCAGGCCACGACAG-3′。
引物由奥科鼎盛生物公司合成。
实施例2
应用实施例1设计的引物检测影响牦牛乳品质性状基因的方法：
1)样品采集：牦牛颈静脉采血10ml，ACD抗凝，-70℃冻存；
2)基因组DNA提取：用苯酚-氯仿法从冻存血样中提取基因组DNA；
3)聚合酶链式反应：
PCR反应体系：总体积20μL，其中DNA模板(浓度为<50ng/μl)0.8μL，上、下游引物(浓度为0.2-0.3μM)各0.8μL，TaKaRa Premix Taq聚合酶10μL，灭菌超纯水7.6μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min；
引物序列为：
ACSL1-5N-UP：5′-TGACTTCTAGTTGGATATCAGTG-3′，
ACSL1-5N-DN：5′-TACAGATCAGGCCACGACAG-3′。
4)PCR产物测序：
将扩增后的PCR产物送至生物公司测序，测序结果用Clone Manager软件进行比对，判定基因型。
5)结果判断：
通过对牦牛ACSL1不同基因型个体与乳品质性状进行相关性分析，发现牦牛乳品质性状与ACSL1基因变异之间具有相关性。
实施例3
应用实施例：
一、检测牦牛群体：
甘南牦牛母牛颈静脉采集血样10ml，血样ACD(酸性柠檬酸葡萄糖)抗凝；同时测定对应采集血样母牦牛的乳蛋白率、乳脂率、乳糖率、总固体物质百分含量、无脂固体物质百分含量，记录其产犊时间、年龄和胎次。
二、实验方法：
1.引物设计和PCR扩增：
引物序列如下：
ACSL1-5N-UP：5′-TGACTTCTAGTTGGATATCAGTG-3′，
ACSL1-5N-DN：5′-TACAGATCAGGCCACGACAG-3′。
最佳反应体系及反应条件：
PCR反应体系：总体积20μL，其中DNA模板(浓度为<50ng/μL)0.8μL，上、下游引物(浓度为0.2-0.3μM)各0.8μL，TaKaRa Premix Taq聚合酶10μL，灭菌超纯水7.6μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
反应结束后，取2个PCR反应液(5μL)，用1％琼脂糖凝胶电泳，检测是否扩增到PCR产物。电泳结果见附图(图1)。
2.基因测序：
将扩增出的PCR产物送至生物公司测序。测定结果通过Clone Manager软件进行序列比对并进行基因分型。测序结果表明，存在2个突变位点，分别是g.24927处a突变为g和g.25018处g突变为a。对于第一个突变位点，存在GG、GH和HH三种基因型；对于第二个突变位点，存在PP、OP和OO三种基因型。
各基因突变及基因型见附图(图2，图3)。
等位基因G的核苷酸序列为：
其中划线部分基因为A/G。
基因型GG，在ACSL1基因g.24927处为A/A；基因型GH，在ACSL1基因g.24927处为A/G；基因型HH，在ACSL1基因g.24927处为G/G。
等位基因P的核苷酸序列为：
其中划线部分基因为G/A。
基因型PP，在ACSL1基因g.25018处为G/G；基因型OP，在ACSL1基因g.25018处为G/A；基因型OO，在ACSL1基因g.25018处为A/A。
3.牦牛ACSL1基因5N(第五内含子)区不同基因型个体与乳品质性状的相关性分析：
本发明运用统计学的方法，分析了甘南牦牛ACSL1基因第5内含子区域基因突变的不同基因型个体与乳品质性状的相关性(表1、表2)。结果表明：甘南牦牛ACSL1基因第五内含子区域GH、HH型个体的乳脂率显著高于GG基因型个体(P<0.05)；PP基因型牦牛个体乳蛋白率、总固体物质含量均显著高于OO、OP基因型个体(P<0.05)。选留GH和HH基因型个体能提高牦牛乳脂率，选留PP基因型个体能显著提高牦牛后代乳蛋白率和总固体物质含量，改善牦牛的乳品质。表1、表2即显示牦牛ACSL1基因5N区基因型与乳品质性状相关性分析(5N的部分序列见序列表)。
表1甘南牦牛ACSL1基因5N-1区基因型与乳品质性状关联性分析
表2甘南牦牛ACSL1基因5N-2区基因型与乳品质性状关联性分析
其中，(p<0.01)表示差异极显著；(p<0.05)表示差异显著。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 甘肃农业大学
<120> 与牦牛乳品质相关的遗传标记及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 536
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgacttctag ttggatatca gtgtccctat ttttaattag tggtcaatca tacacataat 60
ttaaaagtgt gattagggtt taaaactgta tactgggcag caactcactg aaccctgagt 120
ggaagtgaaa gtgttagtta ctcagtcgtg ttcgactctt tgtgacccca tggactgtag 180
cccgccaggg ttctctgtgc gtagggattc tccaggcaag aatactggaa tgggttgcca 240
tttcctactc aggtgagccc agagcccacc catctaattt ccacttaatt ctaggcacac 300
tcatttccta tgctcactca agctgtttaa taggaaaata acataaatcg ttcattcaaa 360
aaataatagg tattaaggtg gtcgtggaga taccttcatg cagtaacatc agaatgagcc 420
ctgggtatta acagaattct ccttgagatg ccacacctca gaattgaatc tgtcgttttt 480
aaccctcatg gccactggat ggggttcctg gagcttctgt cgtggcctga tctgta 536
<210> 2
<211> 536
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgacttctag ttggatatca gtgtccctat ttttaattag tggtcaatca tacacataat 60
ttaaaagtgt gattagggtt taaaactgta tactgggcag caactcactg agccctgagt 120
ggaagtgaaa gtgttagtta ctcagtcgtg ttcgactctt tgtgacccca tggactgtag 180
cccgccaggg ttctctgtgc gtggggattc tccaggcaag aatactggaa tgggttgcca 240
tttcctactc aggtgagccc agagcccacc catctaattt ccacttaatt ctaggcacac 300
tcatttccta tgctcactca agctgtttaa taggaaaata acataaatcg ttcattcaaa 360
aaataatagg tattaaggtg gtcgtggaga taccttcatg cagtaacatc agaatgagcc 420
ctgggtatta acagaattct ccttgagatg ccacacctca gaattgaatc tgtcgttttt 480
aaccctcatg gccactggat ggggttcctg gagcttctgt cgtggcctga tctgta 536
Claims (8)
1.与牦牛乳品质相关的遗传标记，其特征在于：其位于ACSL1基因第五内含子上，存在三个优势基因型GH、HH和PP，当牦牛个体的基因型为GH和HH时，它的乳脂率高；
当牦牛个体的基因型为PP时，它的乳蛋白率和总固体物质含量高；
所述基因型GH，在ACSL1基因第五内含子g.24927处为A/G；
所述基因型HH，在ACSL1基因第五内含子g.24927处为G/G；
所述基因型PP，在ACSL1基因第五内含子g.25018处为G/G。
2.用于检测权利要求1所述的遗传标记的引物对，其特征在于：所述引物对为：
ACSL1-5N-UP：5′-TGACTTCTAGTTGGATATCAGTG-3′，
ACSL1-5N-DN：5′-TACAGATCAGGCCACGACAG-3′。
3.用于检测牦牛乳品质的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒构造能够：
a、由核酸样本确定ACSL1基因第五内含子中位置g.24927处和g.25018处的多态性位点；
b、由步骤a的结果预测所述牦牛乳品质的高和低。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒构造能够：
a、由核酸样本确定ACSL1基因第五内含子中位置g.24927处为A/A、A/G或G/G；或者确定ACSL1基因第五内含子中位置g.25018处为G/G、G/A或A/A的多态性位点；
b、由步骤a的结果预测所述牦牛乳品质具有高乳脂率或高乳蛋白率和总固体物质含量。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增ACSL1基因第五内含子区域的引物对，所述引物对为：
ACSL1-5N-UP：5′-TGACTTCTAGTTGGATATCAGTG-3′，
ACSL1-5N-DN：5′-TACAGATCAGGCCACGACAG-3′。
6.权利要求1所述的遗传标记在鉴定牦牛乳品质中的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：
(1)提取待测牦牛的基因组DNA；
(2)以待测牦牛的基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行鉴定，当基因型为GH和HH时，牦牛的乳脂率高；当基因型为PP时，牦牛的乳蛋白率和总固体物质含量高；
所述基因型GH，在ACSL1基因第五内含子g.24927处为A/G；
所述基因型HH，在ACSL1基因第五内含子g.24927处为G/G；
所述基因型PP，在ACSL1基因第五内含子g.25018处为G/G。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤(3)中，将所述PCR扩增产物直接测序，通过序列比对及峰图判定基因型，根据结果对待测样本的牦牛乳品质进行判断。
8.权利要求1所述的遗传标记在选留高乳脂率、高乳蛋白率和高总固体物质含量的牦牛中的应用。
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| CN109652560B (zh) | 2022-08-16 |
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