CN113416787A - 一种检测斑马鱼Acsl1a基因突变的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测斑马鱼ACSL1a基因突变的方法，包括提取斑马鱼基因组DNA，引物扩增、Hpy188I内切酶、琼脂糖凝胶电泳分析步骤。本发明方法可以高效鉴别斑马鱼Acsl1a第7外显子TCTGA基因序列是否缺失，通过酶切条带的数量与片段大小分辨斑马鱼Acsl1a第7外显子TCTGA基因为野生型、缺失突变体或是杂合型个体；本发明方法简单、快速、对仪器设备的依赖度较低，极大地降低了鉴定成本，且能快速、准确地鉴定出杂合型样本，具有极大的应用、推广价值。

Description

一种检测斑马鱼Acsl1a基因突变的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测斑马鱼Acsl1a基因突变的方法。
背景技术
长链脂酰CoA合成酶1(long-chain acyl-CoA synthetase1，ACSL1)能够催化长链脂肪酸生成相应的脂酰CoA，参与机体多种脂肪酸合成、代谢活动，是脂肪酸β氧化的关键酶。国家斑马鱼资源中心(China Zebrafish Resource Center,CZRC)设计并培育斑马鱼Acsl1a基因(Gene ID:555308)第7外显子TCTGA序列缺失突变体品系，编号为ZKO332a。该品系斑马鱼第1号染色体Acsl1a基因第7外显子TCTGA序列片段缺失，导致编码区出现移码突变，不能合成正确的ACSL1蛋白，生物学功能丧失。因此ZKO332a品系斑马鱼是研究动物及人类脂类代谢疾病理想的生物模型，是生物医学、分子生物学、鱼类学等学科常用的实验对象。在众多斑马鱼个体中，需要准确鉴别出Acsl1a基因第7外显子TCTGA序列缺失突变体品系，以便进一步进行实验研究。
目前最常用的鉴定基因片段序列插入、缺失的方法是Sanger测序或基于测序的荧光信号定量检测技术，以上技术需要依赖昂贵的仪器设备和试剂，鉴定成本较高(200元/样本，按照10元/反应，20个克隆子/样本计算，不包含PCR扩增和基因克隆产生的费用)。另外，在检测杂合型样本时，需要对该样本的两套染色体(拟定是二倍体生物)的待检测基因区段分别进行检测，在具体的实验方法上主要是对待检基因片段的PCR扩增产物进行体外克隆，随机选取若干克隆子进行测序，该方法成本高、操作复杂、试验周期长，且出现假阴性的概率较高。
因此，提供一种能快速、高效且成本低的鉴别斑马鱼Acsl1a第7外显子 TCTGA基因为野生型、缺失突变体或是杂合型个体的方法具有非常重要的意义和广泛的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种检测斑马鱼Acsl1a基因突变的方法，包括如下步骤：
(1)提取斑马鱼基因组DNA；
(2)利用引物P1和引物P2对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增；所述引物P1为：5’-accgtggatggcttaagggtt-3’，引物P2为： 5’-gtgtcttgtggtttgctttgcca-3’；
(3)利用Hpy188I内切酶对步骤(2)的PCR扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析酶切条带。
进一步地，上述检测Acsl1a基因突变是检测Acsl1a第7外显子TCTGA 基因序列是否缺失；步骤(4)所述酶切条带包含大小为471bp的条带，则存在Acsl1a基因突变。
进一步地，步骤(1)所述提取方法为酚-氯仿抽提法、高盐沉淀法、离心柱法、磁珠法；优选为酚-氯仿抽提法。
更进一步地，上述酚-氯仿抽提法包括如下步骤：将斑马鱼的尾鳍组织进行组织裂解和蛋白酶消化后，加入Tris平衡酚和氯仿混匀，离心，上清液加入异丙醇混匀后-20℃静置，离心弃液后风干。
进一步地，步骤(2)所述PCR扩增反应体系为：灭菌的去离子水26.5 μL；Buffer3.5μL，dNTP 3.0μL，引物P1和引物P2各0.5μL，DNA 1μL， rTaq 0.1μL；
进一步地，步骤(3)所述酶切反应体系为：Hpy188I 10μL，PCR产物1 μL，CutSmartBuffer 5μL，灭菌去离子水加至50μL。
进一步地，步骤(3)所述酶切的参数为：35～40℃孵育4～6h，60～70℃灭活10～30min。
更进一步地，上述酶切参数为：37℃孵育5h，65℃灭活20min。
本发明还提供了上述的方法鉴别斑马鱼Acsl1a基因突变体的应用。
本发明术语的解释：
本发明“Buffer”是指：PCR扩增反应中的缓冲液体系。
“dNTP”是指：脱氧核糖核苷酸三磷酸；“rTAq”指rTaq酶，是一种具有热稳定性的DNA聚合酶。“Hpy188I”是指Hpy188I限制性内切酶；“CutSmart Buffer”是指CutSmartTM缓冲液体系。
实验结果表明，本发明方法可以高效鉴别斑马鱼Acsl1a第7外显子 TCTGA基因序列是否缺失，通过酶切条带的数量与片段大小分辨斑马鱼 Acsl1a第7外显子TCTGA基因为野生型、缺失突变体或是杂合型个体。本发明通过结合PCR扩增技术和体外酶切的方法，不需要测序过程，实验简单、快速、对仪器设备的依赖度较低，极大地降低了鉴定成本(0.5元/样本)，且同样能快速、准确地鉴定出杂合型样本，具有极大的应用、推广价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为斑马鱼Acsl1a第7外显子TCTGA基因为野生型、缺失突变体或是杂合型个体的酶切条带。
具体实施方式
野生型AB系斑马鱼采购自山东一溪月生物科技有限公司(山东省潍坊市)；缺失突变体杂合型斑马鱼亲本(AB系斑马鱼)采购自国家斑马鱼中心 (湖北省武汉市)；突变体纯合型斑马鱼(AB系斑马鱼)及突变体杂合型子代(AB系斑马鱼)由本课题组自己繁殖获得(学科组名称是：中国科学院西北高原生物研究所高原鱼类适应性进化与功能基因组学学科组)。
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明方法鉴别斑马鱼Acsl1a基因的基因型个体
1、利用酚-氯仿法提取待鉴别的斑马鱼基因组DNA：
①剪取约3mm×3mm大小的新鲜尾鳍组织置于1.5mL的EP管内，并加入250μL组织裂解液(裂解液配方：5M NaCl 2.05mL，0.5M EDTA 1mL， Tris-HCl(pH＝8.0)0.2mL，10％SDS10mL，灭菌的去离子水定容至100mL) 和2μL蛋白酶K，56℃水浴消化8h；②加入Tris平衡酚(pH＝8.0)125μL，氯仿125μL，反复颠倒混匀15min，室温下12000r/min离心10min；③吸取上清液200μL至新的无菌1.5mLμL EP管内，加入800μL冰浴异丙醇，颠倒混匀后置于-20℃静置2h；④4℃12000r/min离心15min，弃液后自然晾干；⑤加入灭菌的去离子水30μL，得到纯净的DNA，并于-20℃保存。
2、利用引物P1和引物P2扩增提取的DNA，引物P1、引物P2如表1 所示，PCR反应体系如表2所示。
表1 PCR使用引物
引物 序列
P1 5’-accgtggatggcttaagggtt-3’
P2 5’-gtgtcttgtggtttgctttgcca-3’
表2 PCR反应体系
Figure RE-GDA0003209074000000031
Figure RE-GDA0003209074000000041
PCR扩增参数：预变性94℃，5min，1循环；变性94℃，30s，退火 61℃，30s，延伸72℃，60s，35循环；72℃，10min，1循环，4℃保存。
3、利用Hpy188I内切酶对PCR扩增产物进行酶切：
酶切反应体系：Hpy188I 10μL，PCR产物1μL，CutSmart Buffer 5μL，灭菌去离子水加至50μL；
酶切反应参数：孵育37℃，5h；灭活65℃20min；4℃保存。
4、对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析：
若得到257bp和210bp的酶切条带，则待鉴别的斑马鱼Acsl1α基因基因型为纯合野生型，若只得到471bp的酶切单一条带，则待鉴别的斑马鱼 Acsla基因基因型为纯合突变型，若同时得到471bp、257bp和210bp的酶切多条带，则待鉴别的斑马鱼Acsla基因基因型为杂合型(图1)。
综上，本发明提供了一种检测斑马鱼Acsl1a基因突变的方法，本发明方法可以高效鉴别斑马鱼Acsl1a第7外显子TCTGA基因序列是否缺失，通过酶切条带的数量与片段大小分辨斑马鱼Acsl1a第7外显子TCTGA基因为野生型、缺失突变体或是杂合型个体。本发明通过结合PCR扩增技术和体外酶切的方法，不需要测序过程，实验简单、快速、对仪器设备的依赖度较低，极大地降低了鉴定成本，且能快速、准确地鉴定出杂合型样本，具有极大的应用、推广价值。

Claims (10)

1.一种检测斑马鱼Acsl1a基因突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取斑马鱼基因组DNA；
(2)利用引物P1和引物P2对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增；所述引物P1为：5’-accgtggatggcttaagggtt-3’，引物P2为：5’-gtgtcttgtggtttgctttgcca-3’；
(3)利用Hpy188I内切酶对步骤(2)的PCR扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析酶切条带。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测Acsl1a基因突变是检测Acsl1a第7外显子TCTGA基因序列是否缺失；步骤(4)所述酶切条带包含大小为471bp的条带，则存在Acsl1a基因突变。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述提取方法为酚-氯仿抽提法、高盐沉淀法、离心柱法、磁珠法；优选为酚-氯仿抽提法。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酚-氯仿抽提法包括如下步骤：将斑马鱼的尾鳍组织进行组织裂解和蛋白酶消化后，加入Tris平衡酚和氯仿混匀，离心，上清液加入异丙醇混匀后-20℃静置，离心弃液后风干。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增体系为：灭菌的去离子水26.5μL；Buffer 3.5μL，dNTP 3.0μL，引物P1和引物P2各0.5μL，DNA 1μL，rTaq 0.1μL。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增参数为：预变性94℃，5min，1循环；变性94℃，30s，退火61℃，30s，延伸72℃，60s，35循环；72℃，10min，1循环。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述酶切反应体系为：Hpy188I10μL，PCR产物1μL，CutSmart Buffer 5μL，加灭菌去离子水至50μL。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述酶切的参数为：35～40℃孵育4～6h，60～70℃灭活10～30min。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶切参数为：37℃孵育5h，65℃灭活20min。
10.权利要求1～9任一项所述的方法鉴别斑马鱼Acsl1a基因突变体的应用。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103497994A (zh) * 2013-09-09 2014-01-08 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 一种猪背膘厚性状的分子标记方法
CN104928321A (zh) * 2015-02-12 2015-09-23 中国科学院西北高原生物研究所 一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法
CN108192980A (zh) * 2017-12-28 2018-06-22 新疆农业大学 含acsl1基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒
CN109652560A (zh) * 2018-11-30 2019-04-19 甘肃农业大学 与牦牛乳品质相关的遗传标记及其应用
CN109714962A (zh) * 2016-07-11 2019-05-03 耶路撒冷希伯来大学的益生研究开发有限公司 用于在体外培养细胞的系统和方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103497994A (zh) * 2013-09-09 2014-01-08 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 一种猪背膘厚性状的分子标记方法
CN104928321A (zh) * 2015-02-12 2015-09-23 中国科学院西北高原生物研究所 一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法
CN109714962A (zh) * 2016-07-11 2019-05-03 耶路撒冷希伯来大学的益生研究开发有限公司 用于在体外培养细胞的系统和方法
CN108192980A (zh) * 2017-12-28 2018-06-22 新疆农业大学 含acsl1基因用于提高吐鲁番黑羊肉质性状的检测试剂盒
CN109652560A (zh) * 2018-11-30 2019-04-19 甘肃农业大学 与牦牛乳品质相关的遗传标记及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PHILIPP WIDMANN: "Association of an ACSL1 gene variant with", 《BMC GENETICS》 *
唐炳华主编: "《分子生物学》", 31 July 2017, 中国中医药出版社 *
国家斑马鱼资源中心: "ZKO332a，Acsl1a基因第7外显子TCTGA序列缺失", 《国家斑马鱼资源中心》 *

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