CN109714962A - 用于在体外培养细胞的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于培养细胞的系统，包括：一生物反应器腔室，用于培养细胞；一输送系统，将一灌注溶液输送到所述生物反应器腔室，用于灌注所述灌注溶液通过所述细胞；一透析系统，具有一透析器和一透析液用于进行一透析，以及具有一过滤器用于降低所述透析液中的氨含量；以及一控制器，循环所述灌注溶液通过所述透析器，并循环所述透析液通过所述过滤器。

Description

用于在体外培养细胞的系统和方法
相关申请案
本案主张2016年7月11日提交的美国临时专利申请案第62/360,495号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域和背景技术
在本发明的一些实施例中，本发明涉及细胞生长，更具体地但非排他地，涉及用于体外培养细胞的系统和方法。
目前世界人口超过70亿，而且仍在快速增长。为了支持这不断成长的人口的营养需求，越来越多的土地专门用于粮食生产。自然资源不足以满足此需求，这导致了世界某些地区的饥荒。在世界其他地区，通过在恶劣条件下在密集的工厂农场中大规模生产动物来解决这个问题。这种大规模生产不仅给动物带来了巨大的痛苦，而且还使用有机砷化合物和抗生素来提高食物效率和控制感染，增加了肉制品中的砷含量和抗药性细菌。这还可能增加动物和人类的疾病量及其后果。目前需要进行大规模屠宰以满足当前的食物需求，并且由于大规模的疾病爆发，例如猪瘟病毒和疯牛病的发生。这些疾病还导致人类食用肉类的损失，因此完全无法达到先前饲养动物的目的。此外，大规模生产减少了成品的风味。负担得起的人们对于非层架式生产的蛋和非层架式生产的肉类存在喜好。这不仅是味道的问题并且是更健康的选择，从而避免食用各种饲料添加剂，例如生长激素。与大规模动物生产相关的另一个问题是由动物产生的大量粪便引起的环境问题以及随后必须解决的环境问题。此外，目前生产动物或生产动物饲料所需的大量土地不能用于替代目的，如其他种植作物、居住、娱乐、野生自然和森林的生长。
已经公开了几种方法来解决这些问题。
美国专利第US685390号公开了一种非人类组织工程肉制品及其制备方法。肉制品包含离体生长的肌肉细胞，用于食用。肌肉细胞可以生长并附着于支持结构，并且可以源自任何非人细胞。肉制品还可以包含其他细胞，例如脂肪细胞或软骨细胞或两者，它们与肌肉细胞一起离体生长。
美国专利第US7270829号公开了一种含有三维形式的体外产生的动物细胞的肉制品和制备所述肉制品的方法。所述方法包括在工业规模上在无人体有害物质的培养基中体外培养动物细胞，从而提供适合人类消费的三维动物组织，其中细胞是肌肉细胞、体节细胞或干细胞。
美国专利第US8703216号公开了多种方法和工程化肉制品，其形成为至少部分融合的多个层，其中每层包含至少部分融合的多细胞体，所述多细胞体包含非人类肌细胞，其中工程化肉品是可食用的，并且非人类肌细胞。相互粘附和/或粘合；多细胞体相邻排列在营养可渗透的支持基质上并在培养物中维持，使多细胞体至少部分融合形成一本质上为平面的层，以用于形成工程肉品。
美国专利申请案第US2011/0091604号公开了与生产合成肉相关的方法、系统和计算机可读取介质的实例，其中基底被配置用以支持细胞生长，其可以用于细胞接种。被接种的基质可以通过具有一滚动对滚动(roll to roll)机制的生物反应器进行滚动，从而允许营养物和生长因子与细胞相互作用。可以拉伸接种的基质以模拟肌肉作用。当被接种的基质滚过生物反应器时，可以监测被接种的基质的细胞生长的均匀性。而从基质获得合成肉的薄膜。
美国专利申请案第US2011/0301249号公开了用于产生体外培养的蛋白质产物的方法，所述蛋白质产物用干细胞改良，通过用体外培养的蛋白质产物喂养动物为动物提供营养。
世界知识产权组织的专利公开号WO2015/066377公开了用于改良养殖肉品生产的方法，例如牲畜自主肉品生产，其中肉品可以是任何后生动物(metazoan)组织或细胞衍生的可食用产品，其旨在被人类、伴侣动物、驯养或圈养动物(其胴体用于食用)、劳役性动物、被保护的动物物种、用于实验目的的动物或细胞培养物使用为可食用的食物或营养成分。
美国专利第US8802361号公开了一种灌注溶液，其包含特定的代谢剂、抗氧化剂和膜稳定剂，其可以帮助改善保存能力、器官活力，并且在一些情况下复原即将不能用于移植的器官，其中灌注溶液可以用于与低温机器灌注相结合。已经发现灌注溶液和低温机器灌注的组合可以帮助预防或减少对器官的进一步损伤，并恢复器官的抗氧化系统，稳定细胞骨架和细胞膜，抑制花生四烯酸途径，提供肿瘤支持，减少间质水肿的形成，并帮助恢复器官内的能量储存。
上述技术的主要问题之一是产品的成本、时间和质量之间的关系，以及以极高的成本，长时间的生产，其平庸的质量不能也无法取代目前来自牲畜的肉品。
发明内容
根据本发明一些实施例的一方面，提供一种用于培养细胞的系统，所述系统包括：
一生物反应器腔室，用于培养多个细胞；
一输送系统，配置用以将一灌注溶液输送到所述生物反应器腔室，用于以一灌注速率灌注所述灌注溶液通过所述细胞；
一透析系统，具有：一透析器和一透析液，用于进行一透析；以及一过滤器，用于降低所述透析液中的氨含量；以及
一控制器，配置用以循环所述灌注溶液通过所述透析器从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室，并循环所述透析液通过所述过滤器从所述透析器离开并返回所述透析器。
根据本发明的一些实施例的一方面提供一种培养细胞的方法，所述方法包括：
在一生物反应器腔室中培养多个细胞；
向所述生物反应器腔室输送一灌注溶液，用于灌注所述灌注溶液通过所述细胞；
循环所述灌注溶液通过具有一透析器于其中的一透析器从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室；以及
循环所述透析液通过所述过滤器从所述透析器离开并返回所述透析器，所述过滤器选择用于降低所述透析液中的氨含量。
根据本发明的一些实施例的一方面提供一种培养细胞的系统，所述系统包括：
一生物反应器腔室，用于培养多个细胞；
一输送系统，配置用以将一灌注溶液输送到所述生物反应器腔室，用于以一灌注速率灌注所述灌注溶液通过所述细胞；
一透析系统，具有一透析器，用于进行一透析；以及
一控制器，配置用以随时间增加所述灌注速率，并循环所述灌注溶液分别地通过所述透析器和所述输送系统从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室；其中离开所述生物反应器腔室的所述灌注溶液的一体积的至少90％，在所述细胞的一完整个生长期期间，循环回到所述生物反应器腔室中。
根据本发明的一些实施例的一方面提供一种培养细胞的方法，所述方法包括：
在一生物反应器腔室中培养多个细胞；
通过一输送系统向所述生物反应器腔室输送一灌注溶液，用于以一随时间增加的灌注速率灌注所述灌注溶液通过所述细胞；以及
循环所述灌注溶液分别地通过一透析器和所述输送系统从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室；
其中离开所述生物反应器腔室的所述灌注溶液的一体积的至少90％，在所述细胞的一完整个生长期期间，循环回到所述生物反应器腔室中。
根据本发明的一些实施例的一方面提供一种用于培养悬浮细胞培养物的系统，所述系统包括：
一生物反应器腔室，用于培养一悬浮细胞培养物；
一输送系统，配置用以将一灌注溶液输送到所述生物反应器腔室，用于以一灌注速率灌注所述灌注溶液通过所述悬浮细胞培养物；
一透析系统，具有一透析器，用于进行一透析；以及
一控制器，配置用以循环所述灌注溶液通过所述透析器从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室，同时在所述循环期间保持至少95％的细胞在所述生物反应器腔室中形成所述悬浮细胞培养物。
根据本发明的一些实施例的一方面提供一种培养悬浮细胞培养物的方法，其特征在于：所述方法包括：
在一生物反应器腔室中培养一悬浮细胞培养物；
向所述生物反应器腔室输送一灌注溶液，用于灌注所述灌注溶液通过所述悬浮细胞培养物；以及
循环所述灌注溶液通过一透析器从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室，同时在所述循环期间保持至少95％的细胞在所述生物反应器腔室中形成所述悬浮细胞培养物。
根据本发明的一些实施例的一方面提供一种脂肪细胞，其为根据本发明的一些实施例的所述多种方法获得的。
根据本发明的一些实施例的一方面提供一种在一蛋白质基质上产生一培养的脂肪的方法，所述方法包括：从所述成纤维细胞产生所述脂肪细胞，其中所述培养是在一植物来源的蛋白质基质上进行，从而在所述蛋白质基质上产生所述培养的脂肪。
根据本发明的一些实施例的一方面提供一种在体外从成纤维细胞产生脂肪细胞的方法，所述方法包括：在一无血清培养基中培养一自发永生化的成纤维细胞，从而产生一脂肪细胞，其中所述无血清培养基含有油酸和一PPAR-γ激动剂或活化剂。
根据本发明一些实施例的一方面提供在一植物来源的蛋白质基质中一培养的脂肪。
根据本发明一些实施例的一方面提供一种在体外从成纤维细胞产生肌细胞的方法，所述方法包括：上调一自发永生化的成纤维细胞内的一多肽的表达，所述多肽选自于由myoD1和肌细胞生成素所组成的一群组。
根据本发明一些实施例的一个方面提供一种肌细胞，所述肌细胞是根据权利要求57至62任一项所述的方法获得的。
根据本发明一些实施例的一方面提供一种在体外筛选能够产生肌细胞的小分子的方法，其特征在于：所述方法包括：
步骤a：用一核酸构建体转染一自发永生化的成纤维细胞，所述核酸构建体包含一核酸序列，所述核酸序列用以在特异性活化于多个肌细胞中的一启动子的一转录控制下编码一报导多肽；
步骤b：使在步骤a中转染的成纤维细胞与多种小分子的至少一种小分子接触；以及
步骤c：在步骤b之后检测所述转染的成纤维细胞中的所述报导多肽是否高于一预定阈值的活性，其中高于所述预定阈值的所述活性的存在表示所述至少一种小分子能够将所述自发永生化的成纤维细胞转化成为所述肌细胞。
根据本发明一些实施例的一方面提供一种在体外产生一可食用肉的方法，其特征在于：所述方法包括：培养：
(a)一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一脂肪细胞的条件下；及/或
(b)另一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一肌细胞的条件下，
从而产生所述可食用肉。
根据本发明一些实施例的一方面提供一种在体外产生一可食用肉的方法，所述方法包括：培养：
(a)一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一脂肪细胞的条件下；及/或
(b)一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一肌细胞的条件下；以及
(c)一内皮细胞，
从而产生所述可食用的肉。
一种可食用肉，其特征在于：所述可食用肉是根据权利要求67至81任一项所述的方法获得的。
根据本发明一些实施例的一方面提供一种产生自发永生化的成纤维细胞的方法，其特征在于：所述方法包括：
步骤a：在多个粘附培养条件下，于一含有血清的培养基的存在下，培养多个禽类胚胎细胞，从而获得多个鶏类胚胎成纤维细胞；
步骤b：在所述多个粘附培养条件下，于所述含有血清的培养基中，传代所述禽类胚胎成纤维细胞至少10至12代，直至培养物崩坏，其中所述培养物崩坏的特征为至少90％的所述禽类胚胎成纤维细胞的衰老和/或死亡；及
步骤c：在所述含血清培养基的所述培养物崩坏中，分离出存活额外至少20代的至少一群落，
从而产生所述自发永生化的成纤维细胞。
根据本发明一些实施例的一方面提供可通过本发明一些实施例的方法获得的一自发永生化的鸡类成纤维细胞。
根据本发明一些实施例，离开所述生物反应器腔室的所述灌注溶液的一体积的至少90％，在所述细胞的一完整个生长期期间，循环回到所述生物反应器腔室中。
根据本发明一些实施例，所述细胞形成一组织。
根据本发明一些实施例，所述细胞形成一培养的肉制品。
根据本发明一些实施例，所述透析器包括一过滤器，所述过滤器选择用于降低所述灌注溶液的氨含量。
根据本发明一些实施例，所述灌注速率随时间增加。
根据本发明一些实施例，所述增加是呈指数型增加的。
根据本发明一些实施例，存在多个生物反应器腔室，所有所述生物反应器腔室均与同一所述透析器流体连通，并且其中所述透析器施用所述透析至多个灌注溶液，所述多个灌注溶液从各个所述多个生物反应器腔室的各者循环离开。
根据本发明一些实施例，所述透析器配置用以确保与所述灌注溶液一起离开所述生物反应器腔室的至少一种蛋白质循环回到所述生物反应器腔室。
根据本发明一些实施例，所述至少一种蛋白质是白蛋白。
根据本发明一些实施例，在所述生物反应器腔室中对于每千克细胞存在约0.1升至约10升所述灌注溶液。
根据本发明一些实施例，在所述生物反应器腔室中对于每千克细胞存在约0.1升至约10升所述灌注溶液。
根据本发明一些实施例，所述灌注溶液的输送是通过一流体回路进行，所述流体回路构造成为通过一培养基和氧气来富集所述灌注溶液。
根据本发明一些实施例，所述流体回路构造成为还通过二氧化碳来富集所述灌注溶液。
根据本发明一些实施例，所述流体回路构造成为用以捕获或去除存在于所述灌注溶液中的多个气泡。
根据本发明一些实施例，所述流体回路构造成为用以加热所述灌注溶液。
根据本发明一些实施例，所述输送和所述循环在整个所述细胞生长过程中不丢弃所述灌注溶液。
根据本发明一些实施例，所述细胞形成一培养的肉制品，并且其中所述生物反应器腔室的体积最多为5升。
根据本发明一些实施例，述生物反应器腔室的体积最多为5升。
根据本发明一些实施例，所述成纤维细胞是一禽类的成纤维细胞。
根据本发明一些实施例，所述禽类选自于由鶏、鸭、鹅和鹌鹑所组成的一群组。
根据本发明一些实施例，所述成纤维细胞是一鶏胚胎成纤维细胞。
根据本发明一些实施例，所述自发永生化的成纤维细胞是未经遗传修饰的。
根据本发明一些实施例，所述PPAR-γ激动剂或激活剂是一小分子。
根据本发明一些实施例，所述小分子选自噻唑烷二酮(Thiazolidinedione)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine、IBMX)、芬那米尔(phenamil)、GW7845、RG14620和哈尔明碱(Harmine)。
根据本发明一些实施例，所述小分子是罗格列酮。
根据本发明一些实施例，所述无血清培养基不含动物污染物。
根据本发明一些实施例，所述无血清培养基不含人类污染物。
根据本发明一些实施例，所述无血清培养基包含：胰岛素或其替代物；和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或其替代物；和至少一种其他试剂，其中所述其他试剂选自于由地塞米松、转铁蛋白、硒、EGF或其替代物，和PGE2所组成的一群组。
根据本发明一些实施例，所述胰岛素的替代物包括IGF-1或一稳定化的长R3IGF-1。
根据本发明一些实施例，所述EGF的替代物包括EGF-R激动剂。
根据本发明一些实施例，所述EGF-R激动剂包含浓度为5至50纳克/毫升的NSC-228155。
根据本发明一些实施例，所述bFGF的替代物是FGF-信号传导途径的一小分子或一合成激动剂。
根据本发明一些实施例，所述合成激动剂是浓度为10至20纳克/毫升的C19-jun。
根据本发明一些实施例，所述地塞米松的浓度范围为0.01纳摩尔浓度至10微摩尔浓度。
根据本发明一些实施例，所述bFGF以0.1至30纳克/毫升的浓度范围提供。
根据本发明一些实施例，所述EGF以0.1至30纳克/毫升的浓度范围提供。
根据本发明一些实施例，所述PGE2以0.01纳摩尔浓度至10微摩尔浓度的浓度范围提供。
根据本发明一些实施例，所述植物来源的蛋白质基质来自豆科(legume family)(蝶形花科Fabaceae)、来自谷科(cereal family)或来自假谷科(pseudocereal family)。
根据本发明一些实施例，所述植物来源的蛋白质基质包含一大豆蛋白质或一豌豆蛋白质。
根据本发明一些实施例，所述培养的脂肪通过根据本发明一些实施例的方法获得。
根据本发明一些实施例，所述上调是所述myoD1和肌细胞生成素的多肽的上调。
根据本发明一些实施例，鶏类的所述myoD1的多肽由包括SEQ ID NO：5所示的核酸序列的一多核苷酸所编码。
根据本发明一些实施例，鶏类的所述肌细胞生成素的多肽由包括SEQ ID NO：7所示的核酸序列的一多核苷酸所编码。
根据本发明一些实施例，鶏类的所述myoD1的多肽由SEQ ID NO：1或3所示的核酸构建体所编码。
根据本发明一些实施例，鶏类的所述肌细胞生成素的多肽由SEQ ID NO：2所示的核酸构建体所编码。
根据本发明一些实施例，所述无血清培养基包含油酸和PPAR-γ激动剂。
根据本发明一些实施例，所述内皮细胞是一自发永生化的内皮细胞。
根据本发明一些实施例，所述内皮细胞是未经遗传修饰的。
根据本发明一些实施例，步骤a和步骤b在同一培养系统中同时进行。
根据本发明一些实施例，步骤a和步骤b在两种不同的培养系统中进行。
根据本发明一些实施例，步骤a、步骤b和步骤c在同一培养系统中同时进行。
根据本发明一些实施例，所述培养在一支架上进行。
根据本发明一些实施例，所述培养在一灌注系统中进行。
根据本发明一些实施例，所述培养在一可食用的中空纤维筒上进行。
根据本发明一些实施例，所述培养在一植物来源的基质上进行。
根据本发明一些实施例，所述植物来源的基质来自一谷科、一豆科(蝶形花科)或一假谷科。
根据本发明一些实施例，所述豆科是大豆或豌豆。
根据本发明一些实施例，所述培养在没有基质粘附的一悬浮培养基中进行。
根据本发明的一些实施例，所述培养在本发明的一些实施例的所述系统中进行。
根据本发明一些实施例，所述可食用肉为一肉饼或块状的形式，且具有一密度为约200×106个细胞/克。
根据本发明一些实施例，所述含血清的培养基是基于一DMEM/F12的培养基。
根据本发明一些实施例，所述培养基中的所述血清包含约15％的胎牛血清(FBS)。
根据本发明一些实施例，所述鶏类胚胎从生长10至12天的一受精肉鶏的卵获得。
根据本发明一些实施例，所述自发永生化的鶏类成纤维细胞能够连续传代至少30代。
根据本发明一些实施例，所述自发永生化的鶏类成纤维细胞能够进行至少90次群体倍增。
除非另有定义，否则所有本文使用的技术和/或科学术语与本发明所属领域的通常技术人员所理解的具有相同含义。尽管与本文所描述的类似或相同的方法或材料可以用于实践或测试本发明的实施例，但是仍将示例性的方法和/或材料描述如下。在冲突的情况下，以专利说明书所包含的定义为主。此外材料、方法和实施例仅是用于说明，而非旨在必然性地限制各自实施例。
本发明实施例的方法和/或系统的实现可以涉及手动地或自动地执行或完成所选择的任务或其组合。此外，根据本发明实施例的方法和/或系统的实际仪器和设备，若干所选择的任务可以通过硬件、软件或固件或其组合使用一操作系统来实现。
例如，根据本发明的实施例用于执行所选择的任务的硬件可以被实现为芯片或电路。至于软件，根据本发明的实施例所选择的任务可实施为多个软件指令，使用任何合适的作业系统通过一电脑执行。在本发明的一示例性实施例中，根据如本文所述的系统和/或方法的示范性实施例的一或多个任务通过一数据处理器执行，诸如用于执行多个指令的一计算平台。可选地，数据处理器包括用于存储指令和/或数据的一易失性存储器(volatilestorage)和/或用于存储指令和/或数据的非易失性存储器(non-volatile storage)，例如磁性硬盘和/或可移除的介质。任选地，设置一网络连接。可选地设置显示器和/或使用者输入装置，诸如键盘或鼠标。
附图说明
在本文中本发明的一些实施例仅以示例的方式描述，请参考附图。现在详细具体参考附图，需要强调的是所示的细节是以举例的方式，用于说明性地讨论本发明的实施例。在这点上，描述结合附图可使得本领域的技术人员更明了本发明的实施例如何被实施。
图1A和图1B是根据本发明的一些实施例中适于培养细胞的系统的示意图。
图2A至图2E显示自发永生化的鸡类胚胎成纤维细胞系的衍生。图2A是在第11天从受精卵中提取的肉鸡胚胎。图2B是在1次群体倍增后(population doubleing，PD 1)的原代鸡类胚胎成纤维细胞(chicken embryonic fibroblasts，CEF)的形态。图2C为崩坏后(postcrisis，90次群体倍增后(PD90))自发永生化的鸡类成纤维细胞(spontaneouslyimmortalized chicken fibroblasts，CSIF)的形态。图2D为在15％血清(FBS，黑色曲线)、无血清培养基(“SFM”，红色曲线)(如在下面示例部分的示例5中描述)和市售的TheraPEAKTM(LONZA WALKERSVILLE，INC.Walkersville，MD，217930127)培养基(“T-PEAK”，绿色曲线)中培养的CSIF的生长动力学。图2E为CSIF在15％血清(FBS，黑色柱)、无血清培养基(“SFM”，红色柱)(如下面示例部分的示例6所述)和市售的TheraPEAKTM(LONZAWALKERSVILLE，INC.Walkersville，MD，217930127)(“T-PEAK”，绿色柱)中培养的倍增时间。应该注意的是，与含血清的培养基相比，本发明人未发现永生化的鸡类成纤维细胞系(CSIF)在无血清培养基配方存在下表现出相同的生长动力学和倍增时间(如后面的示例中示例6中所述)。还要注意，市售的TheraPEAKTM(LONZA WALKERSVILLE，INC.Walkersville，MD，217930127)未能支持CSIF细胞的扩增(图2D)，并且与本发明的一些实施例的SFM或含血清培养基少于20小时的倍增时间相比，其中培养的细胞表现出一延长的40小时的倍增时间。
图3A至图3F描绘了用于CSIF繁殖的无血清培养基的开发和鉴定。所示为磺酰罗丹明B染色剂(sulforhodamine B stain，图3A至图3E)和蛋白质含量定量(图3F)，其用15％血清(“FBS”)、单独的“最小化的”无血清培养基(minimal，MIN)(图3B)或10纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，图3C)、5纳克/毫升表皮生长因子(EGF，图3D)、0.01微摩尔浓度前列腺素E2(PGE2，图3E)或10纳克/毫升的生长激素培养72小时后。无血清培养基(SFM)含有MIN培养基，其补充有bFGF(10纳克/毫升)、EGF(5纳克/毫升)和PGE2(0.01M)。“最小化的(MIN)”培养基包括：DMEM/F12、0.1微摩尔浓度地塞米松(dexamethasone)、胰岛素、转铁蛋白和硒(insulin、transferrin和selenium，ITS)、12微摩尔浓度的亚油酸和油酸，和L-丙胺酸基-L-谷氨酰胺(L-Analyl-L-Glutamine(GlutaMAX))。应该注意的是，在SFM中培养的细胞表现出与在补充有15％FBS的培养基中培养的细胞相似的细胞量(由蛋白质含量确定)。
图4A至图4D描绘了在无血清培养基中CSIF转化成脂肪细胞。图4A至图4C中显示CSIF无血清培养物中LipidTOXTM(Thermo Fisher Scientific)中性脂质染色，其暴露于单独的400微摩尔浓度的油酸(OA)(图4A)或0.5毫摩尔浓度的IBMX(OA+IBMX，图4B)或10微摩尔浓度的罗格列酮(Rosiglitazone)(OA +TZD，图4C)，持续7天。两种小分子在OA存在下都显示出强烈的脂肪形成。图4D为如上所述处理4天和7天的CSIF培养物的标准化细胞内脂质含量(以任意荧光单位)。带有小分子IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine)或TZD的400微摩尔浓度的油酸显示出最佳结果。
图5A至图5E描绘了CSIF转化成肌细胞。图5A为表达Dox可诱导的MyoD1和肌细胞生成素(MYOG)6天(d6)的CSIF相图(phase image)。图5B至图5C为在表达Dox诱导的MyoD1+MYOG后11天(图5B)或30天(图5C)，表达大鼠肌球蛋白轻链COP-GFP报导基因(rMLC3-GFP)的CSIF。大约2至4％的培养物对MLC3(绿色)呈阳性。MLC3阳性成肌细胞在体外保持细长的纤维形态超过30天(图5C)。图5D为使用鬼笔环肽(phalloidin，F-肌动蛋白探针，绿色)的荧光染色，显示多核细胞(合胞体，syncytia)以及培养7天后的一些条纹。细胞核用Hoechst(蓝色)染色。图5E为1-骨胳肌肌动蛋白(ACTA1，绿色)和肌钙蛋白T(红色)的免疫荧光染色，在诱导的第7天显示出清晰的肌肉表型。细胞核用Hoechst(蓝色)染色。
图6是pInducer-VP64-cMyoD1核酸构建体的示意图，用于在Dox诱导下在自发永生化的成纤维细胞中表达鶏类MyoD1。显示的是“中央多嘌呤管道(central polypurinetract)/中央终止序列(central termination sequence)”(CPPT/CTS)元素(橙色)，其产生“DNA瓣(DNA flap)”，在目标细胞感染期间增加病毒基因组的核输入并改善载体整合和转导效率；四环素(tetracycline)反应元件(粉红色)；VP64转录激活因子(桃色)；HA表位标签(epitope tag)(黄色)；和cMYOD1编码序列(浅蓝色)。
图7是pInducer20-cMyogenin核酸构建体的示意图，用于在Dox诱导下在自发永生化的成纤维细胞中表达鶏类肌细胞生成素。显示“中央多嘌呤管道/中央终止序列”(CPPT/CTS)元件(浅桃色)，四环素反应元件(绿松石色)；最小的CMV启动子(白色箭头)；和cMyogenin编码序列(浅蓝色)。
图8是pGreenFire慢病毒载体(lentiviral vector)中的大鼠MLC3增强子-启动子的示意图，用于显示自发永生化的成纤维细胞转化成肌细胞。显示的是“中央多嘌呤管道(central polypurine tract(CPPT)元素(黄色)；大鼠MLC3增强子(浅蓝色)；大鼠MLC3启动子(橙色)和COP GFP编码序列(绿色)。应注意，所述载体可用于筛选能够将自发永生化的成纤维细胞转化为肌细胞的小分子。
图9是根据本发明的一些实施例中，适合于在原型设计中所设计的用于培养细胞的系统的示意图。
图10A和图10B是显示产生质量和施加的灌注速率(图10A)和累积的葡萄糖消耗量(图10B)的示意图，如在根据本发明的一些实施例中进行的实验中所获得。
图11A至图11C描绘了组织形成和血管形成。图11A为每毫米体积加载150×106个自发永生化的鸡类成纤维细胞(CSIF)和15×106个自发永生化大鼠微血管内皮细胞(ratmicrovascular endothelial cells，RCEC)的3D胶原支架的磺酰罗丹明B染色。图11B为在生物反应器中灌注11天后，装载有高密度CSIF和RCEC共培养物的3D支架的相图。图11C为装载有RCEC(红色标记)和iPS衍生细胞(绿色)的3D支架的共聚焦横截面，其显示在生物反应器中灌注11天后，血管网络形成紧密的细胞-细胞相互作用。
图12是pInducer20-cMyoD1核酸构建体的示意图，用于在Dox诱导下在自发永生化的成纤维细胞中表达鶏类MyoD1。显示“中央多嘌呤管道/中央终止序列”(CPPT/CTS)元件(浅桃色)，四环素反应元件(绿松石色)；最小的CMV启动子(白色箭头)；和cMyogenin编码序列(橙色)。
具体实施方式
在本发明的一些实施例中，本发明涉及细胞生长，更具体地但非排他地，涉及体外培养细胞的系统和方法。
本发明人描述了一种培养细胞的系统，所述系统可用于本发明的一些实施例中，用于产生可食用的肉品。
自农业革命开始以来，鸡肉一直是膳食蛋白质的主要来源。生产传统上是当地的、家庭的而后来的小村庄种植自己的粮食动物。然而工业革命带动的快速城市化和人口增长导致了集约化的耕作方法的发展。工厂农场现在每年在美国生产近90亿只鸡，而动物生长和运输产生18％的当前温室气体排放。本发明人认识到，大量的鸡肉(例如在美国超过70％)含有不安全水平的砷和抗生素抗性细菌。本发明人还认识到，运输和动物密度导致鶏肉广泛地被粪便污染，导致沙门氏菌感染增加。
实验室培养的肉品可以在无菌条件下从动物细胞中生长肉品。本发明人发现，可以在每单位质量的肉制品中产生足够量的细胞(例如每克约500至约200×106个细胞)，而不使用动物产品，例如胎儿牛血清。然而，虽然在过去50年中已经开发了许多细胞培养技术用于生物学研究，但是本发明人发现这种培养技术非常浪费，需要大量培养基来生产少量实验室生长的肉品。例如，已知的技术需要约230升的体积来生产约1公斤的肉，由于仅有中等成本，每千克的成本至少为4,600美元。
为了更好地理解本发明的一些实施例，将描述工业规模细胞的制造技术的构造和操作。
本领域已知几种工业规模的细胞制造技术。这些包括10,000公升进料分批过程和1,000公升浓缩灌注过程。典型培养基的目前价格成本估计为进料分批过程每升L约20美元，浓缩灌注过程每升约5美元。对于理想的CHO细胞，所述进料分批过程允许实现约25×106个细胞/每毫升的细胞密度，并且浓缩灌注过程允许实现约100×106个细胞/每毫升的细胞密度。这些细胞密度意味着10,000升补料分批反应器每19天可产生1,250千克质量，而1,000升灌注反应器每30天可产生500千克质量。进料分批过程消耗12,500升培养基，包括接种适应(seed train)，而灌注过程消耗2,120升培养基。对于补料分批过程，这些数字转化为每千克质量200美元，对于培养基成本的灌注过程为每千克质量21美元。
人们知道，消耗品成本通常不到商品成本的三分之一。一个参数是资本成本。已知10,000升进料分批设施的成本为5000万美元或更多，已知1,000个灌注设施耗资3000万美元或更多。假设每年折旧和维护成本为10％，工业规模为10,000的进料分批设施每年可生产24,000千克，每年维护成本约为5,000,000美元，因此每公斤生产的资本成本为200美元。工业规模为1000的灌注设施每年可生产6,000千克，每年维护成本约为3,000,000美元，因此每公斤生产的资本成本约为500美元。
本发明人设计了一种优于这些常规方法的细胞培养技术。
在详细解释本发明的至少一实施例之前，应理解，本发明不一定限于其应用于以下描述中阐述的和/或在附图和/或实施例中说明的构造细节和组件和/或方法的配置。本发明能够具有其他实施例或以各种方式实践或实施。
图1A和图1B是根据本发明的一些实施例中适于培养细胞302的系统1000的示意图。系统1000可用于生长许多类型的细胞。在本发明的一些实施例中，细胞302形成悬浮培养物，可用于例如细胞疗法或用于蛋白质或疫苗生产，在本发明的一些实施例中，细胞302形成组织，可用于例如组织移植。在本发明的一些实施例中，细胞形成一培养的肉。
系统1000优选地包括一生物反应器腔室300，用于培养多个细胞302，一输送系统100，配置用以将一灌注溶液输送到所述生物反应器腔室300，用于灌注所述灌注溶液通过所述细胞，以及一透析系统，具有一透析器和一透析液，用于进行一透析以交换营养物和副产物。生物反应器室300可采用任何用于培养细胞的技术，包括但不限于中空纤维筒(hollow fiber cartridge)、填充床(packed bed)或血管化嵌入组织构造(vascularizedembedded tissue configuration)。所述灌注溶液通过细胞的灌注任选且优选地是连续的。在本发明的一些实施例中，在生长周期结束时，所述生物反应器腔室中每千克细胞有约0.1升至约10升的灌注溶液，例如1升。生物反应器室300可具有任何尺寸，但在本发明的优选实施例中，生物反应器室300的体积最多为5升，例如约1升至约5升。当系统1000包括多个生物反应器腔室时，这些实施例特别有用，如下文进一步详述。生物反应器腔室300通常可以促进肌肉组织的生长，从约20毫克的初始量到至少500克的可食用量，例如1000克或更多。
系统1000优选地以通常封闭循环流体模式操作，其中所述灌注溶液通过一或多个出口端口308离开生物反应器腔室300进入输送系统100和透析系统200，在这些系统中处理然后通过一或多个入口端口306返回到生物反应器腔室300。在不丢弃灌注溶液本身的意义上，所述操作被称为“封闭循环操作”。因此，系统1000任选地并且优选地缺乏用于将所述灌注溶液从系统1000移除并进入一外部废物去除装置中的任何机构，并且没有任何在操作期间增加所述灌注溶液量的机制。然而，应该理解，灌注溶液的含量在操作期间通过与系统100和200相互作用而改变。在本发明的各种示例性实施例中，其中至少90％或至少92％或至少94％或至少96％或至少98％的离开生物反应器腔室300(至系统100或系统200)的灌注溶液，在的一段时间内一直循环回到生物反应器腔室300，所述段时间为至少4天或至少5天或至少6天或至少7天或至少8天或至少9天或至少10天或至少12天或至少14天或至少16天或至少18天或至少20天，或在细胞302的整个生长周期期间。
系统1000可选地且优选地包括一控制器304，用于控制输送系统100，透析系统200和/或生物反应器腔室300。控制器304可选地且优选地包括一电路，配置用于执行本文所述的各种操作。在本发明的一些实施例中，控制器304是计算机控制器。来自控制器的代表性控制线显示为虚线。具有本文描述的细节的本领域普通技术人员将知道如何在控制器304和系统1000的其他可控组件之间构建控制线。
在本发明的一些实施例中，控制器304使灌注溶液通过透析器20从生物反应器腔室300循环出来并返回到生物反应器腔室300中。这可以通过控制泵21来实现。在本发明的各种示例性实施例中，在循环期间执行循环同时保持细胞302的至少95％或至少96％或至少97％在生物反应器腔室300中。优选地，透析器20被配置成确保用随着灌注溶液离开生物反应器腔室300的至少一种蛋白质(例如白蛋白albumin，更优选地是所有蛋白质)循环回到生物反应器腔室300中。这可以是例如，通过提供具有薄膜的膜透析器来完成，所述膜确保相应的蛋白质(例如但不限于白蛋白，分子量为约66.5kDa)循环回到生物反应器腔室300而没有进入透析系统200的透析液22。所述实施例的优点在于白蛋白是生长因子、激素和脂肪酸的载体蛋白，因此可促进细胞302的生长至少一段期间，所述期间与其特征的半衰期(约20天)相同。。这显著降低了细胞的生产成本，因为白蛋白、激素和生长因子是培养基的主要成本驱动因素。
在本发明的各种示例性实施例中，在透析系统200中使用过滤器以从进入透析系统200的灌注溶液的部分中除去氨。这可以通过提供具有过滤器24的透析系统200来实现，所述过滤器24选择用于减少透析液22中的氨含量。在这些实施例中，控制器304任选地并且优选地将透析液22通过过滤器24循环离开透析器20并返回到透析器22，例如，通过控制透析系统200中的泵23。氨是肽降解和谷氨酰胺分解的产物。当氨达到5毫摩尔浓度时，氨会变得有毒并限制细胞生长。本实施例的封闭循环操作优选地将含蛋白质的培养基与不含蛋白质的透析液分离，所述无蛋白质的透析液可以洗涤去氨而不会损失蛋白质至非特异性吸收。适用于本实施例的是过滤器，例如但不限于填充的沸石颗粒(packed Zeolitesparticle)或碳网(carbon meshes)。基于沸石的氧气浓缩器系统广泛用于生产医用级氧气。沸石用作分子筛，利用其从空气中捕获杂质的能力产生纯化的氧气，在涉及氮气吸附的过程中，留下高度纯化的氧气并从溶液中清除氨气。
系统1000优选以循环方式操作，其中细胞生长在循环开始时开始，并且将生长的细胞从腔室中取出，以在循环结束时提供细胞产物(悬浮培养物、组织、培养的肉)。通常采用10天的循环，但也考虑其他循环持续时间。在本发明的一些实施例中，控制器304确保生物反应器腔腔室300内的灌注速率在操作循环期间随时间增加。优选地，所述增加是指数的。灌注速率的增加不需要是连续的，尽管灌注速率也考虑为的连续增加。例如，灌注速率可以在操作循环期间的某些天间歇地增加。通常但非必要地，第一次增加在循环开始后几天进行。在循环结束时，灌注速率优选为至少20毫升/每秒或至少25毫升/每秒或至少30毫升/每秒或至少35毫升/每秒，例如36毫升/每秒或更高。
再次参考图1，灌注溶液的输送任选地并且优选地通过一流体回路102，其可选地并且优选地由控制器304控制，例如通过输送系统100中的泵11，并且构造成用于通过一培养基和一或多种气态介质，例如但不限于氧气、二氧化碳和氮气，来富集所述灌注溶液。这任选地且优选地通过培养基储存库10和质量传递装置12来实现，所述培养基储存库10通过培养基来富集所述灌注溶液，所述质量传递装置12例如但不限于氧合器等，其通过一种或多种气态介质来富集所述灌注溶液。通常，质量传递装置12提供一混合物，具有约21％至约95％的氧气，约0％至约10％的二氧化碳，以氮气平衡至100％。优选地，质量传递装置12保持通常恒定的(例如具有10％或更小的耐受性)pH。在不被认为是限制的代表性实例中，质量传递装置12提供约80％氧气，约5％二氧化碳和约15％氮气的混合物。
可选地，流体回路102构造成捕获或去除灌注溶液中存在的气泡。这可以通过气泡处理装置12来实现，气泡处理装置12可以包括气泡捕捉器和/或除泡器。捕获或去除气泡的优点在于，不小心地引入生物反应器腔室300的气泡可能对系统1000的操作产生负面影响，因为气泡对细胞具有细胞毒性并且可能使其细胞膜破裂，因此捕获或移除气泡可增强系统1000的表现。在本发明的一些实施例中，流体回路102也构造以加热灌注溶液，任选地并且优选地在灌注溶液进入生物反应器腔室300之前加热灌注溶液。
系统1000可以包括一以上的生物反应器腔室300。所述优选实施例在图1B中显示出。显示的几个生物反应器腔室，各生物反应器腔室可选地且优选地类似于如本文所述的生物反应器腔室300，以及若干输送系统，各输送系统可选地且优选地类似于如本文所述的输送系统100，其中各输送系统100系统例如借助泵11使所述灌注溶液循环通过所述多个生物反应器腔室的一者。
如上文进一步详述的，所述灌注溶液的一部分也离开生物反应器腔室进行透析。在所示的实施例中，不应视为限制性的，来自所有生物反应器腔室的灌注溶液的一部分进入主循环通道1002，使灌注溶液循环到同一透析系统中，这是任选地并且优选类似于如本文所述的透析系统200。因此在这些实施例中，系统1000包括多个生物反应器腔室，相应的多个输送系统，以及共用的透析系统，其将透析施用于所有生物反应器腔室的灌注溶液。
所述多个生物反应器腔室，多个输送系统和透析系统任选地并且优选地由控制器304控制，如上文进一步详细描述。
优选地选择系统1000中的多个生物反应器腔室(和相应的多个输送系统)的数量，使得生物反应器腔室中灌注溶液的总体积可以被所述透析系统透析。通常在系统1000中存在约10至约500个，例如约100个生物反应器腔室。例如当所述透析系统被构造用以透析约V升的灌注溶液时，以及多个生物反应器腔室中各者具有大约v升的灌注溶液，系统1000中的生物反应器腔室的数量是V/v。作为一不被认为是限制的代表性示例，V可以是大约500并且v可以是大约5，因此V/v是大约100。具有多个相对小的生物反应器腔的优点是它允许具有相对高的灌注速率。
以下是根据本发明的一些实施例的系统1000的更详细描述。
透析器20例如可以是一中空纤维透析器，例如但不限于由Rancho Spectrum Labs(Rancho Dominguez，CA)商业销售的中空纤维透析器。透析器可包括面积为约500至约1000，例如约790平方公分，截留分子量(molecular weight cutoff)为约20至约40kDa的膜，例如约30kDa。可以使用泵21(例如但不限于一蠕动泵(peristaltic pump))，所述灌注溶液的一部分通过透析器20转移到系统200。通过逆流(counter flow)暴露于无蛋白质的透析液22、通过过滤器24重新循环(例如但不限于氨过滤器24)、一额外的泵23(例如但不限于蠕动泵)，透析器20对所述灌注溶液进行透析。系统1000内的温度任选地并且优选地保持在根据正在培养的动物细胞302的类型所选择的生理范围。例如对于鸡肉，温度可以是约38至约42℃，对于牛肉，温度可以是约36.7至约39℃，对于猪肉，温度可以是约38至约39℃等。
生物反应器腔室：
在本发明的一些实施例中，所述腔室300具有一容积和内部尺寸，其配置和设置成接收生长细胞并将细胞保持在其容积内，同时足够量的所述灌注溶液连续循环通过所述生长中的细胞。所述腔室300任选地并且优选地特别适合于其内的细胞类型，以便为细胞生长提供适当的环境并使机械损伤或物理应力最小化，所述机械损伤或物理应力可能阻止血管供应氧气和营养物到生长中的细胞。
蠕动泵：
蠕动泵在本领域中是已知的。为了向本领域的任何技术人员提供执行本发明所需的信息，将提供简要说明。蠕动泵是一种用于泵送各种流体的正排量泵(www.en.dot.wikipedia.dot.org/wiki/Peristaltic_pump，在此引入作为参考)(positive displacement pump)。流体包含在安装在圆形泵壳中的柔性管内(尽管已制成线性蠕动泵)。转子(rotor)具有连接到转子的外圆周上的多个“滚子(roller)”、“鞋(shoes)”、“刮水器(wiper)”或“叶片(lobes)”并且压缩所述柔性管。当转子转动时，处于压缩状态的管的部分被夹紧闭合(或“闭塞”)，从而迫使流体被泵送以移动通过管体。另外，当管体在凸轮(cam)通过后打开到其自然状态(“恢复”或“弹性”)时，流体被引入泵。所述过程称为蠕动，并且用于许多生物系统，例如胃肠道。通常，将有两个或更多个滚子或刮水器堵塞管子，在它们之间捕获一流体。然后，在环境压力下，将流体输送到泵出口。蠕动泵可以连续运行，或者它们可以通过部分的转动以输送较少量的流体。
蠕动泵通常用于泵送清洁/无菌或腐蚀性流体，因为不会发生与暴露的泵组件的交叉污染。一些常见的应用包括通过输液设备泵送静脉注射流体、腐蚀性化学品、高固体浆料和其他材料，其中将产品与环境隔离以及将环境与产品是至关重要的。它还用于心肺机器以在一旁路手术期间循环血液，因为泵不会引起显著的溶血。
蠕动泵还用于各种工业应用。其独特的设计使其特别适合泵送磨料和粘性流体。
滚子和壳体之间的最小间隙决定了管体上施加的最大挤压。施加管体上的挤压量会影响泵送性能和管体寿命，更多的挤压会显著降低管道寿命，而较少的挤压会导致泵送介质滑回，特别是在高压泵送中，并且显著降低泵的效率并且高速的回滑通常会导致软管过早损坏。因此，此挤压量成为重要的设计参数。
术语“闭塞(occlusion)”用于测量挤压量。它表示为壁厚的两倍的百分比，或者表示为被挤压的壁的绝对量。
令y表示一闭塞，令g表示一滚子和壳体之间的最小间隙，t表示管道的壁厚。然后当表示为绝对挤压量时，y＝2t-g，当表示为壁厚的两倍的百分比时，y＝(2t-g)/(2t)×100。闭塞通常为10％至20％，对于较软的管材料具有较高的闭塞，对于较硬的管材料具有较低的闭塞。
因此对于给定的泵，最关键的管尺寸变为壁厚。这里一有趣的观点是，管道的内径不是泵的管道适用性的重要设计参数。因此，只要壁厚保持不变，通常将多于一种的内径(inside diameter,ID)与一泵一起使用。
内径：对于一给定的泵转速，内径(ID)较大的管体将比内径较小的管具有更高的流速。直观地流速是管孔的横截面积的函数。
蠕动泵中的流速由许多因素决定，例如管内径(ID)，其中较大的ID获得较高的流速，泵头的外径(OD)，其中较大的OD获得较高的流速，和泵头的转速，在较高的转速下获得较高的流速。已经认识到，增加滚子的数量通常不会增加流速。相反，其通常通过减少头部的
有效(流体泵送)周长来降低流速。增加的滚子通常通过增加脉冲流的频率来减小出口处的流体脉冲的幅度。
管体的长度(从入口附近的初始夹点到出口附近的最终释放点测量)不影响流速。然而，较长的管意味着入口和出口之间的夹点更多，从而增加了泵可以产生的压力。
本实施例考虑了蠕动泵的几种变型中的任何一种。软管泵通常可在连续使用的情况下运行高达16巴(bar)，使用鞋体(shoes，仅用于低压类型的滚子)，并且套管(casing)内填充润滑剂以防止泵管外部磨损并有助于散热，并使用加强管，通常称为“软管(hosetube)”。这类泵通常被称为“软管泵(hose pump)”。软管泵在滚子泵上的优点是高达16巴(bar)的高操作压力。使用滚子最大压力可达到12巴。管泵(tube pump)通常是具有干燥壳体的低压蠕动泵，并且使用滚子以及非加强的挤压管。这类泵有时被称为“管泵(tube pump或tubing pump)”。这些泵采用多个滚子挤压管体。除如下所述的360°偏心泵设计外，这些泵至少有2个相隔180°的滚子，并且可以有多达8个、甚至12个滚子。增加滚子的数量会增加出口处泵送流体的压力脉冲频率，从而减小脉冲的幅度。
本实施例考虑了多种滚子设计的几种变型中的任何一种。在固定的闭塞泵中，所述滚子在转动时具有固定的轨迹，在挤压管时保持闭塞恒定。在弹簧加载的滚子中，所述泵中的滚子安装在弹簧上。这种设计有助于克服更宽广范围内的管壁厚度变化。无论变化如何，滚子在管体上施加与弹簧常数成比例的相同应力量，使其成为恒定的应力操作。选择弹簧，使其不仅要克服管道的环向强度，还要克服泵送流体的压力。
这些泵的工作压力由管体和马达的能力所决定，以克服管体环向强度和流体压力。
虽然上面的实施例特别强调蠕动泵，但应理解其他泵，例如但不限于正排量泵、脉冲泵、速度泵、重力泵、蒸汽泵和无阀泵皆可以使用。
培养基灌注溶液：
取决于在本发明的装置中生长的细胞源的类型，使用特定的培养基灌注溶液。
细胞培养基通常含有胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，其提供附着因子、脂肪酸、生长因子、激素和白蛋白。除转铁蛋白(transferrin)、胰岛素和富含脂质的牛血清白蛋白外，FBS通常可以替换为由氨基酸、维生素和微量元素组成的血清替代物(例如KO血清)。虽然转铁蛋白和胰岛素都是使用重组技术在细菌中产生的，但白蛋白通常是动物来源的。然而，植物和细菌衍生的重组人类白蛋白(例如CellastimTM)可通过几家公司获得，包括Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
鸡类胚胎成纤维细胞(Chicken embryonic fibroblast，CEF)培养基传统上由补充有15％FBS和谷氨酰胺(glutamine)的M199或DMEM/F12培养基组成。然而现在用于哺乳动物成纤维细胞生长的无血清培养基也可以容易地获得。哺乳动物细胞(如牛、猪)的培养基由M199组成，补充0.5毫克/毫升的白蛋白、0.6微摩尔浓度的亚油酸，0.6微克/毫升的卵磷脂、5纳克/毫升的bFGF、5纳克/毫升的EGF、30皮克/毫升的TGFβ1、7.5毫摩尔浓度的谷氨酰胺、1微克/毫升的氢化可的松(hydrocortisone)、50微克/毫升的抗坏血酸和5微克/毫升的胰岛素。所述培养基PCS-201-040可从ATCC(Manassas，VA)获得，据报导其支持了快4倍的人类成纤维细胞增殖。在某些条件下，胰岛素可以用IGF-1取代或稳定的长R3IGF-1(Sigma)代替。EGF可以用EGF-R激动剂NSC-228155代替(Sakanyan等人所著，科学报导2014，Sci.Reports.2014)。FGF可以类似地用小分子或合成激动剂，如C19-jun代替(Ballinger等人所著，自然生化期刊1999，Nature.Biotech.1999)。鸡类肝细胞类似地由为人类和小鼠肝细胞设计的无血清培养基支持。培养基由Williams E基础培养基组成，补充有白蛋白、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松(1)。
氧合器(Oxygenator)：
氧合器是一种医疗装置，其能够在外科手术过程中在人类患者的血液中交换氧气和二氧化碳，这可能需要中断或停止体内、关键器官或大血管中的血流。这些器官可以是心脏、肺或肝脏、而大血管可以是主动脉、肺动脉、肺静脉或腔静脉。氧合器通常由心脏手术中的灌注师与心肺机一起使用。然而氧合器也可用于护士的新生儿重症监护室中的体外膜氧合(www.en.dot.wikipedia.dot.org/wiki/Oxygenator，在下文中引入作为参考)。
对于大多数心脏手术，例如冠状动脉旁路移植术，使用心肺机(或心肺旁路机)进行心肺分流术。心肺机用于在开放式旁路手术期间取代心脏功。所述机器取代了心脏泵送动作和肺部气体交换功能。由于心脏在手术期间停止，这允许外科医生在无血的静止心脏上操作。
心肺机的一组件是氧合器。所述氧合器组件用作为肺，并设计成将血液或所述灌注介质暴露于氧气并除去二氧化碳。它是抛弃式的，含有约2至4平方米的膜，其可渗透气体，但不透血液，呈中空纤维形式。血液在中空纤维的外侧流动，而氧气在纤维内部以相反的方向流动。当血液通过氧合器时，血液与装置本身的精细表面紧密接触。含有氧气和医用空气的气体被输送到血液和装置之间的界面，允许血球细胞直接吸收氧分子。
在本发明的一些实施例中，提供氧合器作为质量传递装置12，以在用于培养细胞的培养基中交换气体。
在本发明的各种实施例中，气体选自氧气(O2)、二氧化碳(CO2)、氮气(N2)及其任何组合。
在本发明优选的实施例中，需要维持的各种气体的百分比的比率是O2为约21％至约95％、CO2为约0％至约10％、N2为约0％至约80％。
在本发明优选的实施例中，需要维持的各种气体的百分比的比率是O2约为80％、CO2约为5％、N2约为15％。
气泡捕捉(bubble trap)：
不经意地将不需要的气泡引入微流体系统会对装置操作和实验结果产生负面影响。对于微流体灌注培养系统尤其如此，其通常需要在细胞接种之前对表面进行灭菌和预处理，允许细胞附着的时间，然后花费数天来观察生长速率和细胞形态。在装置和管体之间的连接处可能形成气泡，或者在拔出连接至显微镜和培养箱之间的转移装置时可能引入气泡。气泡对细胞具有细胞毒性，可能会破坏细胞膜。
减轻基于气泡导致设备故障的一种解决方案是并入微流体特征以防止气泡进入设备的关键区域。一般来说，有两种不同的方法：诱捕(trapping)与消泡(debubbling)。气泡捕捉器是并入到流动系统中的结构，其阻止气泡进一步进行通过装置。通过在外部管道与其设备之间的连接点处形成一腔室，已经证明了是一种简单，易于实施的气泡捕捉器。所述方法具有以下优点：在捕获气泡的同时维持装置操作。另一种方法是主动去除系统中的气泡。这是有利的，因为气泡捕捉器不会从系统中去除气泡，因此当气泡捕捉器完全充满气泡时，任何额外的气泡将被递送通过系统。可以基于形成流体回路102的材料(例如，PDMS)的透气性来实现主动气泡去除。在这些实施例中，施加正压力以迫使气泡离开流体回路102。
在本发明的实施例中，所述系统包括用于去除气泡的专用部件，所述气泡选自：气泡捕捉器(bubble trap)、除泡器(debubbler)及其任何组合。
热交换器：
热交换器是用于在一或多种流体之间传递热量的装置。流体可以通过固态壁(例如塑料或金属管)分开，以防止混合或它们直接接触。它们广泛用于空间供暖、制冷、空调、电站、化工厂、石化厂、炼油厂、天然气处理和污水处理。热交换器的典型例子是在内燃机中发现，其中称为发动机冷却剂(engine coolant)的循环流体流过散热器盘管，并且空气流过所述盘管，所述盘管所述冷却剂冷却并将进入的空气加热(www.en.dot。wikipedia.dot.org/wiki/Heat_exchanger#Fluid_heat_exchangers-在此引用作为参考)。
流动配置：根据其流动配置，有三种主要的热交换器类别。在平行流(parallel-flow)热交换器中，两种流体在同一端进入交换器，并且彼此平行地行进到另一侧。在逆流(counter-flow)热交换器中，流体从相对的两端进入交换器。逆流设计是最有效的，因为它可以从每单位质量的热(传递)介质传递最多的热量，因为沿着任何单位长度的平均温差更高。见逆流交换。在横流式(cross-flow)热交换器中，流体通过交换器大致彼此垂直地行进。
为了提高效率，热交换器被设计成使两种流体之间的壁的表面积最大化，同时使流过交换器的流体的阻力最小化。交换器的性能还可能受到在一或两个方向上添加翅片(fin)或波纹(corrugation)的影响，这增加了表面积并且可能引导流体流动或引起湍流。
传热表面上的驱动温度随位置而变化，然而适当的平均温度可以被定义。在大多数简单系统中，这是“对数平均温差”(log mean temperature difference，LMTD)。有时无法直接了解LMTD，并且使用了传输单元数(number of transfer units，NTU)方法。
类型：双管(double pipe)热交换器是工业中使用的最简单的热交换器。一方面，这些热交换器在设计和维护方面都很便宜，使其成为小型工业的理想选择。另一方面，它们的低效率加上大规模占用的高空间，导致现代工业使用更有效的热交换器，如壳(shell)和管(tube)或板(plate)。然而由于双管热交换器很简单，它们被用于向学生传授热交换器设计的基础，因为所有热交换器的基本规则是相同的。为了开始设计双管热交换器，第一步是计算热交换器的热负荷。必须注意的是，为了更容易设计，最好忽略初始设计对环境的热量损失。
在壳管式换热器中设计管体时必须考虑几个热设计特征：壳体和管体设计可以有很多变化。通常每个管体的末端通过管板中的孔连接到增压室(plenums，有时称为水箱)。管体可以是直的或弯曲成U形，称为U形管。
管径：使用较小的管径使热交换器既经济又紧凑。然而，这样的热交换器更可能更快地结垢，并且小尺寸使得结垢的机械清洁变得困难。为了克服污垢和清洁问题，可以使用更大的管体直径。因此，为了确定管体直径，必须考虑流体的可用空间、成本和结垢性质。
管体厚度：通常确定管壁厚度以确保：
有足够的腐蚀空间；
流动引起的振动具有阻力；
轴向强度；
备件的可用性；
箍强度(承受内管压力)
屈曲强度(承受壳体内的超压)
管长：当壳体直径较小且管长较长时，热交换器通常更便宜。因此，通常目的是在不超过生产能力的同时尽可能地使热交换器更长。然而，这方面存在许多限制，包括安装现场可用的空间以及确保可得的管体的长度是所需长度的两倍(因此可以取出和更换)。而且细长的管子体很难取出和更换。
管体间距：在设计管子时，确保管体间距(即相邻管体的中心距离)不小于管体外径的1.25倍是切实可行的。较大的管体间距导致较大的整体壳体直径，这导致更昂贵的热交换器。
管体波纹：这种馆体主要用于内管的管道增加流体的湍流，这种影响在传热方面非常重要，从而提供更好的性能。
管体布局：是指管体如何定位在壳内。有四种主要类型的管布局，即三角形(30°)、旋转三角形(60°)、方形(90°)和旋转方形(45°)。三角形图案用于提供更大的热传递，因为它们迫使流体以更湍流的方式围绕管体流动。采用方形图案，会经历高度污染并且更常的清洁。
挡板设计：挡板用于管壳式换热器，以引导流体穿过管束。它们垂直于壳体运行并保持成束，防止管子长时间下垂。它们还可以防止管子振动。最常见的挡板类型是节段挡板(segmental baffle)。半圆形节段挡板与相邻的挡板成180度取向，迫使流体在管束之间向上和向下流动。在设计壳管式热交换器时，挡板间距具有很大的热力学问题。考虑到压降和传热的转换，挡板必须间隔开。对于热经济性优化，建议挡板间隔不小于壳体内径的20％。由于流动重定向，挡板间隔太近会导致更大的压降。因此，使挡板间隔太远意味着挡板之间的拐角处可能存在较冷的点。确保挡板间隔足够近以使管体不下垂也很重要。另一种主要类型的挡板是圆盘和圆环挡板，由两个同心挡板组成。外部较宽的挡板看起来像甜甜圈，而内挡板的形状像圆盘。这种类型的挡板迫使流体绕过圆盘的每一侧，然后通过环形挡板产生不同类型的流体流动。
特别适用于船舶和苛刻应用的固定管液冷式热交换器可以与黄铜外壳、铜管、黄铜挡板和锻造的黄铜集成端毂(forged brass integral end hubs)组装在一起。
板式热换换器：另一种换热器是板式热交换器。这些交换器由许多薄的、略微分开的板所组成，这些板具有非常大的表面积和用于传热的小流体流动通道。垫片和焊焊技术的进步使得板式热交换器越来越实用。在HVAC应用中，这种类型的大型热交换器称为板框式(plate-and-frame)；当在开环(open loop)中使用时，这些热交换器通常是垫圈类型(gasket type)，以允许定期拆卸、清洁和检查。有许多类型的永久粘合板式热交换器，例如各种浸焊(dip-brazed)、真空焊焊(vacuum-brazed)和焊接板(welded plate)，它们通常用于闭环应用，例如冷藏。板式热交换器在所使用的板的类型和这些板的构造方面也不同。一些板可以用“人字形(chevron)”、凹坑或其他图案冲压，其中其他板可以具有机械加工的翅片和/或凹槽。
与壳管式换热器相比，叠板式布置通常具有较低的体积和成本。两者之间的另一个区别是，与壳管式的中压和高压相比，板式热交换器通常用于低压到中压的流体。第三个重要的区别是叠板式热交换器采用更多的逆流而不是交叉流，这允许更低的邻近温度差异(approach temperature differences)、高温变化和提高的效率。
板壳式热交换器：第三种热交换器是板壳式热交换器，它将板式热交换器与壳管式热交换器技术相结合。热交换器的核心部分包含一个完全焊接的圆形板组件，通过压制和切割圆板并将它们焊接在一起而制成。喷嘴将流入和流出板组(“板侧(plate side)”流路)。完全焊接的板组件组装成一外壳，形成第二个流路(“壳侧(shell side)”)。板壳技术提供高传热、高压、高工作温度，接近的邻近温度(close approach temperature)。特别是，它完全没有垫圈，这提供了防止在高压和高温下泄漏的安全性。
绝热轮式热交换器(adiabatic wheel heat exchanger)：第四种类型的热交换器使用中间流体或固体储存器来保持热量，然后热量被移动到热交换器的另一侧以被释放。其中的两个例子是绝热轮(adiabatic wheels)，其由一大轮件和多个流体热交换器所组成，所述大轮件具有旋转通过冷热流体的细线。
板翅式(plate and fin)热交换器：这种类型的热交换器使用含有翅片的“夹层(sandwiched)”通道来增加单元的效率。这些设计包括横流和逆流，以及各种翅片配置，如直翅片(straight fin)、偏置鳍片(offeset fin)和波浪鳍片(wavy fin)。
板翅式热交换器通常由铝合金制成，具有很高的传热效率。所述材料使系统能够在较低的温差下运行并减轻装置的重量。板翅式热交换器主要用于低温用途，如天然气、氦气和氧气液化厂、空气分离设备和运输工业，如马达和飞机发动机。
板翅式热交换器的优点：
传热效率高，特别是在气体处理方面
传热面积更大
重量比壳管式热交换器轻约5倍。
能够承受高压
板翅式热交换器的缺点：
由于通道非常狭窄，可能会导致堵塞
难以清洁通路
铝合金易受汞液体脆化失效的影响
枕板式热交换器：枕板式热交换器是乳制品行业中常用的冷却牛奶的大型直膨式(direct-expansion)不锈钢散装贮罐(bulk tanks)。所述枕板允许在贮罐的几乎整个表面区域上进行冷却，在焊接到贮罐外部的多个管道之间不会出现间隙。
枕板是通过使用一薄金属片所构成，所述薄金属片被点焊在另一块较厚金属板表面。薄板以规则的点状图案或焊接线的蛇形图案而被焊接。在焊接之后，用足够的力对封闭空间加压，使薄金属在焊缝周围凸出，为热交换器液体提供流动空间，并产生由金属形成的膨胀枕头的特征外观。
流体热交换器：这是一种热交换器，其具有气体向上通过一阵流体(通常是水)，然后在冷却之前将流体带到别处。这通常用于冷却气体，同时还去除某些杂质，从而一次解决两个问题。它广泛用于浓缩咖啡机，作为冷却过热(super heated)水的节能方法，用于提取浓缩咖啡。
废热回收装置：废热回收装置(waste heat recovery units，WHRU)是一种热交换器，可从热气流中回收热量，同时将其转移到工作介质，通常是水或油。热气流可以是来自燃气轮机或柴油发动机的废气或来自工业或炼油厂的废气。
具有高容量和高温气流的大型系统(在通常工业中)可以受益于WHRU中的蒸汽朗肯循环(steam rankine cycle，SRC)，但是这些循环对于小型系统来说太昂贵。从低温系统回收热量需要与蒸汽不同的工作流体。
有机朗肯循环(organic rankine cycle，ORC)WHRU在低温范围内使用制冷剂(refrigerant)是更有效，所述制冷剂在低于水的温度下沸腾。典型的有机制冷剂是氨(Ammonia)、五氟丙烷(Pentafluoropropane，R-245fa和R-245ca)和甲苯(Toluene)。
制冷剂由蒸发器中的热源煮沸，产生过热(super-heated)蒸汽。此流体在涡轮机(turbine)中膨胀以将热能转换成动能，所述动能在发电机中转换成电能。所述能量传递过程降低了制冷剂的温度，而制冷剂接着冷凝。使用泵将流体送回蒸发器，以将循环结束并完成。
动态刮面热交换器：另一种热交换器称为“(动态)刮面热交换器((dynamic)scraped surface heat exchanger)”。这主要用于高粘度产品、结晶过程、蒸发和高污染应用的加热或冷却。由于连续刮擦表面，因此可以实现长的运行时间，从而避免结垢，并在所述过程中实现可持续的传热速率。
相变热交换器(phase-change heat exchaner)：除了在一阶段加热或冷却流体外，热交换器还可用于加热液体以蒸发(或沸腾)或用作冷凝器以冷却蒸汽并将其浓缩成液体。在化工厂和炼油厂，用于加热蒸馏塔进料的再沸器(reboiler)通常是此热交换器。
蒸馏装置通常使用冷凝器将馏出物蒸气冷凝回液体中。
使用蒸汽驱动涡轮机的发电厂通常使用热交换器将水煮沸成蒸汽。用于从水中产生蒸汽的热交换器或类似装置通常称为锅炉(boiler)或蒸汽发生器。
在称为压水反应器(pressurized water reactors)的核电站中，特殊的大型热交换器将热量从初级(反应器装置)系统传递到次级(蒸汽装置)系统，在此过程中从水中产生蒸汽。这些被称为蒸汽产生器(steam generator)。所有使用蒸汽驱动涡轮机(steam-driven turbines)的化石燃料和核电站都具有表面冷凝器，以将来自涡轮机的废蒸汽转换成冷凝物(水)以便重复使用。
为了节省化学和其他工厂的能量和冷却能力，再生热交换器可以将热量从必须冷却的流体转移到必须加热的另一流体，例如馏出物的冷却以及再沸器进料的预热。
所述术语还可以指在其结构内包含具有相的改变(change of phase)的材料的热交换器。由于这些状态之间的体积差异小，这通常是固态到液态。这种相位变化有效地起缓冲作用，因为其发生在恒定温度下，但仍允许热交换器接受额外的热量。已经研究过的一例子是用于高功率飞行器的电子设备。
在多相流动状态下起作用的热交换器可能会受到Ledinegg不稳定性的影响。
直接接触热交换器：直接接触热交换器涉及在没有分隔壁的情况下，两相的热流和冷流之间的热传递。因此，这种热交换器可分类为：
气相-液相
不混溶的液相-液相
固相液相或固相气相
大多数直接接触热交换器属于气相-液相类别，其中热量以液体、薄膜或喷雾的形式在气体和液体之间传递。
这种类型的热交换器主要用于空调、加湿、工业热水加热、水冷和冷凝设备。
表1
相 连续相 驱动力 向的改变 示例
气相液相 气相 重力 无 喷射柱，填充柱
是 冷却塔，落下的液滴蒸发器
推动 无 喷雾冷却器/淬火器
液体流 是 喷雾冷凝器/蒸发，喷射冷凝器
液相 重力 无 气泡柱，穿孔托盘柱
是 气泡柱冷凝器
推动 无 气体分布器
气体流 是 直接接触式蒸发器，浸没式燃烧
微通道热交换器、微热交换器、微型热交换器或微结构热交换器是多种热交换器，其中(至少一种)流体在横向局限结构中流动，典型尺寸小于1mm。最典型的这种局限结构是微通道，其是水力(hydraulic)直径小于1毫米的通道。微通道热交换器可以由金属、陶瓷，甚至低成本塑料制成。微通道热交换器可用于许多应用，包括：
高性能飞行器燃气涡轮发动机
热泵
空调
热回收换气器
螺旋线圈热交换器：虽然双管热交换器是最简单的设计，但在下列情况下更好的选择是螺旋线圈热交换器(HCHE)：
与SHE(壳式热交换器)一样，HCHE的主要优点是高效利用空间，特别是当空间有限且没有足够的直管铺设时。
在低流速(或层流)的条件下，使得典型的管壳式换热器具有低的传热系数并变得不经济。
当其中一种流体存在低压时，通常来自其他制程设备中的累积压降。
当其中一种流体含有多相组分(固体、液体和气体)时，这会在操作过程中产生机械问题，例如堵塞小直径管。对于这些多相流体，清洗螺旋线圈可能比它的壳管对应物更难。然而，螺旋线圈单元需要较少的清洁。
自1970年代早期以来，这些已被用于核工业中作为用于大型液态金属快速中子增殖反应器的钠系统中的热交换的方法，使用由Charles E.Boadman和John H.Germer发明的HCHE装置。有几种简单的方法可以为所有类型的制造业设计HCHE，例如使用来自印度的Ramachandra K.Patil(等人)的方法和来自美国的Scott S.Haraburda的方法。
然而，这些是基于估计内部传热系数的假设、预测线圈外部周围的流动以及恒定热通量(heat flux)。然而，最近的实验数据显示，经验相关性与设计圆形和方形模式的HCHE非常相符合。在2015年发表的研究中，一些研究人员发现，交换器外壁的边界条件基本上是电厂锅炉、冷凝器和蒸发器中恒定的热通量条件；而对流传热条件更适合食品、汽车和加工工业。
在本发明的实施例中，所述系统包括一专用部件，用于一热交换器形式的介质的热保存，所述热交换器选自于：壳管式热交换器、板热式交换器、板壳式热交换器、绝热轮式热交换器、板翅式热交换器、枕板式热交换器，流体热交换器、余热回收单元、动态刮面热交换器、相变热交换器、直接接触热交换器、微通道热交换器、螺旋线圈热交换器，螺旋热交换器及其任意组合。
透析器：
透析器是配备有半透膜并用于进行透析的机器。透析是溶质通过半透膜从膜的一侧上具有较高溶质浓度的液体扩散到另一侧上具有较低浓度的液体的过程。膜是半透性的，因为它们允许一些分子通过而防止其他分子通过。所述方法长期以来一直用于小分子与大分子的分子分离(www.dot.spectrumlabs.dot.com/lit/abc.dot.pdf，以下作为参考)和体外支持(肾透析，www.en.dot.wikipedia.dot.org/wiki/Dialysis，以下作为参考并入。)
常见的透析应用利用管状形式的膜，并涉及将“样品”置于膜内并在膜外部放置“缓冲液”。进行所述过程直至达到所需的分离程度。小于孔的分子最终将在两种溶液之间均匀分布。通常，选择非常大量的缓冲液，使得可渗透物质被大大稀释，因此在剩余的样品溶液中降低至非常小的浓度。通常，透析过程需要几个小时才能完成。
透析膜：透析膜开发的进展是作为研究的结果，通过血液透析、压力驱动而不是浓度梯度驱动的过程来缓解肾病。通过使用纤维素酯(cellulose ester)实现更高的膜渗透性。可以配制这些溶液以产生更宽范围的孔径。纤维素酯膜现在广泛用于临床和实验室透析。用于透析的膜具有100至300,000道尔顿(1至300kDa)的孔径。样品体积也已大大减少，以允许透析少量珍贵样品，特别是在需要维持酶活性的情况下。
影响透析率的因素：
分子量截留(cut off)和选择性：透析膜的特征在于截留分子量(molecularweight cut off，MWCO)。通过测试不同分子量的几种溶质的渗透程度来确定MWCO。膜的MWCO等级是指在17小时透析测试中保留90％的最小溶质的分子量。分子量截留等级是作为一指示，而不是对每种溶质的性能的绝对预测。应选择尽可能高的膜MWCO尺寸等级，以达到最大透析速率，同时仍防止所需溶质的损失。以保留(retention)对溶质分子量的形式，绘制MWCO测试的结果，将理想地产生S形曲线。曲线的陡度是膜选择性的测量。
通量(flux)和渗透率：实验室透析的驱动力是膜上的浓度差异。通量(或渗透速率)与浓度差成正比，即差异越大，速率越大。然而，透析率也受其他变量的影响，例如：
扩散系数：不同大小的分子以不同的速率通过膜。较大的分子具有较小的系数和较低的膜扩散速率。
分子形状和电荷：线性分子比球状分子渗透得更快。pH和离子强度也影响透析速率。
浓度极化：当分子扩散穿过膜时，它们首先通过样品本体溶液移动到膜表面。膜旁边的薄区域具有比本体溶液更高的溶质浓度。这种积聚被称为“浓度极化”，并且是由膜表面的小分子耗尽引起的。所述极化层引起分子穿过膜的运动的阻力。最后，在通过膜之后，分子经常遇到比溶液本体更高浓度的薄层，进一步减慢通过。在膜的任一侧上形成的这些层称为“流体边界层(bounary layers)”或“凝胶层(gel layers)”。
溶液的流动方向和搅拌：垂直(或正常)流动的样品和缓冲液可能导致膜堵塞。透析期间的样品和缓冲液混合可以减少这种现象。混合可以通过搅拌或使样品平行(或切向tangential)于膜来实现。平行流动促进了更高的渗透率。搅拌速率越高，透析速率越高(通过增加搅拌速率降低浓度极化)。
温度：较高的温度可促进更快速的分子运动，从而提高扩散速率。
膜厚度：膜性能影响透析率。较厚的膜需要较长的时间才能使分子通过。
膜表面积：膜面积越大，透析率越快。
流体动力学特性：流体粘度和膜孔隙率影响渗透速率。低粘度和高孔隙率是更高速率的理想选择。
MWCO选择：选择膜的正确分子量截留值(molecular weight cut of，MWCO)是根据待保留在膜内的大分子的分子量的大小和待除去的分子的分子量。两个分子量的比例应至少为25比1，以实现最大90％的保留。
管状膜“扁平宽度”选择：较小的管道将比较大的管道透析更快。由于后者所涉及的扩散距离较长，透析将更慢。
白蛋白(albumin)是生长因子、激素和脂肪酸的主要载体蛋白，是液体培养基的主要成本驱动因素。本发明的系统任选地并且优选地设计成保留白蛋白(MW约66.4kDa)，可用目标MWCO为30kDa实现。
在本发明的实施例中，所述系统包括透析器，其表面的膜面积为15至20,000平方公分，截留分子量为10至60kDa。
透析液；
透析液或扩散液是透析过程中的液体和溶质，在透析过程中穿过膜。
在本发明的实施例中，所述系统包括在无血清培养基中含有葡萄糖、胰岛素和生长因子的透析液。取决于在腔室中生长的细胞类型，制备不同含量的透析液以响应生长细胞的特定需求。
过滤：
过滤可以根据本发明的一些实施例，通过可以去除污染物和杂质的任何类型的过滤器实现。代表性实例包括但不限于碳过滤器和沸石过滤器。
碳过滤器是一种过滤器的方法，它使用活性炭床去除污染物和杂质，使用化学吸附(www.en.dot.wikipedia.dot.org/wiki/Carbon_filter，在下文中引入作为参考)。
每个颗粒(particle/granule)的碳提供大的表面积/孔结构，允许污染物最大可能暴露于过滤器介质内的活性位点。一磅(454克)活性炭的表面积约为100英亩(40公顷)。
活性炭通过称为吸附的过程起作用，由此待处理流体中的污染物分子被捕获在碳基质的孔结构内。碳过滤器通常用于水净化、空气净化器和工业气体处理，例如从沼气中除去硅氧烷和硫化氢。它还用于许多其他应用，包括呼吸器面罩，甘蔗的净化和贵金属的回收，特别是金。活性炭过碳器在去除水中的氯、沉淀物、挥发性有机化合物(VOC)、味道和气味方面最有效。它们不能有效去除矿物质、盐和溶解的无机化合物。
可通过碳过滤器除去的典型粒度范围为0.5至50微米。粒度将作为过滤器描述的一部分。碳过滤器的功效也根据流速控制。当允许水以较慢的速率流过过滤器时，污染物暴露于过滤器介质较长时间。
在过滤工业中使用了两种主要类型的碳过滤器：粉末状块过滤器和粒状活化过滤器。通常根据增加的碳表面积，碳块过滤器在去除大量污染物方面更有效。许多碳过滤器也使用诸如银的二次介质来防止过滤器内的细菌生长。或者，活性炭本身可以用银浸渍以提供这种抑菌特性。
影响活性炭性能的因素有(www.dot.watertreatmentguide.dot.com/activated_carbon_filtration.dot.htm，在下文中引入作为参考)。
分子量：随着分子量的增加，活性炭吸附更有效，因为分子在水中可溶。然而碳的孔结构必须足够大以允许分子在其内迁移。应设计高分子量和低分子量分子的混合物，以去除更难的物质。
pH：大多数有机物溶解度较低，在较低pH值下更容易吸附。随着pH增加，去除率降低。根据经验，对于高于中性(7.0)的每个pH单位，增加碳床的尺寸20％。
污染物浓度：污染物浓度越高，活性炭的去除能力越强。污染物分子更可能扩散到孔隙中并被吸附。然而，随着浓度的增加，污水泄漏也会增加。污染物的上限是百万分之几百部分。较高的污染物浓度可能需要与活性炭更多的接触时间。此外，通过在水中存在硬度来增强有机物的去除，因此只要有可能，将活性炭单元放置在离子去除单元的上游。无论如何通常都是这种情况，因为活性炭通常在离子交换器或膜的上游使用以除去氯。
粒径：活性炭通常有8×30网眼(mesh)(最大)、12×40网眼(mesh)(最常见)和20×50网眼(最细)。更细的网眼提供最佳的接触和更好的去除，但代价是更高的压降。这里的经验法则是，8×30网眼比12×40网眼的去除效果好2到3倍，动力学去除效果比8×30网眼高10到20倍。
流速：通常，流速越低，污染物扩散到孔中并被吸附的时间就越长。通过较长的接触时间几乎总能改善活性炭的吸附。同样，一般而言，20×50网眼目的碳床可以以12×40网眼的碳床的两倍流速运行，并且12×40网眼的碳床可以以8×30网眼的碳床的两倍流速运行。
温度：较高的水温会降低溶液粘度，并可增加扩散速率，从而增加吸附。较高的温度也会破坏吸附键并略微降低吸附。其取决于被除去的有机化合物，但通常较低的温度似乎有利于吸附。
在本发明的实施例中，所述系统包括碳过滤器，其适于清除在分析液中存在的毒素。
当采用沸石(zeolite)过滤装置时，进入系统200的灌注溶液部分通过沸石以吸收溶液中的氨。优选使用粒状沸石。术语沸石旨在包括具有微孔结构的水合硅铝酸盐矿物(hydrated aluminosilicate minerals)。在火山岩和灰层与碱性地下水反应的地方形成天然沸石。适用于本发明的粒状沸石可以例如来自Zeolite Australia Pty Ltd(PO Box6Werris Creek NSW 2341，Australia)。
传感器：
在本发明的优选实施例中，系统1000包括一或多个有源传感器(图1中未显示，参见图9)，其允许连续监测在其中生长的细胞。传感器的一些示例包括但不限于温度传感器、pH传感器、体积传感器、视频装置、流量传感器、光学传感器、重量传感器、葡萄糖传感器和蛋白质含量传感器。
在本发明的一优选的实施例，所述系统被连接到主计算机，其具有一非暂时性计算机可读介质(non-transitory computer readable medium，CRM)，其自动操作系统的所有必需元件和提供实时报警到专用操作器。主计算机可以通过互联网/云端服务远程连接和操作。在第二实施例的系统是自包含的，来自传感器的数据被本地中央处理单元(CPU)处理，其改变输入参数，例如营养物、流量、压力或温度，以调整细胞生长和传感器信号至期望的参数集内，而维持生长稳态(homeostasis)。
在本发明优选的实施例中，所述系统包括封闭循环灌注回路，所述灌注回路由用于营养和毒素交换的初级灌注回路和二级透析回路组成。初级回路包括培养基灌注溶液，其使用蠕动泵通过夹套细胞生长腔室、膜式氧合器，热交换器和气泡捕捉器而被再次循环。氧合器用80％O2、5％CO2、15％N2的混合物充气，保持恒定的pH。一部分灌注溶液通过具有2200平方公分的膜面积和30kDa截留分子量的透析器以3毫升/分钟/克细胞的速率转移到二次回路。二级回路通过逆流暴露于无蛋白质的透析液对灌注溶液进行透析，使用第三蠕动泵通过一碳过滤器被再次循环。系统内的温度保持在37℃。所有的系统
细胞类型：
可以在本发明公开的封闭循环灌注回路中生长几种类型的细胞。
主要细胞来源：
鸡类胚胎成纤维细胞广泛用于病毒和疫苗的生产。与鸡类胚胎肝细胞一起，其由特定的无病原体(SPF)胚胎产生，并由Charles River Laboratories(Wilmington，MA)和其他公司生产。虽然鸡类肝细胞在培养物中显示出有限的增殖，但如同它们的哺乳动物对应物，鸡类成纤维细胞可以经历超过30次群体倍增，产生约2.6吨细胞，然后自发永生化而不会发生致瘤性。自发转化的鸡类成纤维细胞，例如本发明人产生的CSIF细胞系(例如如下文实施例部分的实施例5中所述)、UMNSAH/DF-1(CRL-12203)可直接从ATTC购买(Manassas)，VA)。虽然成纤维细胞的生长潜力很好，但细胞主要形成不可食用的结缔组织。
鸡类胚胎内皮细胞可以很容易地分离，但它们的生长潜力是未知的并且可以是器官特异性的。小鼠微血管细胞可以进行30次群体倍增，而人类细胞很少通过12次群体倍增。鸡类胚胎肌细胞(肌细胞)可以是相似的分离但具有非常有限的生长潜力。小鼠和人类细胞很少通过12次群体倍增。在大多数物种中在新生儿阶段之后，肌肉生成(myogenesis，即新肌肉组织的形成)并不常见。小分子在概念上可用于调节这种行为。
多能干细胞来源：
在过去的十年中，许多小组生产了鸡类胚胎干细胞(cESC)(3)。细胞从受精的鸡蛋中分离出来，基本上是不朽的。通过重编程因子OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、KLF4和C-MYC(4)从鹌鹑胚胎成纤维细胞，以及最近使用OCT4、KLF4和C-MYC从鸡类成纤维细胞，产生鸡类诱导的多能干细胞(ciPSC)(5))
。细胞基本上是永生的，但是是基因工程修改过的。
最近使用小分子(6)从成纤维细胞诱导小鼠多能干细胞，允许多种细胞类型的分化，包括肌细胞、肝细胞和内皮细胞以及复杂的胚状体。ciPSC的化学诱导提供将成纤维细胞转化为其他细胞类型的替代方法。
基于小分子的重编程(small molecule-based reprogramming)：
化学化合物为生长因子和基因工程提供了有吸引力的替代方法，通常用于支持细胞生长，或通过重编程或分化将一种细胞类型转换为另一种细胞类型。小分子较便宜，批次间差异较小，无免疫原性且更稳定。在一项研究中，Shan及其同事使用高含量筛选以鉴定FPH1和FPH2，这是促进原代人类肝细胞增殖的小分子(7)。这种方法很有吸引力，因为小分子可以取代生长因子无血清培养基配方，大大降低了成本，同时提高了安全性。
在最近的一项研究中，Cao及其同事发现9种化合物可诱导人成纤维细胞转变为心肌细胞(8)，而其他化合物则使用7种化合物组合转化小鼠细胞(9)。考虑到许多信号传导途径是保守的，可以使用相对类似的组合将鸡类成纤维细胞转化为肌细胞。
动物产品免费培养基：
如上所述，细胞培养基通常含有胎牛血清(FBS)，其提供附着因子、脂肪酸、生长因子、激素和白蛋白。除转铁蛋白、胰岛素和富含脂质的牛血清白蛋白外，FBS通常可以替换为由氨基酸、维生素和微量元素组成的血清替代物(例如KO血清)。虽然转铁蛋白和胰岛素都是使用重组技术在细菌中产生的，但白蛋白通常是动物来源的。然而，植物和细菌衍生的重组人白蛋白(例如CellastimTM)可通过几家公司获得，包括Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
鸡成纤维细胞培养基传统上由补充有10％FBS、磷酸胰蛋白胨(tryptosephosphate)和谷氨酰胺(glutamine)的M199培养基组成。然而，现在可以容易地获得用于哺乳动物成纤维细胞生长的无血清培养基。培养基由M199组成，补充0.5毫克/毫升白蛋白、0.6微膜耳浓度亚油酸、0.6微克/毫升卵磷脂、5纳克/毫升bFGF、5纳克/毫升EGF、30皮克/毫升TGFβ1、7.5维摩尔浓度谷氨酰胺、1微克/毫升氢化可的松，50微克/毫升抗坏血酸和5微克/毫升胰岛素。所述培养基PCS-201-040可从ATCC(Manassas，VA)获得，据报导其支持人成纤维细胞增殖4倍。鸡类肝细胞类似地由为人和小鼠肝细胞设计的无血清培养基支持。培养基由Williams E基础培养基组成，补充有白蛋白、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松。
灌注的培养基还可包括氧载体。基于血红蛋白的氧载体(www.en.dot.wikipedia.dot.org/wiki/Haemoglobin-based_oxygen_carriers，在下文中作为参考)包括重组或化学修饰的血红蛋白衍生物，包封的血红蛋白或修饰的(例如交联的)红血球。替代品包括基于全氟化碳(Perfluorocarbon)的替代品，例如在Nahmias等人的开发。(11)(www.en.dot.wikipedia.dot.org/wiki/Blood_substitute#Current_therapeutics，以下并入作为参考)。
本发明人发现自发永生化的成纤维细胞，例如鸡类成纤维细胞，可用于在体外产生脂肪和肌肉细胞，用于产生可食用的肉。此外，本发明人发现，原代或自发永生化的内皮细胞可以与肌肉和脂肪细胞共培养，以形成具有血管样网络(组织血管)的可食用肉，其中内皮细胞用作血管。用于转移营养物和气体，例如葡萄糖和氧气。以下实施例部分的实施例5证明了分离和产生自发永生化的鸡类胚胎成纤维细胞系，其具有18±2小时的倍增时间和至少90次群体倍增(PD)(图2E)。另外，如下面实施例部分的实施例6中进一步描述的，本发明人通过努力的实验产生了一种无血清培养基，所述培养基能够在没有任何动物/或人类污染物的情况下维持自发永生化的鸡类成纤维细胞系，同时使成纤维细胞保持增殖状态至少90次群体倍增(图3B-F)。本发明人进一步设想小分子可以替代无血清培养基中包含的至少一些组分(下面的实施例部分的实施例2、3和6)。本发明人能够成功地产生功能完整的脂肪细胞，其特征在于紧密(非延长)形状，并且从自发永生化鸡类胚胎成纤维细胞系在一明确的无血清培养基中累积中性脂质含量，所述无血清培养基包含油酸和激活PPAR-γ的小分子，例如IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine)或罗格列酮(Rosiglitazone)(图4A至图4D，实施例7)。本发明人通过上调自发永生化鸡胚胎成纤维细胞系内的MyoD1和/或肌细胞生成素多肽的表达水平和活性进一步产生了肌细胞(实施例3和实施例8，图6至图8、12和图5A至图E)。另外，如下面实施例部分的实施例3和实施例8中所述，本发明人描述了一种小分子筛选方法，所述小分子能够将自发永生化鸡类胚胎成纤维细胞系转化为肌细胞，所述筛选方法使用大鼠肌球蛋白轻链-3启动子-增强子报导构建体(rMLC3-GFP；图8)。此外，本发明人显示自发永生化的内皮细胞(例如达到至少120次群体倍增；实施例11)，其在无血清和无抗生素的培养基中与自发永生化的成纤维细胞系共培养(实施例12)形成血管网络形成和紧密的细胞与细胞的相互作用(图11A至图11C)。此外本发明人描述了一种基于杂交植物的肉类替代产品，其具有体外产生的脂肪(实施例9)，以及来自培养的成纤维细胞的肉饼或肉块，其被诱导分化成悬浮培养物中的肌肉和/或脂肪细胞，所述悬浮培养物中不具有微载体(实施例10)。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种从成纤维细胞产生脂肪细胞的体外方法，包括在一无血清培养基中培养一自发永生化的成纤维细胞，所述无血清培养基含有油酸以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma，PPAR-γ)激动剂(agonist)或其激活剂(activator)，从而产生脂肪细胞。
如本文所用，短语“自发永生化的成纤维细胞”是指能够进行无限细胞分裂，优选地能够进行细胞扩增的成纤维细胞，而不受人为诱导，例如遗传操作，而导致永生化。
应当注意，通常原代成纤维细胞能够进行有限的细胞分裂，因此在约30次群体倍增(例如10次传代)后经历细胞衰老。产生永生化成纤维细胞系的方法包括通过使用已知方法引入端粒酶(telomerase)基因或SV40或HPVE6/E7基因进行遗传操作。
根据本发明的一些实施例，所述成纤维细胞是禽类成纤维细胞。
根据本发明的一些实施例，所述禽类选自：鸡、鸭、鹅和鹌鹑。
根据本发明的一些实施例，所述成纤维细胞是鸡类胚成纤维细胞。
根据本发明的一些实施例，所述自发永生化的成纤维细胞是非遗传修饰的。
如本文所用，短语“非遗传修饰的”是指不经受细胞的人造遗传操作(例如，转化(transformation))。
PPAR是转录因子的核受体超家族(nuclear receptor superfamily)的亚家族，在脂质和葡萄糖代谢中起重要作用，并且涉及肥胖相关的代谢疾病，例如高脂血症、胰岛素抵抗和冠状动脉疾病。
PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)是PPAR亚家族的脂肪酸活化成员。它在大多数生理系统中以低水平表达，包括中枢神经系统(CNS)、内分泌系统、胃肠系统、生殖系统、心肺系统和代谢组织，但在棕色和白色脂肪组织中表达最高(Elbrecht A，等人，1996；“人过氧化物酶体增殖物激活受体γ1和γ2的分子克隆、表达和表征(Molecular cloning,expression and characterization of human peroxisome proliferator activatedreceptors gamma 1 and gamma 2)”，生物化学生物生理学研究学会Biochem.Biophys.Res.Commun.224 431-7V)。
如本文所用，短语“PPAR-γ激活剂”是指诱导PPAR-γ信号传导途径导致PPAR-γ活化的药剂。
根据本发明的一些实施例，PPAR-γ的激活剂不需要直接结合PPAR-γ的配体(ligand)结合域，但可以诱导PPAR-γ信号传导途径，从而通过内源(多个)配位体激活PPAR-γ。
例如PPAR-γ激活剂(activator)可以是PPAR-γ激动剂(agonist)。
如本文所用，短语“PPAR-γ激动剂”是指结合PPAR-γ的配体结合域的试剂。
应当注意，在激动剂与PPAR-γ的配体结合域结合后，PPAR-γ蛋白经历结构变化，导致PPAR-γ的活化。
例如，可以通过监测PPAR-γ目标基因的表达来检测PPAR-γ(转录因子)的激活。
鉴定PPAR-γ的激动剂或激活剂的方法包括但不限于使用GAL4-PPAR-γ报导物，LanthaScreen TR-FRET竞争性结合测定法(ThermoFisher，PV4894)，使用由PPAR反应元件(PPRE)驱动的GFP-报告物，或通过检查目标基因的表达，基本上如Goldwasser等人所述，PLoS One 2010,Volume 5,Issue 8,e12399，其通过引用完全并入本文)。
PPARγ(γ)目标基因的非限制性实例包括与脂肪生成有关的基因(例如ADIPOQ、LPL、NR1H3和UCP1)；与脂肪酸代谢相关的基因(例如ACADL、ACADM、ACOX1、ACOX3、ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5、CPT1A、CPT1B、CPT2、CYP27A1、CYP4A11、CYP7A1、EHHADH、FADS2、GK和SCD)；与脂质传输相关的基因(例如ADIPOQ、ANGPTL4、APOE、DGAT1、LPL、NR1H3和OLR1)；与细胞增殖有关的基因(例如CLU、ELN、HSPD1和TXNIP)；与胰岛素信号传导相关的基因(例如CPT1A、DGAT1、PCK1和SORBS1)和其他基因如MMP9和PCK1。
根据本发明的一些实施例，PPAR-γ激动剂或活化剂是小分子。
根据本发明的一些实施例，小分子选自噻唑烷二酮(Thiazolidinedione)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、芬那米尔(phenamil)、GW7845、RG14620和哈尔明碱(Harmine)。
噻唑烷二酮(也称为“格列酮(Glitazones)”)是一类通过激活PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)起作用的药物，对PPARγ具有最高特异性(PPAR-γ、PPARG)。这些受体的内源配体是游离脂肪酸(FFA)和类二十烷酸(eicosanoids)。
根据本发明的一些实施例，噻唑烷二酮的浓度范围为约20纳摩尔浓度至约120微摩尔浓度，例如50纳摩尔浓度至100微摩尔浓度，例如100纳摩尔浓度至50微摩尔浓度，例如从1微摩尔浓度到50微摩尔浓度，例如在0.5-30微摩尔浓度的范围内，例如，在0.5-25微摩尔浓度的范围内，例如约0.5微摩尔浓度、约1微摩尔浓度、约5微摩尔浓度、约10微摩尔浓度、约15微摩尔浓度。
根据本发明的一些实施例，噻唑烷二酮选自吡格列酮(Pioglitazone，Actos)、罗格列酮(Rosiglitazone，Avandia)、洛贝格列酮(Lobeglitazone，Dulie)、曲格列酮(Troglitazone，Rezulin)、席格列酮(Ciglitazone)、达格列酮(Darglitazone)、英格列酮(Englitazone)、内投格列酮(Netoglitazone)和雷佛曲格列酮(Rivoglitazone)。
根据本发明的一些实施例，所述小分子是罗格列酮。
根据本发明的一些实施例，所述罗格列酮的浓度为1至10微摩尔浓度，例如约5微摩尔浓度。
根据本发明的一些实施例，曲格列酮的浓度为0.5至10微摩尔浓度，例如约0.5至5微摩尔浓度，例如约1微摩尔浓度。
根据本发明的一些实施例，PPAR-γ激动剂或活化剂是硒(selenium)。
油酸是天然存在的脂肪酸，被分类为单元不饱和的ω-9脂肪酸，缩写为18：1顺式-9的脂质。
根据本发明的一些实施例，在本发明的一些实施例的无血清培养基中使用的油酸浓度为约50微摩尔浓度至约1000微摩尔浓度，例如200至400微摩尔浓度。
根据本发明的一些实施例，成纤维细胞的培养至少4天、例如至少5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天或更多天。
应该注意的是，为了产生培养的可食用肉，产生脂肪细胞的方法中使用的培养基应该是明确的，并且是无血清的。可以通过使用重组和/或合成和/或纯化的试剂来制备明确的培养基。由于血清是从活生物体(例如人或动物)获得的，因此它可以进行批次之间的变化，并且可以进一步包括动物或人类污染物，例如细菌、病毒或真菌感染。因此优选使用无血清培养基。
根据本发明的一些实施例，所述无血清培养基不含动物污染物。
根据本发明的一些实施例，所述无血清培养基不含人污染物。
根据本发明的一些实施例，所述无血清培养基不含任何抗生素药物。
根据本发明的一些实施例，对于所述脂肪细胞分化，所述无血清培养基可包括胰岛素，并且任选地还包括bFGF。
根据本发明的一些实施例，对于所述脂肪细胞分化，所述无血清培养基可包括硒，并且任选地还包括胰岛素。
根据本发明的一些实施例，用于培养自发永生化鸡类成纤维细胞的所述无血清培养基包含胰岛素或其替代物、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF)或其替代物，和至少一种选自由地塞米松(dexamethasone)、转铁蛋白(transferrin)、硒(selenium)、表皮生长因子(epidermal growth factor、EGF)或其替代物和前列腺素E2(PGE2)所组成的一组。
如本文所用，术语“胰岛素”是指具有A炼和B链的成熟胰岛素多肽，其通过两个二硫键共价连接。又称CAS编号11061-68-0；EC编号234-279-7；MDL编号MFCD00131380。前体多肽前胰岛素(precursor polypeptide preproinsulin)被切割以去除前体信号肽，然后所述胰岛素原(proinsulin)被翻译后切割成三个肽：B链肽和A链肽，其通过两个二硫键共价连接形成胰岛素，和C肽。胰岛素与胰岛素受体(INSR)的结合刺激葡萄糖摄取。有4种多肽变体，编码相同的蛋白质：变体1[GenBank登录号NM_000207.2(SEQ ID NO：13)、GenBank登录号NP_000198.1(SEQ ID NO：14)]、变体2[GenBank登录号NM_001185097.1(SEQ ID NO：15)、GenBank登录号NP_001172026.1(SEQ ID NO：16)]、变体3[GenBank登录号NM_001185098.1(SEQ ID NO：17)、GenBank登录号NP_001172027.1(SEQ ID NO：18)]和变体4[GenBank登录号NM_001291897.1(SEQ ID NO：19)、GenBank登录号NP_001278826.1(SEQ ID NO：20)]。胰岛素可以从各种供应商提供，例如Sigma-Aldrich(例如重组人胰岛素目录号91077C)。
根据本发明的一些实施例，胰岛素替代物包含IGF-1(Sigma 1146)或稳定的长R3IGF-1(Sigma I1271)。
根据本发明的一些实施例，胰岛素以2.5×10-5IU/毫升至1IU/毫升的浓度提供，例如在0.1IU/毫升至约0.5IU/毫升之间，例如约0.24至0.3IU/毫升。应注意IU/毫升是“每毫升国际单位”的缩写。
地塞米松(Dexamethasone)是一种皮质类固醇药物，可从各种供应商处获得，例如Ark Pharm，Inc.，Sigma-Aldrich，Parchem和AvaChem Scientific。
根据本发明的一些实施例，地塞米松以约0.01纳摩尔浓度至约100微摩尔浓度提供，例如约0.01纳摩尔浓度至约10微摩尔浓度，例如4纳摩尔浓度至约10微摩尔浓度，例如在70至120纳摩尔浓度之间，例如约100纳摩尔浓度(0.1微摩尔浓度)。
根据本发明的一些实施例，所述培养基包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或其替代物，例如FGF-信号传导途径的小分子或合成激动剂。
碱性成纤维细胞生长因子(也称为bFGF、FGF2或FGF-β)是成纤维细胞生长因子家族的成员。BFGF[(例如人类bFGF多肽GenBank登录号NP_001997.5(SEQ ID NO：21)；人类bFGF多核苷酸GenBank登录号NM_002006.4(SEQ ID NO：22)]可以从各种商业来源获得，例如Canton，MA，USA(如目录号CRF001A和CRF001B)、InvitrogenCorporation产品，Grand Island NY，USA(如目录号：PHG0261、PHG0263、PHG0266和PHG0264)、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.Rehovot，以色列(如目录号：CYT-218)和Sigma，St Louis，MO，USA(如目录号：F0291)。
根据本发明的一些实施例，bFGF以0.1至100纳克/毫升的浓度提供，例如约0.1至30纳克/毫升、例如约0.2至80纳克/毫升、例如约0.4至70纳克/毫升、例如约0.5至60纳克/毫升、例如约0.8至50纳克/毫升、例如约1纳克/毫升至约40纳克/毫升、例如约1至20纳克/毫升、例如约2至20纳克/毫升、例如约3至20纳克/毫升、例如约4至15纳克/毫升、例如约10纳克/毫升。
根据本发明的一些实施例，FGF信号传导的合成激动剂是C19-jun。
根据本发明的一些实施例，C19-jun以约1纳克/毫升至约50纳克/毫升的浓度提供，例如在10至20纳克/毫升的范围内。
根据本发明的一些实施例，转铁蛋白以约0.1纳克/毫升至约55微克/毫升的浓度提供，例如约10纳克/毫升至约10微克/毫升，例如1至10微克/毫升，例如5.5微克/毫升的转铁蛋白。
根据本发明的一些实施例，硒以约0.1纳克/毫升至约6000微克/毫升的浓度提供。例如为了支持成纤维细胞生长，可以以约1至10纳克/毫升的浓度提供硒(例如约5纳克/毫升的硒以支持细胞生长)。或者为了从成纤维细胞诱导脂肪生成，可以以更高的浓度使用硒，例如200至1000微克/毫升，例如约500至800微克/毫升，例如约600微克/毫升以诱导成纤维细胞形成脂肪。
蛋白质的表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)超家族作为有效的促有丝分裂因子，其在许多细胞类型的生长、增殖和分化中扮演重要脚色。EGF可购自Peprotech(以色列，例如目录号AF10015)。
根据本发明的一些实施例，表皮生长因子(EGF)以0.1至30纳克/毫升的浓度提供，例如0.5至20纳克/毫升，例如1至10纳克/毫升，例如约5纳克/毫升。
根据本发明的一些实施例，EGF的替代物包含EGF-R激动剂。
根据本发明的一些实施例，EGF-R激动剂包含NSC-228155。
根据本发明的一些实施例，NSC-228155以约1纳克/毫升至约100纳克/毫升的浓度提供，例如约5至50纳克/毫升。
根据本发明的一些实施例，前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)以0.01纳摩尔浓度至10微摩尔浓度提供，例如，约0.1纳摩尔浓度至约1微摩尔浓度，例如约10纳摩尔浓度至约0.5摩尔浓度。例如约50微摩尔浓度至约0.5微摩尔浓度，例如约0.01微摩尔浓度。
本发明的一些实施例的方法使用的任何蛋白质因子(例如，胰岛素、bFGF、EGF、PGE2)可以被重组地表达或生物化学合成。另外，可以使用本领域熟知的方法从生物样品(例如，来自人血清，细胞培养物)中纯化天然存在的蛋白质因子，如bFGF。应注意，为了制备无动物污染物的培养基，蛋白质因子优选从人类源中纯化或被重组地表达。
可以使用标准固相(solid phase)技术进行本发明的蛋白质因子(例如胰岛素、bFGF、EGF、PGE2)的生物化学合成。这些方法包括排他性固相合成，部分固相合成方法，片段缩合和经典溶液合成。
本发明的蛋白质因子的重组表达可以使用重组技术产生，例如Bitter等人所著,(1987)酵素学中的方法Methods in Enzymol.153:516-544,Studier等人所著(1990)酵素学中的方法Methods in Enzymol.185:60-89,Brisson等人所著(1984)自然期刊Nature310:511-514,Takamatsu等人所著(1987)胚胎学期刊EMBO J.6:307-311,Coruzzi等人所著(1984)胚胎学期刊EMBO J.3:1671-1680,Brogli等人所著(1984)科学期刊Science 224:838-843,Gurley等人所著(1986)分子细胞生物学Mol.Cell.Biol.6:559-565以及Weissbach&Weissbach,1988,植物分子生物学的方法Methods for Plant MolecularBiology,学术期刊Academic Press,NY,Section VIII,pp 421-463。
用于合成脂肪酸、小分子如噻唑烷二酮(Thiazolidinediones，TZD)的方法是本领域已知的。
根据本发明的一些实施例，所述方法在体外进行。
因此本发明的一些实施例的方法导致成纤维细胞转化为脂肪细胞。
不受任何理论的束缚，转化(conversion)可以通过转分化(transdifferentiation)发生。
通过本发明的一些实施例的体外方法形成的脂肪细胞，通过培养自发永生化的成纤维细胞，显示天然存在的脂肪细胞的特征，例如具有紧凑的形状(不是细长的)，用Oil-O-Red染色为阳性，并显示具有中性脂质染色的脂滴(例如图4A至图4D所示)。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种脂肪细胞，其可以根据本发明的一些实施例的方法获得。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种在蛋白质基质上产生培养的脂肪的方法，包括根据本发明的一些实施例的方法产生由成纤维细胞产生的脂肪细胞，其中在植物来源的蛋白质基质上进行培养，从而在蛋白质基质上产生培养的脂肪。
根据本发明的一些实施例，植物来源的蛋白质基质来自豆科(legume)(蝶形花科Fabaceae)、来自谷科(cereal family)或来自假谷科(pseudocereal)。
根据本发明的一些实施例，植物来源的蛋白质基质来自豆科(legume)、蝶形花科(Fabaceae)，如苜蓿、豌豆、豆类、扁豆、角豆、豆、花生等。
根据本发明的一些实施例，植物来源的蛋白质基质来自谷类，例如玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、三叶草、芬尼奥谷(fonio)。
根据本发明的一些实施例，植物来源的蛋白质基质被选择为包括荞麦、藜麦或奇亚籽(chia)的假榖科植物。
根据本发明的一些实施例，植物来源的蛋白质基质包含大豆蛋白质或豌豆蛋白质。
根据本发明的一些实施例，植物来源的蛋白质基质来自大豆蛋白质或豌豆蛋白质。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了植物来源的蛋白质基质中的培养脂肪。
根据本发明的一些实施例，植物来源的蛋白质基质中的被培养的脂肪包括每克约1至1000万个细胞。
根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的培养脂肪可通过本发明的一些实施例的方法获得。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种从成纤维细胞产生肌细胞的体外方法，包括上调一自发永生化的成纤维细胞内的一多肽的表达，所述多肽选自于由myoD1和肌细胞生成素所组成的一群组。
上调多肽的表达水平和/或活性的方法是本领域公知的，包括重组DNA技术和/或基因组编辑方法，如下文进一步描述的。
根据本发明的一些实施例，所述上调是所述myoD1和肌细胞生成素的多肽的上调。
根据本发明的一些实施例，鶏类的所述myoD1的多肽由包括SEQ ID NO：5所示的核酸序列的一多核苷酸所编码。
根据本发明的一些实施例，鶏类的所述肌细胞生成素的多肽由包括SEQ ID NO：7所示的核酸序列的一多核苷酸所编码。
根据本发明的一些实施例，鶏类的所述myoD1的多肽由SEQ ID NO：1或3所示的核酸构建体所编码。
根据本发明的一些实施例，鶏类的所述肌细胞生成素的多肽由SEQ ID NO：2所示的核酸构建体所编码。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种肌细胞，所述肌细胞是根据本发明的一些实施例的方法获得的。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种在体外筛选能够产生肌细胞的小分子的方法，所述方法包括：
步骤a：用一核酸构建体转染一自发永生化的成纤维细胞，所述核酸构建体包含一核酸序列，所述核酸序列用以在特异性活化于多个肌细胞中的一启动子的一转录控制下编码一报导多肽；
步骤b：使在步骤a中转染的成纤维细胞与多种小分子的至少一种小分子接触；以及
步骤c：在步骤b之后检测所述转染的成纤维细胞中的所述报导多肽是否高于一预定阈值的活性，其中高于所述预定阈值的所述活性的存在表示所述至少一种小分子能够将所述自发永生化的成纤维细胞转化成为所述肌细胞。
根据本发明的一些实施例，所述成纤维细胞是禽类的成纤维细胞。
根据本发明的一些实施例，所述禽类选自于由鶏、鸭、鹅和鹌鹑所组成的一群组。
报导多肽的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein，BFP)，红色荧光蛋白(red fluorescentprotein，RFP)或黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)。
根据本发明的一些实施例，所述报导多肽是COP-GFP(例如图8中所示)。例如COP-GFP的编码序列可以是SEQ ID NO：12所示的核酸序列。
可用于检测所述报导多肽的荧光检测方法包括例如荧光激活流式细胞术(fluorescence activated flow cytometry，FACS)、免疫荧光共聚焦显微镜(immunofluorescence confocal microscopy)、荧光原位杂交(fluorescence in-situhybridization，FISH)和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)。
应该注意的是，自发永生化的成纤维细胞也可用于筛选而无需遗传修饰(例如，视觉上)，例如用抗体或染料。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种在体外产生一可食用肉的方法，其特征在于：所述方法包括：培养：
(a)一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一脂肪细胞的条件下；及/或
(b)另一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一肌细胞的条件下，
从而产生所述可食用肉。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种在体外产生一可食用肉的方法，其特征在于：所述方法包括：培养：
(a)一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一脂肪细胞的条件下；及/或
(b)一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一肌细胞的条件下；以及
(c)一内皮细胞，从而产生所述可食用的肉。
根据本发明的一些实施例，步骤a和步骤b在同一培养系统中同时进行。
根据本发明的一些实施例，步骤a和步骤b在两种不同的(分离的)培养系统中进行。
根据本发明的一些实施例，步骤a、步骤b和步骤c在同一培养系统中同时进行。
根据本发明的一些实施例，所述无血清培养基包含油酸和PPAR-γ激动剂。
根据本发明的一些实施例，所述内皮细胞是一自发永生化的内皮细胞。
根据本发明的一些实施例，所述内皮细胞是未经遗传修饰的。
根据本发明的一些实施例，所述培养在一支架(scaffold)上进行。
根据本发明的一些实施例，所述细胞粘附在所述支架上。
支架的非限制性实例包括但不限于各种海绵、基质(matrices)、水凝胶(hydrogels)或珠子(beads)；
合适的海绵的实例包括但不限于聚乳酸、聚乙醇酸或聚(乳酸-共-羟基乙酸)(poly(lactic-co-glycolic acid))(PLGA，Sigma P2191、P2066、P1941、430471、764868、790214、900289)、variotisTM(Biometic,AU)、CelluspongeTM(羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose)Bio-Byblos目录号Z741057)。
根据本发明的一些实施例，所述支架是可生物降解的。
根据本发明的一些实施例，所述培养在一灌注系统中进行。
根据本发明的一些实施例，所述培养在本发明的一些实施例所述的灌注系统中进行。
根据本发明的一些实施例，所述培养在一可食用的中空纤维筒(edible hollowfiber cartridge)上进行，其中在没有集成的血管网络的情况下营养供应均匀分布。例如，所述筒的纤维由可食用的天然或合成聚合物制成，例如纤维素(FiberCell，#C3008)、醋酸纤维素，并且细胞形成围绕纤维的团块。纤维素被FDA批准为GRAS，用于控制水分和切碎的起司、面包和各种酱汁的稳定剂。
根据本发明的一些实施例，所述培养在植物来源的基质上进行。
根据本发明的一些实施例，所述植物来源的基质来自谷物(cereal)、麸质(gluten)或豆类(legume)。
根据本发明的一些实施例，植物来源的基质选自豆科植物豆科(legume)(蝶形花科Fabaceae)，如苜蓿、豌豆、豆类、扁豆、角豆、大豆、花生等。或来自谷类(cereal)，如玉米、大米、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、三叶草、芬尼奥谷(fonio)；和/或来自包括荞麦、藜麦或奇亚籽(chia)的假榖科植物家族。
根据本发明的一些实施例，所述豆科是大豆或豌豆。
根据本发明的一些实施例，所述培养在没有基质粘附的一悬浮培养基中进行，细胞不与支架、基质、海绵或任何载体粘附，如微载体珠子。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种可从本发明的一些实施例的方法获得的可食用肉。
根据本发明的一些实施例，所述可食用肉为一肉饼或块状的形式，且具有一密度为约100×106个细胞/克至500×106个细胞/克，例如200×106个细胞/克。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种产生自发永生化的成纤维细胞的方法，所述方法包括：
步骤a：在多个粘附培养条件下，于一含有血清的培养基的存在下，培养多个禽类胚胎细胞，从而获得多个鶏类胚胎成纤维细胞；
步骤b：在所述多个粘附培养条件下，于所述含有血清的培养基中，传代所述禽类胚胎成纤维细胞至少10至12代，直至培养物崩坏，其中所述培养物崩坏的特征为至少90％的所述禽类胚胎成纤维细胞的衰老和/或死亡；及
步骤c：在所述含血清培养基的所述培养物崩坏中，分离出存活额外至少20代的至少一群落，
从而产生所述自发永生化的成纤维细胞。
如本文所用，短语“培养崩坏(culture collapse)”是指一细胞培养物，其中大部分细胞已经历衰老(即终止细胞分裂)或细胞雕亡(apoptosis)/坏死(necrosis)。
根据本发明的一些实施例，所述含血清的培养基是基于一DMEM/F12的培养基。
根据本发明的一些实施例，所述培养基中的所述血清包含约15％的胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施例，所述含血清的培养基还包含L-丙胺酸基-L-谷氨酰胺(L-Analyl-L-Glutamine)。
根据本发明的一些实施例，所述鸡类胚胎从生长10至12天的一受精肉鶏的卵获得。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了可通过本发明的一些实施方法的方法获得的一种自发永生化的鸡成纤维细胞。
根据本发明的一些实施例，所述自发永生化的鸡类成纤维细胞，能够连续传代至少约15、约20、约25、约30、约35、约40次传代。
根据本发明的一些实施例，所述自发永生化的鸡类成纤维细胞，能够具有至少约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90人或更多人口倍增。
一细胞中myoD1和/或肌细胞生成素(myogenin)的上调(例如，一自发永生化的成纤维细胞)可以在转录水平上(即通过启动子(promoters)、增强子(enhancers)、调节元件(regulatory elements)的转录激活)、在基因组水平上(即正确的剪接(splicing)、多聚腺苷酸化(polyadenlation)、转译活化(activation of translation))或蛋白质水平(即翻译后修饰(post-translational modifications)、与基质的相互作用等)实现。
以下是能够上调myoD1和/或肌细胞生成素(myogenin)的表达水平和/或活性的试剂列表。
能够上调myoD1和/或肌细胞生成素表达的试剂可以是一外源多核苷酸序列，设计和构建以至少表达myoD1和/或肌细胞生成素的功能部分。因此，外源多核苷酸序列可以是编码myoD1和/或肌细胞生成素分子的DNA或RNA序列，能够将成纤维细胞转化为肌细胞。
为了在禽类细胞中表达外源myoD1和/或肌细胞生成素，优选将编码myoD1和/或肌细胞生成素的多核苷酸序列连接到适于禽类细胞表达的核酸构建体中。这种核酸构建体包括一启动子序列，用于以持续(constitutive)方式或诱导(inducible)方式指导所述多核苷酸序列在细胞中转录。
应当理解，本发明的一些实施例的核酸构建体也可以利用具有所需活性的myoD1和/或肌细胞生成素同源物(例如，能够将成纤维细胞转化为肌细胞)。此类同系物可以是与SEQ ID NO：5或7例如至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％相同，如使用Smith和Waterman算法的威斯康星序列分析包的BestFit软件所测定的，其中间隙重量等于50，长度重量等于3，平均匹配等于10，平均不匹配等于-9。
适用于本发明的一些实施例的持续型启动子是在大多数环境条件下和在大多数类型的细胞中，例如巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和劳氏肉瘤病毒(Rous sarcomavirus，RSV)具有活性的启动子序列。适用于本发明的一些实施例的诱导型启动子，例如包括四环素诱导型启动子(tetracycline-inducible promoter，Zabala M，等人所著，癌症研究期刊Cancer Res.2004,64(8)：2799-804)。
本发明的一些实施例的核酸构建体(在本文中也称为“表达载体(expressionvector)”)包括使所述载体适于在原核生物、真核生物或优选两者中复制和整合的额外序列(例如，穿梭载体(shuttle vectors))。另外，典型的克隆载体还可含有转录和转译起始序列、转录和转译终止子和一多聚腺苷酸化(polyadenylation)信号。举例来说，此类构建体通常包括5'LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点和3'LTR或其部分。
本发明的一些实施例的核酸构建体通常包括一信号序列，用于从核酸构建体所放置的宿主细胞分泌出多肽。优选地，用于所述目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的一些实施例的多肽变体的信号序列。
真核启动子通常含有两种类型的识别序列，TATA盒(ATA Box)和上游启动子元件(upstream promoter elements)。TATA盒位于转录起始位点上游25-30个碱基对，被认为参与指导RNA聚合酶开始RNA合成。其他上游启动子元件决定了转录开始的速率。
优选地，本发明的一些实施例的核酸构建体所使用的启动子在转染(transformed)的特定细胞群中具有活性。
增强子元件(enhancer elements)可以从连接的同源或异源启动子刺激高达1000倍的转录。当置于转录起始位点的下游或上游时，增强子是活跃的。源自病毒的许多增强子元件具有广泛的宿主范围并且在多种组织中具有活性。例如SV40早期基因增强子适用于许多细胞类型。适用于本发明的一些实施例的其他增强子/启动子组合包括衍生自多瘤病毒(polyoma virus)、人类或鼠类巨细胞病毒(human or murine cytomegalovirus,CMV)，长期重复来自各种反转录病毒，如鼠白血病病毒(murine leukemia virus)、鼠或劳氏肉瘤病毒(murine or Rous sarcoma virus)和HIV。参见增强子和真核细胞的表达Enhancers andEukaryotic Expression，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1983，其通过引用并入本文。
在表达载体的构建中，启动子优选位于距异源转录起始位点(heterologoustranscription start site)的距离，与其在自然环境中距转录起始位点的距离相同。然而如本领域所知，所述距离的一些变化可以被适应而不丧失启动子功能。
还可以将多聚腺苷酸化序列(polyadenylation sequences)添加到表达载体中以增加myoD1和/或肌细胞生成素mRNA转译的效率。准确和有效的多聚腺苷酸化需要两个不同的序列元件：位于多腺苷酸化位点下游的富含GU或U的序列，以及位于上游11至30个核苷酸的六个核苷酸AAUAAA的高度保守序列。适用于本发明的一些实施例的终止和多聚腺苷酸化信号包括衍生自SV40的序列。
除了已经描述的元件之外，本发明的一些实施例的表达载体通常可以含有其他特化元件，其旨在提高被克隆的核酸的表达水平或协助鉴别携带重组DNA的细胞。例如许多动物病毒含有DNA序列，其促进在所允许的细胞类型中病毒基因组的染色体外复制。携带这些病毒复制子的质粒以游离方式复制，只要质粒上携带的基因或宿主细胞的基因组提供适当的因子即可。
载体可以包括或不包括真核复制子。如果存在真核复制子，则使用适当的选择标记在真核细胞中扩增载体。如果载体不包含真核复制子，则不可能进行游离的扩增。相反，所述重组DNA整合到工程细胞的基因组中，其中所述启动子指导所需核酸的表达。
本发明的一些实施例的表达载体可以进一步包括额外的多核苷酸序列，其例如允许来自单一mRNA的几种蛋白质的转译，例如一内部核醣体进入位点(internal ribosomeentry site，IRES)和用于启动子-嵌合多肽的基因组整合(genomic integration)的多种序列。
应当理解，所述表达载体中包含的各个元件可以以各种配置排列。例如，增强子元件、启动子等，甚至
编码myoD1和/或肌细胞生成素的多核苷酸序列可以以“头对尾”构型排列，可以作为反向互补物存在，或者以互补配置，作为一相反平行链(anti-parallel strand)。虽然表达载体的非编码元件更可能发生这种多样的构型，但也可以设想表达载体内编码序列的替代构型。
还可以使用含有来自真核病毒如反转录病毒的调节元件(regulatory elements)的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。衍生自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，衍生自Epstein Bar病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括pMSG,pAV009/A+,pMTO10/A+,pMAMneo-5,杆状病毒pDSVE，以及允许在SV-40早期启动子、SV-40后期启动子、金属硫蛋白启动子(metallothionein promoter)、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(murinemammary tumor virus promoter)、劳氏肉瘤病毒启动子(Rous sarcoma viruspromoter)，多角体蛋白启动子(polyhedrin promoter)或其他在真核细胞中显示有效表达的启动子。
如上所述，病毒是非常特化的感染因子，在许多情况下已经进化以逃避宿主防御机制。通常病毒以特定细胞类型感染和繁殖。病毒载体的目标特异性利用其天然特异性，特异性地以预定的细胞类型为目标，从而将重组基因引入感染的细胞中。因此，本发明的一些实施例所用的载体类型将取决于转化的细胞类型。根据转化的细胞类型选择合适载体的能力完全在普通技术人员的能力范围内，因此本文不提供选择考量的一般描述。例如，可以使用人类T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)以骨髓细胞做为目标，并且可以使用存在于杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(baculovirus Autographa californicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV)中的异源启动子以肾细胞作为目标，如Liang CY等人所述，2004(Arch Virol.149：51-60)。
重组病毒载体可用于myoD1和/或肌细胞生成素的体内表达，因为它们提供诸如侧向感染和目标特异性的优点。横向感染是例如反转录病毒的生命周期中固有的，是单一感染细胞产生许多后代病毒体并且感染相邻细胞的过程。结果是大面积被迅速感染，并且其大部分在最初未被原始病毒颗粒感染。这与垂直型感染形成对比，在垂直型感染中感染因子仅通过子代后代传播。还可以产生不能横向扩散的病毒载体。如果期望的目的是仅将特定基因引入局部数目的目标细胞中，则所述特征可能是有用的。
可以使用各种方法将本发明的一些实施例的表达载体导入干细胞中。这些方法一般描述于Sambrook等人所著,分子克隆：实验手册Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992),Ausubel等人所著,分子生物学的目前方案Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989),Chang等人所著,体基因疗法Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995),Vega等人所著,基因标靶Gene Targeting,CRC Press,Ann ArborMich.(1995),载体：分子克隆载体及其用途概述：Vectors:A Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)and Gilboa等人所著,[生物技术Biotechniques 4(6):504-512,1986]，并且例如包括稳定或瞬时转染、脂质转染(lipofection)、电穿孔(electroporation)和用重组病毒载体感染。另外，参见美国专利号5,464,764和5,487,992的阳性阴性选择方法的美国专利号。
通过病毒感染引入核酸提供了优于其他方法(例如脂质转染和电穿孔)的若干优点，因为由于病毒的感染性质可以获得更高的转染效率。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒或非病毒构建体转染，例如腺病毒(adenovirus)、慢病毒(lentivirus)、单纯疱疹病毒I病毒(Herpes simplex I virus)或腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)和基于脂质的系统。用于脂质介导的基因转移的有效脂质例如是DOTMA、DOPE和DC-Chol[Tonkinson等人所助，癌症调查期刊CancerInvestigation，14(1)：54-65(1996)]。用于基因治疗的最优选构建体是病毒，最优选为腺病毒、AAV、慢病毒或反转录病毒。病毒构建体如反转录病毒构建体包括至少一种转录启动子/增强子或基因座限定元件(locus-defining element(s))，或通过其他方式控制基因表达的其他元件，例如信使(messenger)的交替剪接(alternate splicing)、核RNA输出(nuclear RNA export)或转译后修饰。此类载体构建体还包括包装信号(packaging)、长末端重复序列(long terminal repeats,LTRs)或其部分，以及正链和负链引物结合位点，适合于所用病毒，除非它已经存在于病毒构建体中。另外，这种构建体通常包括信号序列，用于从其中放置构建体的宿主细胞分泌出多肽。优选地，用于所述目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的一些实施例的多肽变体的信号序列。任选地，所述构建体还可以包括指导多聚腺苷酸化(polyadenylation)的信号，以及一或多个限制性位点和转译终止序列。举例来说，此类构建体通常包括5'LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点和3'LTR或其部分。可以使用非病毒的其他载体，例如阳离子脂质(cationic lipids)、聚赖氨酸(polylysine)和树枝状大分子(dendrimers)。
除了含有插入的编码序列的转录和转译所必需的元件之外，本发明的一些实施例的表达构建体还可以包括经过改造以增强表达的肽的稳定性、产生、纯化、产量或毒性的序列。例如可以改造融合蛋白或可切割的融合蛋白的表达，所述融合蛋白或可切割的融合蛋白包含本发明的一些实施例的myoD1和/或肌细胞生成素蛋白和异源蛋白(heterologousprotein)。可以设计这样的融合蛋白，使得所述融合蛋白可以通过亲和层析(affinitychromatography)容易地分离；例如，通过固定在对异源蛋白质有特异性的层析柱上。当myoD1和/或肌细胞生成素蛋白与异源蛋白质之间的切割位点被设计时，myoD1和/或肌细胞生成素蛋白可以通过用破坏切割位点的适当酵素或试剂处理，而从色谱柱中释放出来[例如，见Booth等人所著(1988)免疫学文献Immunol.Lett.19：65-70；和Gardella等人所著，(1990)生物画ㄒ学期刊J.Biol.Chem.265：15854-15859]。
如上所述，多种原核或真核细胞可用作宿主表达系统，以表达本发明的一些实施例的多肽。这些包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体DNA转化的细菌，含有编码序列的质粒DNA(plasmid DNA)或粘粒DNA(cosmid DNA)表达载体；用含有编码序列的重组酵母表达载体转化酵母；用重组病毒表达载体感染的植物细胞系统(例如，花椰菜花叶病毒，(cauliflower mosaic virus CaMV)；烟草花叶病毒，(tobacco mosaic virus，TMV))或用含有编码序列的重组质粒表达载体，如Ti质粒转化。哺乳动物表达系统也可用于表达本发明的一些实施例的多肽。
在培养中的适当时间后进行重组多肽的回收。短语“回收重组多肽”是指收集含有多肽的整个发酵培养基，并且不需要另外的分离或纯化步骤。不管如此，本发明的一些实施例的多肽可以使用多种标准蛋白质纯化技术来纯化，例如但不限于亲和层析(affinitychromatography)、离子交换层析(ion exchange chromatography)、过滤(filtration)、电泳(electrophoresis)、疏水相互作用层析(hydrophobic interaction chromatography)、凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)、反相层析(reverse phasechromatography)、伴刀豆球蛋白A层析(concanavalin A chromatography)、色谱聚焦和差异溶解(chromatofocusing and differential solubilization)。
能够在细胞中上调myoD1和/或肌细胞生成素的试剂也可以是任何化合物，其能够增加编码myoD1和/或肌细胞生成素的内源DNA或mRNA的转录和/或转译，从而增加内源性myoD1和/或肌细胞生成素活性。
根据本发明的一些实施例，通过使用本领域熟知的方法进行基因组编辑来实现本发明多肽的过表达。
基因组编辑是通过修饰目标植物基因组序列来影响目标性状的有力手段。此类修饰可产生新的或修饰的等位基因(alleles)或调控元件。因此，基因组编辑采用反向遗传学，通过人工工程核酸酶(artificially engineered nucleases)在基因组中的所需位置切割并产生特定的双链断裂，然后通过细胞内源过程修复，如同源定向修复(homologydirected repair，HDR)和非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)。NHEJ以双链断裂直接连接DNA末端，而HDR利用同源序列作为模板在断裂点再生缺失的DNA序列。为了将特定的核苷酸修饰引入基因组DNA，在HDR期间必须存在含有所需序列的DNA修复模板。使用传统的限制性内切核酸酶不能进行基因组编辑，因为大多数限制酶识别DNA上的一些碱基对作为其目标，并且在基因组中许多位置发现被识别的碱基对组合的机率非常高，导致多次切割而不是限于所需的位置。为了克服这一挑战并创建特定位点的单炼或双链断裂，迄今已发现并生物工程化了几种不同类型的核酸酶。这些包括大范围核酸酶(meganucleases)、锌指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFN)、转录激活因子(transcription-activator)，如效应核酸酶(effector nucleases，TALEN)和CRISPR/Cas系统。
通过基因组编辑的过表达(over expression)多肽可以通过以下方式实现：(i)替换一内源序列，其编码目的多肽(polypeptide of interest)或替换一调控序列，在其所处空制之下，和/或(ii)将编码目标多肽的一新基因插入基因组的一目标区域，和/或(iii)引入点突变，其导致编码目的多肽的基因的上调(例如通过改变调节序列，例如启动子、增强子，5'-UTR和/或3'-UTR，或所述编码序列中的多个突变)。
如本文所用的术语“约”是指±10％，并且符号“≈”表示具有至多10％的公差的相等性。
术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包含(including)”、“具有(having)”及其词形变化是指“包括但不限于”。
术语“由...组成(consisting of)”意指“包括并且限于”。
术语“基本上由......组成(essentially consisting of)”是指组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤及/或部件，但只有当额外的成分、步骤及/或部件实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征及新特征
本文所使用的单数形式“一”、“一个”及“至少一”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一化合物”或“至少一种化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。
此外，这里使用的“和/或”被视为具有或不具有另一者的两个指定特征或组件中的各个的具体公开。因此，在诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括以下方面中的各者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
在整个本申请中，本发明的各种实施例可以以一个范围的形式存在。应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及所述范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。
每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。术语，第一指示数字及第二指示数字"之间的范围”及第一指示数字"到”第二指示数字"的范围"在本文中可互换，并指包括第一及第二指示数字，及其间的所有分数及整数。
如本文所用的术语“方法(method)”指的是用于完成一特定任务的方式(manner)，手段(means)，技术(technique)和程序(procedures)，包括但不限于，那些方式，手段，技术和程序，其是已知的，或是从已知的方式，手段，技术或程序很容易地被化学，药理，生物，生化及医学领域从业者所开发。
如本文所使用的，术语“处理(treating)”包括消除(abrogate)，本质上地抑制(substantially inhibiting)，减慢或逆转(reversing)一状态的进展，本质上改善(ameliorating)一状态的临床或美学的症状，或本质上预防一状态的临床表现或美学症状。
当参考特定序列表时，此参考应理解为还包括基本上对应于其互补序列的序列，包括小的序列变异，例如由于测序错误、克隆错误或其他改变而导致，其导致碱基替换、碱基缺失或碱基添加，条件是这种变异的频率小于50个核苷酸中的1个、或者100个核苷酸中少于1个、或者200个核苷酸中少于1个、或者500个核苷酸中少于1个、或者1000个核苷酸中少于1个、或者，5,000个核苷酸中少于1个、或者10,000个核苷酸中少于1个。
应当理解，本申请中公开的任何序列标识号(SEQ ID NO)可以指DNA序列或RNA序列，这取决于提及SEQ ID NO的上下文，即使仅以DNA序列形式或RNA序列形式表达SEQ IDNO。例如SEQ ID NO：5以DNA序列形式表达(例如，胸腺嘧啶代表T)，但它可以指对应于MyoD1核酸序列的DNA序列，或RNA分子核酸序列的RNA序列。类似地，尽管一些序列以RNA序列形式表达(例如，尿嘧啶代表U)，但是根据所描述的分子的实际类型，它可以指包含dsRNA的RNA分子的序列，或者与所示RNA序列相对应的DNA分子的序列。无论如何，可设想具有任何公开序列的替代物的DNA和RNA分子。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反的为了简洁起见，在单一实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供，或者适合于本发明的任何其他描述的实施例。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施例的必要特征，除非实施例在没有这些元素的情况下不起作用。
本实施例的系统也可用于其他目的。例如在本发明的实施例中，所述系统可用于从移植范围的人类细胞系产生人类组织。相对于患者，细胞可以是自体的(autologou)、同源的(allologous)或异源的(heterologous)。上述程序可用于制造用于移植的部分或全部器官。
编号条文：
条文1：本发明的一些实施例提供一种用于生长细胞的系统，包括：一主要组织灌注回路，包括：一组织生长腔室；至少一第一泵；一培养基灌注溶液；一氧合器；和一加热元件；次级透析回路，包括：至少一第二泵；一透析器；和一透析液；其中所述系统的各电路中的每个组件的顺序可以是任何顺序。
条文2：本发明的一些实施例提供所述系统，其中组织生长腔室是一带夹套(jacketed)的组织生长腔室。
条文3：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述组织生长腔室的特征在于具有体积和内部尺寸，所述体积和内部尺寸被配置和布置成接收所述生长的组织以及足够量的所述培养基灌注以连续循环所述培养基灌注通过所述生长的组织。
条文4：本发明的一些实施例提供所述系统，其中第一、第二或第三泵选自蠕动泵、正排量泵、脉冲泵、速度泵、重力泵、蒸汽泵、无阀泵、以及它们的任何组合。
条文5：本发明的一些实施例提供所述种系统，其中所述培养基灌注溶液包含非动物血清。
条文6：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述培养基灌注溶液包含多个组分选自氨基酸、维生素、微量元素、转铁蛋白(transferrin)、胰岛素、植物来源的重组白蛋白、细菌衍生的重组体白蛋白、胰蛋白磷酸盐(tryptose phosphate)、谷氨酰胺(glutamine)、葡萄糖、果糖、蔗糖、M199、DMEM/F12培养基、KO-血清、亚油酸(linoleicacid)、油酸(oleic acid)、棕榈(palmate acid)、卵磷脂(lecithin)、bFGF、IGF-1、胰岛素、SCF、EGF、TGF-β1、IL-11、PGE、BMP4、活化素A(activin A)、氢化可的松(hydrocortisone)、抗坏血酸(ascorbic acid)及其任何组合所组成一群组。
条文7：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述氧合器是一膜式氧合器。
条文8：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述氧合器适于提供至少一种气体，选自于氧气(O2)、二氧化碳(CO2)、氮气(N2)及其任意组合所组成的一群组。
条文9：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述氧合器适于维持一比率：在系统内部中各气体的百分比中O2从约21％到约95％、CO2从约0％到约10％和N2从大约0％到大约80％。
条文10：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述氧合器适于维持一比率：在系统内部中各气体的百分比中O2从约80％、CO2为约5％、N2为约15％。
条文11：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述系统还包括一气泡捕捉器。
条文12：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述气泡捕捉器可与一除泡器或一结合气泡捕捉器/除泡器同等地互换。
条文13：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述加热元件是一热交换器。
条文14：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述加热元件选自
壳管式热交换器、板式热交换器、板壳式热交换器、绝热轮热交换器、板翅式热交换器、枕板式热交换器、流体热交换器、余热回收装置、动态刮面热交换器、相变热交换器、直接接触热交换器、微通道热交换器、螺旋线圈热交换器、螺旋热交换器及其任意组合所组成的一群组。
条文15：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述氧合器和所述加热元件是两个不同的部件。
条文16：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述氧合器和所述加热元件是单一组件。
条文17：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述透析器包括一膜，具有1至60kDa的一范围的孔径。
条文18：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述透析器包括一膜，具有选自10至10000平方公分的一范围的面积。
条文19：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述系统还包括至少一碳过滤器。
条文20：本发明的一些实施例提供所述系统，其中至少一碳过滤器适于清洁存在于所述透析液中的毒素。
条文21：本发明的一些实施例提供所述系统，其中至少一氨过滤器适于清洁存在于所述透析液中的氨。
条文22：本发明的一些实施例提供所述系统，其中通过所述相同的过滤器除去毒素和氨。
条文23：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述透析液包含葡萄糖、氨基酸、胰岛素、激素，如无血清培养基中可的松和生长因子。
条文24：本发明的一些实施例提供所述系统，还包括至少一传感器，选自于由温度传感器、pH传感器、体积传感器、流量传感器、光学传感器、葡萄糖传感器、氧传感器、重量传感器、蛋白质传感器及其任何组合所组成的一群组。
条文25：本发明的一些实施例提供所述系统，还包括至少一计算机，所述计算机包括至少一非暂时性计算机可读介质，所述非暂时性计算机可读介质存储一程序，使所述计算机执行一方法，所述方法使用一处理器执行所述存储的程序。
条文26：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述计算机连接到至少一远端服务器，允许一外部远程操作员进入所述计算机。
条文27：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述程序允许所述系统自动操作而无需一外部操作员。
条文28：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述组织生长腔室适于生长组织，所述组织来自多个细胞，所述细胞选自于：原代细胞(primary cells)、胚胎/新生儿成纤维细胞(embryonic/neonatal fibroblasts cells)、胚胎/新生儿内皮细胞(embryonic/neonatal endothelium cells)、胚胎/新生儿肌肉细胞(embryonic/neonatal musclecells)、多能干细胞(pluripotent stem cells)、胚胎干细胞(embryonic stem cells)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)、间充质干细胞(mesenchymalstem cells)、成纤维细胞(fibroblasts cells)、内皮细胞(endothelial cells)、肌细胞(myocyte cells)、卫星细胞(satellite cells)、肝细胞(hepatocyte cells)、血球细胞(blood cells)、神经细胞(neuron cells)、脂肪细胞和任何组合所组成的一群组。
条文29：本发明的一些实施例提供所述系统，其中将所述细胞暴露于基于小分子的重新编程(reprogramming)。
条文30：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述小分子选自于，但不限于CHIR9902、SB431542、RepSox、Parnate、Forskolin、TTNPB、DZnep、VPA、CHIR99021、PD0325901、PD173074、LIF、A83-01、BIX01294、AS8351、SC1、Y27632、OAC2、SU16F、JNJ10198409、LDN193189、NSC 228155、CN 009543V、AG1478、PD 153035、2-Me-5HT、D4476、RG108、BIO、SMI1、SMI2、5-氮杂胞苷、芬那米尔(phenamil)、GW7845、RG14620或哈尔明碱(Harmine)，噻唑烷二酮(thiazolidinediones，即罗格列酮rosiglitazone、吡格列酮pioglitazone、洛贝格列酮lobeglitazone)、IBMX及其任何组合所组成的一群组。
条文31：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述细胞可以在其基因组中稳定地包含一诱导型受控表达转殖基因系统或类似构建体。
条文32：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述诱导型受控表达转殖基因系统是TET-on或TET-off系统。
条文33：本发明的一些实施例提供所述系统，其中被表达的所述诱导型受控转殖基因是MyoD。
条文34：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述诱导型受控表达转殖基因系统被多西环素或类似的激活剂/失活剂激活或失活。
条文35：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述细胞在一可生物降解的支架中生长，所述可生物降解的支架包含在一封闭循环灌注回路中。
条文36：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述细胞来自于非人类动物来源：鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鹅、鸽子、野鸡、鸵鸟、牛(小牛)、鹿、山羊、绵羊(羊)、马、大羊驼、骆驼、兔子、袋鼠、鳄鱼、乌龟、龙虾、鲑鱼、金枪鱼、海豚、鲸鱼及其任何组合或相关物种所组成的一群组。
条文37：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述系统用于生长人类或动物来源的细胞、组织、部分或全部器官，用于移植目的。
条文38：本发明的一些实施例提供一种用于生长细胞的方法，包括：获取一主要组织灌注回路，包括：一组织生长腔室；至少一第一泵；一培养基灌注溶液；一氧合器；和一加热元件；获取次级透析回路，包括：至少一第二泵；一透析器；和一透析液；将所述主要组织灌注回路与次级透析回路连接；使所述细胞在所述组织生长腔室中生长直至达到所需的量。。
条文39：本发明的一些实施例提供所述方法，其中组织生长腔室是一带夹套(jacketed)的组织生长腔室。
条文40：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述组织生长腔室的特征在于具有体积和内部尺寸，所述体积和内部尺寸被配置和布置成接收所述生长的组织以及足够量的所述培养基灌注以连续循环所述培养基灌注通过所述生长的组织。
条文41：本发明的一些实施例提供所述方法，其中第一、第二或第三泵选自蠕动泵、正排量泵、脉冲泵、速度泵、重力泵、蒸汽泵、无阀泵、以及它们的任何组合。
条文42：本发明的一些实施例提供所述种方法，其中所述培养基灌注溶液包含非动物血清。
条文43：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述培养基灌注溶液包含多个组分选自氨基酸、维生素、微量元素、转铁蛋白(transferrin)、胰岛素、植物来源的重组白蛋白、细菌衍生的重组体白蛋白、胰蛋白磷酸盐(tryptose phosphate)、谷氨酰胺(glutamine)、葡萄糖、果糖、蔗糖、M199、DMEM/F12培养基、KO-血清、亚油酸(linoleicacid)、油酸(oleic acid)、棕榈(palmate acid)、卵磷脂(lecithin)、bFGF、IGF-1、胰岛素、SCF、EGF、TGF-β1、IL-11、PGE、BMP4、活化素A(activin A)、氢化可的松(hydrocortisone)、抗坏血酸(ascorbic acid)及其任何组合所组成一群组。
条文44：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述氧合器是一膜式氧合器。
条文45：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述氧合器适于提供至少一种气体，选自于氧气(O2)、二氧化碳(CO2)、氮气(N2)及其任意组合所组成的一群组。
条文46：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述氧合器适于维持一比率：在系统内部中各气体的百分比中O2从约21％到约95％、CO2从约0％到约10％和N2从大约0％到大约80％。
条文47：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述氧合器适于维持一比率：在系统内部中各气体的百分比中O2从约80％、CO2为约5％、N2为约15％。
条文48：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述系统还包括一气泡捕捉器。
条文49：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述气泡捕捉器可与一除泡器或一结合气泡捕捉器/除泡器同等地互换。
条文50：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述加热元件是一热交换器。
条文51：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述加热元件选自壳管式热交换器、板式热交换器、板壳式热交换器、绝热轮热交换器、板翅式热交换器、枕板式热交换器、流体热交换器、余热回收装置、动态刮面热交换器、相变热交换器、直接接触热交换器、微通道热交换器、螺旋线圈热交换器、螺旋热交换器及其任意组合所组成的一群组。
条文52：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述氧合器和所述加热元件是两个不同的部件。
条文53：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述氧合器和所述加热元件是单一组件。
条文54：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述透析器包括一膜，具有1至300kDa的一范围的孔径。
条文55：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述透析器包括一膜，具有选自10至10000平方公分的一范围的面积。
条文56：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述系统还包括至少一碳过滤器。
条文57：本发明的一些实施例提供所述方法，其中至少一碳过滤器适于清洁存在于所述透析液中的毒素。
条文58：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述透析液包含葡萄糖、氨基酸、胰岛素、激素，如无血清培养基中可的松和生长因子。
条文59：本发明的一些实施例提供所述方法，还包括至少一传感器，选自于由温度传感器、pH传感器、体积传感器、流量传感器、光学传感器、葡萄糖传感器、氧传感器、重量传感器、蛋白质传感器及其任何组合所组成的一群组。
条文60：本发明的一些实施例提供所述方法，还包括至少一计算机，所述计算机包括至少一非暂时性计算机可读介质，所述非暂时性计算机可读介质存储一程序，使所述计算机执行一方法，所述方法使用一处理器执行所述存储的程序。
条文61：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述计算机连接到至少一远端服务器，允许一外部远程操作员进入所述计算机。
条文62：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述程序允许所述系统自动操作而无需一外部操作员。
条文63：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述组织生长腔室适于生长组织，所述组织来自多个细胞，所述细胞选自于：原代细胞(primary cells)、胚胎/新生儿成纤维细胞(embryonic/neonatal fibroblasts cells)、胚胎/新生儿内皮细胞(embryonic/neonatal endothelium cells)、胚胎/新生儿肌肉细胞(embryonic/neonatal musclecells)、多能干细胞(pluripotent stem cells)、胚胎干细胞(embryonic stem cells)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)、间充质干细胞(mesenchymalstem cells)、成纤维细胞(fibroblasts cells)、内皮细胞(endothelial cells)、肌细胞(myocyte cells)、卫星细胞(satellite cells)、肝细胞(hepatocyte cells)、血球细胞(blood cells)、神经细胞(neuron cells)、脂肪细胞和任何组合所组成的一群组。
条文64：本发明的一些实施例提供所述方法，其中将所述细胞暴露于基于小分子的重新编程(reprogramming)。
条文65：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述小分子选自于，但不限于CHIR9902、SB431542、RepSox、Parnate、Forskolin、TTNPB、DZnep、VPA、CHIR99021、PD0325901、PD173074、LIF、A83-01、BIX01294、AS8351、SC1、Y27632、OAC2、SU16F、JNJ10198409、LDN193189、NSC 228155、CN 009543V、AG1478、PD 153035、2-Me-5HT、D4476、RG108、BIO、SMI1、SMI2、5-氮杂胞苷、芬那米尔(phenamil)、GW7845、RG14620或哈尔明碱(Harmine)，噻唑烷二酮(thiazolidinediones，即罗格列酮rosiglitazone、吡格列酮pioglitazone、洛贝格列酮lobeglitazone)、IBMX及其任何组合所组成的一群组。
条文66：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述细胞可以在其基因组中稳定地包含一诱导型受控表达转殖基因系统或类似构建体。
条文67：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述诱导型受控表达转殖基因系统是TET-on或TET-off系统。
条文68：本发明的一些实施例提供所述方法，其中被表达的所述诱导型受控转殖基因是MyoD。
条文69：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述诱导型受控表达转殖基因系统被多西环素或类似的激活剂/失活剂激活或失活。
条文70：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述细胞在一可生物降解的支架中生长，所述可生物降解的支架包含在一封闭循环灌注回路中。
条文71：本发明的一些实施例提供所述系统，其中所述细胞来自于非人类动物来源：鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鹅、鸽子、野鸡、鸵鸟、牛(小牛)、鹿、山羊、绵羊(羊)、马、大羊驼、骆驼、兔子、袋鼠、鳄鱼、乌龟、龙虾、鲑鱼、金枪鱼、海豚、鲸鱼及其任何组合或相关物种所组成的一群组。
条文72：本发明的一些实施例提供所述方法，其中所述细胞生长在本文所述的一系统中。
条文73：本发明的一些实施例提供可食用的体外肉(in-vitro meat)，其中体外肉在存在多种组分下生长，所述组份选自于由氨基酸、维生素、微量元素、转铁蛋白(transferrin)、胰岛素、植物来源的重组白蛋白、细菌衍生的重组体白蛋白、胰蛋白磷酸盐(tryptose phosphate)、谷氨酰胺(glutamine)、葡萄糖、果糖、蔗糖、M199、DMEM/F12培养基、KO-血清、亚油酸(linoleic acid)、油酸(oleic acid)、棕榈(palmate acid)、卵磷脂(lecithin)、bFGF、IGF-1、胰岛素、SCF、EGF、TGF-β1、IL-11、PGE、BMP4、活化素A(activinA)、氢化可的松(hydrocortisone)、抗坏血酸(ascorbic acid)及其任何组合所组成一群组。
条文74：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中所述氧合器适于维持一比率：在系统内部中各气体的百分比中O2从约21％到约95％、CO2从约0％到约10％和N2从大约0％到大约80％。
条文75：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中所述氧合器适于维持一比率：在系统内部中各气体的百分比中O2从约80％、CO2为约5％、N2为约15％。
条文76：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中所述组织生长腔室适于生长组织，所述组织来自多个细胞，所述细胞选自于：原代细胞(primary cells)、胚胎/新生儿成纤维细胞(embryonic/neonatal fibroblasts cells)、胚胎/新生儿内皮细胞(embryonic/neonatal endothelium cells)、胚胎/新生儿肌肉细胞(embryonic/neonatalmuscle cells)、多能干细胞(pluripotent stem cells)、胚胎干细胞(embryonic stemcells)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells)、成纤维细胞(fibroblasts cells)、内皮细胞(endothelialcells)、肌细胞(myocyte cells)、卫星细胞(satellite cells)、肝细胞(hepatocytecells)、血球细胞(blood cells)、神经细胞(neuron cells)、脂肪细胞和任何组合所组成的一群组。
条文77：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中将所述细胞暴露于基于小分子的重新编程(reprogramming)。
条文78：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中所述小分子选自于，但不限于CHIR9902、SB431542、RepSox、Parnate、Forskolin、TTNPB、DZnep、VPA、CHIR99021、PD0325901、PD173074、LIF、A83-01、BIX01294、AS8351、SC1、Y27632、OAC2、SU16F、JNJ10198409、LDN193189、NSC 228155、CN 009543V、AG1478、PD 153035、2-Me-5HT、D4476、RG108、BIO、SMI1、SMI2、5-氮杂胞苷、芬那米尔(phenamil)、GW7845、RG14620或哈尔明碱(Harmine)，噻唑烷二酮(thiazolidinediones，即罗格列酮rosiglitazone、吡格列酮pioglitazone、洛贝格列酮lobeglitazone)、IBMX及其任何组合所组成的一群组。
条文79：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中所述细胞可以在其基因组中稳定地包含一诱导型受控表达转殖基因系统或类似构建体。
条文80：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中所述诱导型受控表达转殖基因系统是TET-on或TET-off系统。
条文81：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中被表达的所述诱导型受控转殖基因是MyoD。
条文82：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中所述诱导型受控表达转殖基因系统被多西环素或类似的激活剂/失活剂激活或失活。
条文83：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中所述细胞在一可生物降解的支架中生长，所述可生物降解的支架包含在一封闭循环灌注回路中。
条文84：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中所述细胞来自于非人类动物来源：鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鹅、鸽子、野鸡、鸵鸟、牛(小牛)、鹿、山羊、绵羊(羊)、马、大羊驼、骆驼、兔子、袋鼠、鳄鱼、乌龟、龙虾、鲑鱼、金枪鱼、海豚、鲸鱼及其任何组合或相关物种所组成的一群组。
条文85：本发明的一些实施例提供可食用的体外肉，其中所述细胞在非动物血清培养基中生长。
条文86：本发明的一些实施例提供可食用的体外肉，其中所述细胞在包含葡萄糖、氨基酸、胰岛素、激素，如无血清培养基中可的松和生长因子的培养基中生长。
条文87：因此本发明的范围是提供一可移植的体外组织，其中所述体外组织在如本文所述的系统中制造。
条文88：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述体外组织在多个组分存在下生长，所述组份选自于由氨基酸、维生素、微量元素、转铁蛋白(transferrin)、胰岛素、植物来源的重组白蛋白、细菌衍生的重组体白蛋白、胰蛋白磷酸盐(tryptose phosphate)、谷氨酰胺(glutamine)、葡萄糖、果糖、蔗糖、M199、DMEM/F12培养基、KO-血清、亚油酸(linoleic acid)、油酸(oleic acid)、棕榈(palmate acid)、卵磷脂(lecithin)、bFGF、IGF-1、胰岛素、SCF、EGF、TGF-β1、IL-11、PGE、BMP4、活化素A(activinA)、氢化可的松(hydrocortisone)、抗坏血酸(ascorbic acid)及其任何组合所组成一群组。
条文89：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述可移植的体外组织在淤一环境中生长，所述环境的特征在于一比率：在系统内部中各气体的百分比中O2从约21％到约95％、CO2从约0％到约10％和N2从大约0％到大约80％。
条文90：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述可移植的体外组织在淤一环境中生长，所述环境的特征在于一比率：在系统内部中各气体的百分比中O2从约80％、CO2为约5％、N2为约15％。
条文91：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述组织生长腔室适于生长组织，所述组织来自多个细胞，所述细胞选自于：原代细胞(primary cells)、胚胎/新生儿成纤维细胞(embryonic/neonatal fibroblasts cells)、胚胎/新生儿内皮细胞(embryonic/neonatal endothelium cells)、胚胎/新生儿肌肉细胞(embryonic/neonatalmuscle cells)、多能干细胞(pluripotent stem cells)、胚胎干细胞(embryonic stemcells)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells)、成纤维细胞(fibroblasts cells)、内皮细胞(endothelialcells)、肌细胞(myocyte cells)、卫星细胞(satellite cells)、肝细胞(hepatocytecells)、血球细胞(blood cells)、神经细胞(neuron cells)、脂肪细胞和任何组合所组成的一群组。
条文92：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述细胞暴露于基于小分子的重新编程(reprogramming)。
条文93：本发明的一些实施例提供所述可食用的体外肉，其中所述小分子选自于，但不限于CHIR9902、SB431542、RepSox、Parnate、Forskolin、TTNPB、DZnep、VPA、CHIR99021、PD0325901、PD173074、LIF、A83-01、BIX01294、AS8351、SC1、Y27632、OAC2、SU16F、JNJ10198409、LDN193189、NSC 228155、CN 009543V、AG1478、PD 153035、2-Me-5HT、D4476、RG108、BIO、SMI1、SMI2、5-氮杂胞苷、芬那米尔(phenamil)、GW7845、RG14620或哈尔明碱(Harmine)，噻唑烷二酮(thiazolidinediones，即罗格列酮rosiglitazone、吡格列酮pioglitazone、洛贝格列酮lobeglitazone)、IBMX及其任何组合所组成的一群组。
条文94：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述细胞可以在其基因组中稳定地包含一诱导型受控表达转殖基因系统或类似构建体。
条文95：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述诱导型受控表达转殖基因系统是TET-on或TET-off系统。
条文96：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中被表达的所述诱导型受控转殖基因是MyoD。
条文97：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述诱导型受控表达转殖基因系统被多西环素或类似的激活剂/失活剂激活或失活。
条文98：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述细胞在一可生物降解的支架中生长，所述可生物降解的支架包含在一封闭循环灌注回路中。
条文99：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述细胞来自于非人类动物来源：鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鹅、鸽子、野鸡、鸵鸟、牛(小牛)、鹿、山羊、绵羊(羊)、马、大羊驼、骆驼、兔子、袋鼠、鳄鱼、乌龟、龙虾、鲑鱼、金枪鱼、海豚、鲸鱼及其任何组合或相关物种所组成的一群组。
条文100：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述细胞来自人类来源。
条文101：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述细胞在非动物血清培养基中生长。
条文102：本发明的一些实施例提供所述可移植的体外组织，其中所述细胞在包含葡萄糖、氨基酸、胰岛素、激素，如无血清培养基中可的松和生长因子的培养基中生长。
如上文描述的和如下面的权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施例和方面在以下实施例中找到实验和/或计算的支持。
示例：
现在参考以下示例，它们与以上描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施例。
通常本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见例如"分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A laboratory Manual)"Sambrook等人所著(1989)；"分子生物学中的现行方案(Current Protocols in Molecular Biology)"Volumes I-III Ausubel,R.M等人所著(1994)；Ausubel等人所著"Current Protocols in Molecular Biology",JohnWiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"分子克隆实用指南(A PracticalGuide to Molecular Cloning)",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人所著,"重组DNA(Recombinant DNA)",Scientific American Books,New York；Birren等人所著"基因组分析：实验室手册系列(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series)",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057所述的方法；"细胞生物学：一实验手册(Cell Biology:A Laboratory Handbook)",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"目前的免疫学方案(Current Protocols in Immunology)"Volumes I-IIIColigan J.E.所著(1994)；Stites等人所著,"基础和临床免疫学(Basic and ClinicalImmunology)"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi所著,"细胞免疫学所选的方法(Selected Methods in Cellular Immunology)",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；现有的免疫测定法在专利和科学文献中有广泛的描述,例如请见美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771and 5,281,521；"寡核甘酸核成(OligonucleotideSynthesis)"Gait,M.J.所述(1984)；“核酸杂合(Nucleic Acid Hybridization)"Hames,B.D.和Higgins S.J.所著(1985)；"转录和转译(Transcription and Translation)"Hames,B.D.和Higgins S.J.所著(1984)；"动物细胞培养(Animal Cell Culture)"Freshney,R.I.所著(1986)；"固定的细胞和酵素(Immobilized Cells and Enzymes)"IRLPress,(1986)；"分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)"Perbal,B.,(1984)和"酵素学方法(Methods in Enzymology)"Vol.1-317,AcademicPress；"PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols:A Guide To Methods AndApplications)",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等人所著"蛋白质纯化和表征策略-实验室课程手册(Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual)"CSHL Press(1996)；所有这些都通过引用并入本文，如同在此完全阐述一样。本文档中提供其他一般参考。所述程序被认为是本领域公知的，并且是为了方便读者而提供的。所包含的所有信息都通过引用并入本文。
示例1：
用于鸡肝生长的封闭循环灌注回路：
肝脏是一种高营养、高价值的产品，由于纤维状基质和蜂巢状结构的丰度低，具有相对柔软的稠度。遗传修饰用于诱导鸡肝细胞和内皮细胞的增殖，允许优化封闭循环灌注回路以进行高密度组织生长。如上所述，封闭循环灌注包括允许生理添加营养物和去除毒素的透析单元，而不是完全的培养基更换。
1.1封闭循环灌注回路：
灌注系统由主要组织灌注回路和用于营养和毒素交换的次级透析回路组成(10)。主要回路包括培养基灌注溶液，使用蠕动泵进行再循环，通过带夹套的组织生长腔室、膜式氧合器、热交换器和气泡捕捉器，。氧合器用80％的O2、5％的CO2、15％的N2的混合物充气，保持恒定的pH值。
一部分灌注溶液通过Spectrum Labs中空纤维透析器(Rancho Dominguez，CA)转移到次级回路、膜面积为790平方公分、截留分子量为30kDa、速率为3毫升/每分钟/每克组织。次级回路通过逆流暴露于无蛋白质的透析液对灌注溶液进行透析，使用第三蠕动泵通过碳过滤器，进行再循环。系统内的温度保持在37℃。
透析的主要优点是分子量为66.5kDa的白蛋白保留在所述主灌注回路中。白蛋白的半衰期为20天，是生长因子、肽(例如胰岛素)和脂肪酸的载体蛋白。白蛋白和生长因子是培养基的主要成本驱动因素。
1.2模型细胞和组织生长：
最近已经证明E6/E7蛋白的表达允许在OSM刺激下(1)快速分化为(expiation)功能性人类肝细胞、肝脏内皮细胞和星状细胞。使用慢病毒报导分子，以及使用具有GFP的稳定感染的E6/E7LOW肝细胞，具有mCherry的内皮细胞和具有CFP的星状细胞用于装置的优化。这些荧光标记物在开始实际生产鸡肝之前帮助评估组织组织化(tissueorganization)和增殖速率。接种在柔软的水凝胶基质上，这种细胞混合物迅速形成增殖的肝脏类器官(11)。
细胞以1：1：0.1的比例分别与肝细胞、内皮细胞和星状细胞混合，离心并重新悬浮于0.1毫升的水凝胶基质中，所述基质是由无动物合成多肽所组成，孔径为50至200纳米(Sigma，A6982)。将水凝胶-细胞悬浮液注入孔径为50至1000微米的可生物降解的聚合物支架中，并置于带夹套的(jacked)组织生长腔室中。虽然水凝胶多肽将在5至7天内被天然细胞外基质取代，但聚合物支架将支持所述生长的组织14至28天，直至其达到显著质量，并且细胞不能被洗掉。
1.3增长优化：
为了优化组织生长和使营养物添加最小化，本发明人仔细分析了葡萄糖、谷氨酰胺(glutamine)、脂肪酸和白蛋白的组织摄取率，目的是保持不变。每4小时使用微流体开关板自动取样灌注溶液和透析液，以监测葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、脂肪酸和白蛋白含量(12)。使用光学传感器(13)动态测量氧含量。
使用数据确定培养基补充的速率和体积作为组织生长速率的函数。
每天使用共聚焦显微镜定量组织形态和生长速率。每24小时在灌注溶液中测量人类白蛋白和胆汁酸产生，以标记肝脏特异性功能。最后在生长7、14和28天后使用H&E和TUNEL染色评估不存在的坏死或雕亡。
示例2：
鸡肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞的无血清培养物的基于小分子的扩增的研究进展：
化学化合物为通常用于刺激无血清细胞生长的生长因子，提供了有吸引力的替代品。小分子比重组生长因子便宜得多，批次间差异较小，为非免疫原性且更稳定。
2.1开发和优化最小化的生长培养基：
鸡类成纤维细胞(fibroblasts)购自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)并在无血清培养基中扩增，所述培养基由补充有0.5毫克/毫升植物来源的白蛋白(CellastimTM)、0.6微摩尔浓度的亚油酸和油酸、0.6微克/毫升的大豆卵磷脂、7.5毫摩尔浓度的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Alanyl-L-Glutamine)、0.1微摩尔浓度的地塞米松、50微克/毫升的抗坏血酸和0.5U/毫升胰岛素(Eli Lilly)。所述最小化的培养基通常进一步补充有5纳克/毫升的bFGF、5纳克/毫升的EGF和30皮克/毫升的TGFβ1，以相当大的代价支持成纤维细胞增殖4倍。将细胞在完全培养基中扩增至PD(群体倍增，population doubling)15以产生冷冻原种(frozen stock)，并在PD 15和25之间使用。为了研究所有生长因子是否对于鸡类成纤维细胞扩增是必需的，本发明人评估增殖率为生长因子浓度的函数，旨在找到最小化的组合。
从受精卵中分离鸡类胚胎内皮细胞(embryonic endothelial cells)或从Charles River Laboratories(Wilmington，MA)购买。细胞在无血清内皮培养基中扩增，所述培养基由RPMI1640组成，补充有3.75毫克/毫升的植物来源的白蛋白(CellastimTM)、0.6毫摩尔浓度的亚油酸和油酸、0.6微克/毫升的大豆卵磷脂、7.5毫摩尔浓度的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Alanyl-L-Glutamine)、0.1微摩尔浓度的地塞米松、50微克/毫升的抗坏血酸和0.5U/毫升胰岛素(Eli Lilly)。所述最小化的培养基通常进一步补充有5纳克/毫升的bFGF、5纳克/毫升的EGF和10纳克/毫升的VEGF。将细胞在完全培养基中扩增至PD(群体倍增，population doubling)5以产生冷冻原种(frozen stock)，并在PD 5和10之间使用。为了研究所有生长因子是否对于鸡类内皮细胞扩增是必需的，本发明人评估增殖率为生长因子浓度的函数，旨在找到最小化的组合。
从受精卵中分离鸡类胚胎肌细胞或从Charles River Laboratories(Wilmington，MA)购买。所述细胞在无血清培养基中扩增，所述培养基由补充有0.5毫克/毫升植物来源的白蛋白(CellastimTM)、0.6微摩尔浓度的亚油酸和油酸、0.6微克/毫升的大豆卵磷脂、7.5毫摩尔浓度的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Alanyl-L-Glutamine)、0.1微摩尔浓度的地塞米松、50微克/毫升的抗坏血酸和0.5U/毫升胰岛素(Eli Lilly)。所述最小化的培养基通常进一步补充有5纳克/毫升的bFGF、5纳克/毫升的EGF和30皮克/毫升的IGF-1。将细胞在完全培养基中扩增至PD(群体倍增，population doubling)15以产生冷冻原种(frozenstock)，并在PD 5和10之间使用。为了研究所有生长因子是否对于鸡类肌细胞扩增是必需的，本发明人评估增殖率为生长因子浓度的函数，旨在找到最小化的组合。
鸡肝细胞购自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)，并接种在由Williams E培养基组成的无血清制剂中，所述培养基补充有3.75毫克/毫升的植物来源的白蛋白(CellastimTM)、0.2毫摩尔浓度的亚油酸和油酸、2毫摩尔浓度的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Alanyl-L-Glutamine)、0.1微摩尔浓度的地塞米松、5微克/毫升的抗坏血酸和0.5U/毫升胰岛素(Eli Lilly)。已经表明，这种无血清培养基支持遗传修饰的人类肝细胞的强烈扩增(1)。将细胞暴露于FPH1(BRD-6125)、FPH2(BRD-9424)和FH1(BRD-K4477)小分子，鉴别其增强未修饰的人肝细胞的增殖(7)。本发明人预期，由于肝再生信号传导途径的进化保守，将实现有限的增殖。鸡肝细胞的高通量筛选仍然可能没有小分子驱动扩增，但是其更佳昂贵。
2.2在高通量筛选中鉴定小分子生长促进剂
小分子的高含量筛选在Broad Institute of MIT and Harvard或等效的机器人筛选设施中进行。对鸡类成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞和肝细胞进行单独筛选。将细胞以10,000个细胞/平方公分的密度接种在384孔筛选板(Corning)中，在不含补充物的适当的最小化的生长培养基中。将孔板在37℃和5％CO 2下孵育并每天更换培养基。以15微摩尔浓度添加12,480种化合物的文库并孵育48小时。本发明人进行标准的MTT分析；获得的处理细胞的相图(phase image)和总DNA的Hoechst分析结果。为了鉴别功能性增殖命中(functional proliferation hits)，基于p值将阳性MTT和DNA增加进行整合。
将产生功能性增殖命中(functional proliferation hits)的化学物质组合在较小的筛选谱中，目的是鉴别多个最小化的功能组合，其产生增殖最大倍数增加。基于先前的报导(7)，本发明人期望在每个筛选中鉴别2至3个小分子。例如最近显示NSC-228155是EGF-R激动剂(16)。一旦鉴定出小分子混合物，本发明人试图以较低浓度添加回生长因子，以观察是否可以以成本有效的方式实现更大的增殖增强。
示例3：
基于小分子的鸡类肌肉细胞分化的研究进展
肌细胞扩增通常限于15次群体倍增，从每种分离物产生16克组织。然而，在模仿肌生成的多步骤过程中，肌细胞可以从多能干细胞分化而来(pluripotent stem cells)(17)。或者可以使用MyoD表达(18)或小分子混合物(8)将成纤维细胞转化为肌细胞。
多能干细胞每44±13小时增加一倍，其无血清培养基成本约为540美元/升。相比之下，成纤维细胞每21±3小时增加一倍，其无血清培养基成本约为272美元/升。这意味着使用现有技术，多能干细胞将在39天后以100,000美元/每公斤产生1公斤组织，而成纤维细胞将在18天后以50,000美元/每公斤产生。因此本发明人的方法主要集中于成纤维细胞向肌细胞的遗传分化和化学分化，研究多能干细胞以降低风险。
3.1产生表达四环素(tetracycline)依赖性MyoD的鸡类成纤维细胞
多西环素(Doxycycline，Dox)是四环素的类似物，可通过结合反向四环素控制的高级反式激活因子(reverse tetracycline-controlled advanced transactivator，rtTA2S-M2)而快速激活基因表达，所述激活因子作用于四环素反应元件(tetracyclineresponsive element(TRE))。Dox没有表现出明显的毒性，价格便宜并且在活化后可以容易地从细胞中洗掉。所述系统已被证明可靠地在鸡胚上发挥作用(19)。
本发明人通过在嘌呤霉素(puromycin)选择下引入pCAGGS-rtTA2S-M2和pTRE-MyoD质粒，而产生稳定表达Dox诱导型鸡类MyoD的鸡类成纤维细胞系。将鸡类成纤维细胞暴露于0.5纳克/每微升Dox48小时，并通过qRT-PCR评估MyoD表达。通过对肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MyHC)和肌动蛋白(titin，18)进行染色，在Dox诱导后7和12天，评估转化为肌细胞的情形。Dox诱导的肌肉细胞作为阳性对照并且基因工程(geneticengineering，GE)替代小分子诱导成纤维细胞转化成肌细胞。
3.2鉴别肌细胞转化的小分子混合物：
最近，通过促进重编程(reprograming)的小分子的两步组合，将小鼠成纤维细胞转化为心肌细胞；其包括CHIR9902、RepSox、Forskolin和VPA，随后是2i(CHIR99021和PD0325901)促进心肌发育的条件，其包括CHIR99021、PD0325901和LIF(9)。使用重编程和分化诱导因子CHIR99021、A83-01、BIX01294、AS8351、SC1、Y27632、OAC2、SU16F和JNJ10198409(8)的组合，类似地转化人类成纤维细胞。转化缓慢，需要20至30天，产生约6％的心肌细胞。
在斑马鱼、小鼠和人类细胞的筛选中，Xu(Xu等人所著，细胞其刊Cell 155,909-921,2013)及其同事鉴定了6个扩增肌肉祖细胞(expanded muscle progenitors)的小分子，包括腺苷酸环化酶激活剂，毛喉素(adenylyl cyclase activator,forskolin)。bFGF、毛喉素和GSK3b抑制剂BIO的组合诱导了人类诱导的多能干细胞的骨胳肌分化(21)。在不同的筛选中，一组被识别的SMI1和SMI2强而有力地诱导了多能干细胞的骨胳肌分化，而其他则显示5-氮杂胞苷(5-azacytidine)可以类似地促进肌细胞生成(22)。这些结果表明，使用重编程混合物(6)转分化骨胳肌的两步程序，遵照促进多能干细胞中骨胳肌肌生成(myogenesis)的因子，可以产生有希望的结果。
本发明人的方法是用EGFP报导基因稳定转染鸡类成纤维细胞用于MyHC以进行高通量筛选(8)。将细胞暴露于上文讨论的以及实施例2.2中所鉴定的重编程和肌原性的因子的各种不同混合物。诱导20天后，基于EGFP荧光和肌纤维形态评估细胞。为了鉴别功能性命中(functional hits)，本发明人基于p值整合了阳性MyHC和形态学命中。
3.3鸡类多能干细胞的发展直接分化：
当其从输卵管下降时，禽类胚胎在子宫内仅花费20小时。当下蛋时，外胚层(epiblast)是由20,000至50,000个细胞组成的单层。鸡类胚胎干细胞来自这种胚盘(blastodisc)并且可以在培养物中延续，产生所有体细胞谱系但不产生生殖系(3)。与小鼠胚胎干细胞一样，它们需要LIF保持未分化。除LIF外，培养基还包括bFGF、IGF-1、SCF和IL-11(23)。
最近针对小鼠和人类多能干细胞发表了用于分化肌纤维的无血清方案(17)。在含有10纳克/毫升的BMP4的N2B27培养基中培养2天，在含有15％敲除血清(knockout serum)、0.5％DMSO、0.1微摩尔浓度LDN193189和1微摩尔浓度CHIR99021的DMEM培养基培养4天，诱导小鼠干细胞向中胚层表型。然后中胚层细胞在含有15％敲除血清、10纳克/毫升的HGF、2纳克/毫升的IGF-1、20纳克/毫升的bFGF和0.1微摩尔浓度LDN193189的DMEM培养基中培养8天，分化成骨骼肌。所述方案稳健地在14天内产生30至60％的肌肉细胞。
如上所述，其他组鉴别了额外的小分子，其驱动多能干细胞向骨胳肌细胞的分化。这些包括bFGF、毛喉素和BIO(21)、SMI1和SMI2(24)、最后是5-氮杂胞苷(22)的组合。
本发明人的方法是将现有的无血清小鼠方案转化为鸡类胚胎干细胞，同时考虑到禽类发育途径的差异(25)。先前研究中鉴定的小分子用于增强分化和增加肌纤维密度。
示例4
建立封闭循环灌注回路，用于鸡类肌肉的生长和分化
肌肉组织是由内皮毛细血管所滋养的高度包裹的肌纤维簇。由间充质(mesenchyme)所分泌的纤维状胶原(fibrillar collagen)在组织一致性中起重要作用。本发明人的方法是在包含在实施例1中优化的封闭环状灌注回路中可生物降解的支架培养高密度的鸡类成纤维细胞和内皮细胞。剪切力(shear forces)有助于对准由生长的成纤维细胞所沉积的胶原纤维。一旦达到足够的质量，将小分子引入分化培养基中，将成纤维细胞转化为骨胳肌细胞(实施例3)并使肌纤维沿着多条剪切排列的纤维进行排列。
封闭循环灌注包括一透析单元，其允许营养物质的生理添加和毒素的去除，而不是完全的培养基更换。透析的主要优点是分子量为66.5kDa的白蛋白保留在主灌注回路中。白蛋白的半衰期为20天，是生长因子和脂肪酸的载体蛋白。白蛋白和生长因子是培养基的主要成本驱动因素。
4.1封闭循环灌注回路
这里使用在实施例1.1中优化的灌注系统。简而言之，主要回路包括培养基灌注溶液，使用蠕动泵通过一带夹套的(jacked)的组织生长腔室、一膜式氧合器(80％O2、5％CO2和15％N2)、热交换器(37℃)和一气泡捕捉器，进行再循环。将一部分灌注溶液转移到一中空纤维透析器中，膜面积为2200平方公分，截留分子量为30kDa，速率为3毫升/分钟/每克组织。次级回路通过逆流暴露于无蛋白质的透析液，以对灌注溶液进行透析，并使用第二蠕动泵通过碳过滤器进行再循环。
4.2模型细胞和组织生长
在此使用在实施例1.2中优化的细胞接种。所述实验使用实施例3.1中开发的Dox-MyoD鸡类成纤维细胞和10：1比例的内皮细胞的混合物。简而言之，将细胞悬浮在0.1毫升的水凝胶基质中，所述基质由孔径为50至200纳米的无动物合成多肽所组成(Beaver Labs)。将水凝胶-细胞悬浮液注入孔径为50至1000微米的可生物降解的聚合物支架中，并置于带夹套的(jacked)的组织生长腔室中。虽然水凝胶多肽在5至7天内被天然细胞外基质取代，但聚合物支架支撑生长的组织14天，直至其达到显著质量并且细胞不能被洗掉。固定5天和10天后取出支架并切片进行分析。本发明人对I型胶原沉积和排列进行了染色，并使用H&E染色，分析结缔组织密度和健康状况。
本发明人引入0.5纳克/微升Dox持续4天，诱导成纤维细胞转化为肌细胞。然后将Dox洗掉持续4天，用IFG-1代替，以促进细胞与肌纤维的融合。在第14天和第18天取出组织固定并切片用于分析。本发明人对MyHC、结蛋白(desmin)和肌动蛋白(titin)染色，并使用H&E染色分析所得的肌肉组织密度和健康。比较结蛋白和MyHC阳性细胞，以及qRT-PCR评估肌肉形成的程度。
4.3增长优化
优化组织生长以调节生长细胞的饲喂参数和所用的分化方法。分析葡萄糖、谷氨酰胺、脂肪酸和白蛋白的组织摄取率，旨在保持不变。每4小时使用微流体开关板自动取样灌注溶液和透析液，以监测葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、脂肪酸和白蛋白含量(12)。使用光学传感器(13)动态测量氧含量。数据用于确定培养基补充的速率和体积，其作为组织生长速率的函数。
使用无毒，分泌的细胞活力指示剂AlamarBlue(Thermo Fisher Sci。)定量组织生长速率。最后，在生长6,12和18天后使用H&E和TUNEL染色评估是否存在坏死或雕亡。
4.4细胞特异性方法：
目前的一些实施例是在每个回路中达到150克的鸡肉组织，相当于一个大的鸡腿或鸡胸肉。这代表了在大约18次群体倍增中实现的3×1010个细胞的质量。
对于成纤维细胞，代表16至18天的生长。MyoD诱导的转化是快速的(18)，允许成纤维细胞生长10天并在培养物中使它们分化8天。相反，据报导，基于小分子的重编程方法(8)(9)对于心肌细胞而言至少需要24至30天。虽然发育上更简单的骨胳肌分化无疑会更短，但实施例3.2中的见解在决定初始接种密度和转化时间方面扮演重要角色。
重要的是，所述细胞密度代表胚胎干细胞生长33至35天。目前的无血清分化方案(17)仅需要14天的分化。因此，鸡类胚胎干细胞可以以更高的密度接种并在多能培养基中生长19天。胚胎干细胞生长的主要挑战是组织不能被内皮化，因为内皮细胞会促进分化。这意味着个体胚胎干细胞簇的直径必须小于0.5毫米，否则核心坏死。一种解决方案是在可生物降解的藻酸盐微粒(Quad Technologies)上培养胚胎干细胞，使悬浮物在组织生长腔室内单独生长。本发明人先前已成功地在类似的高密度悬浮培养物中培养人类胚胎干细胞(26)。
示例5：
基于鸡类的实验室所生长的肉：产生自发永生化的成纤维细胞的细胞系
以下实施例说明了非限制性细胞，其可用于体外培养肉。
鸡类细胞的无动物、高密度扩增-各种独立的细胞来源可用于体外培育肉类。
(1)分离并扩增鸡类胚胎成纤维细胞直至发生自发永生化。
(2)使用非整合载体或小分子产生永生化的鸡类iPSC系，通过常规分化可以从其中获得成纤维细胞。
(3)可以使用几种已建立的ATCC细胞系。这些包括DF1(鸡)、QM7(鹌鹑)和DE(鸭)。
(4)如文献(Intarapat&Stern 2013)中所述，使用整合载体建立鸡类iPSC系。
鸡类胚胎成纤维细胞的自发永生化细胞系的诱导
实验方法：受精的肉鸡蛋在38.5℃下在潮湿的培养箱中培养10至12天。在第10至12天之间打开卵并取出胚胎。去除头部、四肢和内部器官，机械提取细胞并在补充有15％FBS(胎牛血清)和2毫摩尔浓度的L-丙胺酸基-L-谷氨酰胺(L-Analyl-L-Glutamine)的DMEM/F12培养基中接种于组织培养物处理的塑料上。
实验结果：在这些条件下，在没有任何其他生长因子的情况下，成纤维细胞生长于培养物，导致原代鸡胚成纤维细胞(chicken embryonic fibroblasts，CEF)的同源族群(图2A至图2B)。每个胚胎分离大约2×107个细胞，平行培养多个群体。初始CEF形态被拉长，随着传代数增加而变得更紧凑(图2B和数据未显示)。大多数CEF培养物因族体倍增(population doubling，PD)30次至40次而衰老(数据未显示)；在崩坏中幸存的2至3个菌落成为自发永生化的鸡类成纤维细胞(CSIF；图2C)。CSIF显示成纤维细胞形态并且通过90次PD显示出18±2小时的倍增时间(图2E)。
示例6：
基于鸡类的实验室所生长的肉：用于传播自发永生化的成纤维细胞的无血清培养基的鉴别：
用于CSIF繁殖的无血清培养基的开发：在补充有15％FBS和2毫摩尔浓度的L-丙胺酸基-L-谷氨酰胺(L-Analyl-L-Glutamine)的DMEM/F12培养基中，CSIF很容易在组织培养塑料上生长(图2D)。有几种用于人类和小鼠成纤维细胞生长的无血清培养基配方，包括PCS-201-040(ATCC)和TheraPEAK(Lonza)，均未能支持原代CEF或本发明人获得的新型CSIF系的增殖。(图2D、图2E和未显示的数据)。
为了开发支持CEF和CSIF培养的无血清培养基，本发明人配制了由DMEM/F12组成的最小化的培养基，其补充有0.1微摩尔浓度的地塞米松、10微克/毫升的胰岛素、5.5微克/毫升的转铁蛋白、和5纳克/毫升的硒(ITS)，12微摩尔浓度的亚油酸和微摩尔浓度的12μM油酸，和2毫摩尔浓度的L-丙胺酸基-L-谷氨酰胺(L-Analyl-L-Glutamine)。将细胞接种在含有FBS的培养基中，并在附着过夜后，转移到基本培养基中。基础培养基补充了生长因子和激素，表明肝素和T3对CSIF生长的影响很小(数据未显示)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，10纳克/毫升)的添加是必不可少的(图3C和图3F)，显示20±2小时倍增时间(数据未显示)。此外，表皮生长因子(EGF，5纳克/毫升)、前列腺素E2(PGE2，0.01毫摩尔浓度)和生长激素(GH，10纳克/毫升)支持CEF和CSIF的增殖(图3D、图3E、图3F和数据未显示)。
本发明人测试的最佳生长培养基由补充有地塞米松(0.1毫摩尔浓度)，1×ITS+3(Sigma，I2771)、bFGF(10纳克/毫升)、EGF(5纳克/毫升)的DMEM/F12组成，和PGE2(0.01毫摩尔浓度)导致与含有15％FBS的培养基相似的生长速率。
在某些条件下，胰岛素可以用IGF-1(5纳克/毫升)或稳定的长R3IGF-1[Sigma(5纳克/毫升)]代替。EGF可以用EGF-R激动剂[NSC-228155(Sakanyan等人所著的，科学报导Sci.Reports.2014)]代替，浓度为5至50纳克/毫升、FGF可以类似地用小分子或合成激动剂替代，例如C19-jun(Ballinger等，Nature.Biotech.1999)，浓度为10至20纳克/毫升。
基本上如上文实施例2中所述进行小分子筛选。第一个小分子筛选试图鉴别可以替代培养基中的生长因子和激素的分子(例如胰岛素、FGF、EGF、TGFβ)。因此进行一次连续去除一种生长因子或激素，旨在以小分子置换来达到相同的生长速率。
内皮细胞与成纤维细胞的共培养允许本发明人去除由内皮天然产生的一些生长因子。另外或可替代地，将细胞工程化以特异性地产生这些生长因子，从而降低总成本。
应当注意，在无血清培养基中缺乏附着因子(例如玻连蛋白，纤连蛋白)使得难以连续传代CEF或CSIF。由于必须避免动物或人类衍生的细胞外基质蛋白，因此可以使用其他天然重组蛋白和/或合成聚合物，如聚-D-赖氨酸(poly-D-Lysine)，在不存在血清的情况下繁殖细胞。
示例7：
基于鸡类的实验室所生长的肉：在无血清培养基中将自发性免疫鸡成纤维细胞转化为脂肪细胞：
在无血清培养基中CSIF转化为脂肪细胞：在哺乳动物物种中，在胰岛素和可的松(例如地塞米松)存在下，使用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)可以容易地将前脂肪细胞分化成脂肪细胞。将前脂肪细胞以70％汇合(confluence)在含有0.5毫摩尔浓度的IBMX、0.1毫摩尔浓度的地塞米松和10微克/毫升的胰岛素的含血清培养基中接种3天，然后仅用胰岛素处理3天，然后在第6天取出完成分化。所述方案适用于原代前脂肪细胞和前脂肪细胞系，如3T3-L1和3T3-F442A，但不适用于成纤维细胞。最近的工作鉴定了多种小分子，其可以在含有血清的培养基中，增强前体脂肪细胞分化成脂肪细胞，包括PPARg活化剂：(phenamil)，GW7845，RG14620或(Harmine)(Park等人所著，脂质研究期刊J.Lipid Research，2010；Waki等人所著，细胞代谢期刊Cell Met.2007)。临床上批准的以PPARg为标的的噻唑烷二酮(thiazolidinedione)家族药物(即罗格列酮rosiglitazone、吡格列酮pioglitazone、洛格列酮lobeglitazone)可能对前脂肪细胞具有相似的作用。
鸡类的前脂肪细胞尚未被鉴定，导致大多数组使用源自鸡类脂肪组织的基质-血管细胞(Matsubara等人所著，Comp.Bio.&Phys 2008)。然而，IBMX和地塞米松对这些鸡前脂肪细胞没有影响，而暴露于200至400微摩尔浓度的油酸诱导它们在血清存在下分化为脂肪细胞(Zhouchun等人所著，生物科学报导Biosci.Rep.2014；Matsubara等人所著，Comp.Bio.&Phys 2008)。
将原代CEF区分为脂肪细胞的工作表明了暴露于400微摩尔浓度的油酸和20％血清，诱导长形的原代细胞中的脂质积累(Liu等人所著，Comp.Bio.&Phys 2009)。AishlinElizabeth Lee(俄亥俄州立大学，2013年)的硕士论文表明，对100至300微克/每升的硒和2％的血清有相似的效果。两种工作均使用在血清存在下培养的原代鸡类细胞。
开发用于在无血清条件下自发永生化的鸡类成纤维细胞(CSIF系)转换的流程方案，本发明人以70％汇合(confluence)将CSIF接种在补充有地塞米松(0.1微摩尔浓度)、1XITS+3(Sigma，I2771)和bFGF(10纳克/毫升)的优化的无血清DMEM/F12培养基中。CSIF细胞用单独与200至400微摩尔浓度的油酸处理，或结合0.5毫摩尔浓度的IBMX处理，或10毫摩尔浓度的FDA批准的小分子罗格列酮处理4或7天。虽然所有油酸处理都增加了脂质积累，但仅添加IBMX或罗格列酮支持圆形脂肪形成表型(图4A至图4D)。
刺激肌细胞线粒体增殖：额外地或可替代地，双PPARα/γ激动剂如柚苷配基(naringenin)(Goldwasser等人所著PLoS One 2010)用于刺激肌细胞中线粒体的增殖，扩大其蛋白质含量，并且其余的成纤维细胞经过脂肪分化(adipogenic differentiation)形成脂肪。
示例8：
基于鸡类的实验室所生长的肉：自发永生化的鸡类成纤维细胞系转化为肌细胞
产生Dox诱导型MyoD1和PPARγ载体：产生Dox诱导型MyoD1和PPARγ载体。这些载体能够分别以高效率将鸡类成纤维细胞(原代或永生化)转化为肌细胞和脂肪细胞(数据未显示)。
先前的工作表明，MyoD1基因的表达足以诱导人类和小鼠成纤维细胞的肌生成。在哺乳动物中，通过肌细胞生成素(myogenin，MYOG)，进行平行但连接的肌生成(myogenesis)途径。
实验结果：
CSIF遗传转化成肌细胞的：为了检查鸡的细胞是否可能转化为肌细胞，本发明人产生了几种核酸构建体(载体)，如图6至图8和12所示。第一种构建体[图6“pInducer-VP64-cMyoD1”，SEQ ID NO：3]包括克隆到Dox-诱导型慢病毒载体(Dox-inducible lentiviralvector，pInducer20)的鸡类MyoD1基因(SEQ ID NO：5)，与VP64转录激活因子(VP64transcriptional activator，SEQ ID NO：6)融合，已经显示改善MyoD1诱导的小鼠细胞分化(Kabadi等人所著，ACS合成生物学ACS Synthetic Biology，2015)。为了表达Dox可诱导的鸡类MYOG，其包含cMyogenin编码序列(SEQ ID NO：7)，创建第二慢病毒载体(SEQ IDNO：2，图7)，在最小CMV启动子(SEQ ID NO：8)控制下。为Dox诱导型鸡MYOD1表达产生第三种慢病毒载体(SEQ ID NO：1，图12)，其包括在最小CMV启动子(SEQ ID NO：8)控制下的cMyoD1编码序列(SEQ ID NO：5)。对所有三种载体进行测序并发现无突变(数据未显示)。
为了快速检测培养物中的肌生成，本发明人为大鼠肌球蛋白轻链-3启动子-增强子(rat myosin light chain-3promoter-enhancer，rMLC3-GFP)，创建了GFP报导构建体(慢病毒报导构建体；SEQ ID NO：4，图8)，其包括大鼠MLC3增强子(SEQ ID NO：10；来自大鼠MLC3基因的1.5kb增强子序列)、大鼠MLC3启动子(SEQ ID NO：11；628bp启动子序列)和COP-GFP编码序列(SEQ ID NO：12)。在所述慢病毒报导基因构建体中，大鼠MCL3增强子和启动子驱动COP-GFP的表达。已经证明所述报导基因在鸡胚和细胞中是特异性和有效的(McGrew等人所述，BMC发展生物学BMC Developmental Biology 2010)。将各种构建体引入293T细胞中以产生慢病毒。
用慢病毒载体感染原代CEF和CSIF系3次，并在一天后分裂。将细胞在含有15％血清的标准DMEM/F12培养基中培养。通过多西环素诱导CEF和CSIF培养物，并随后追踪30天。虽然未诱导的培养物对GFP呈阴性(数据未显示)，但CEF和CSIF在培养的第11天显示MLC3的高度表达，其中细胞形成不同的纤维并维持至培养的第30天(图5B和图5C)。免疫荧光分析显示F-肌动蛋白组织化(F-actin organization)和多核(合胞体)纤维(multinucleated(syncytia)fiber)形成(图5D)。染色显示的α1-skeltal肌肉肌动蛋白(α1-skeltal muscleactin ACTA1)以及肌钙蛋白T(Troponin T)的明显诱导早在诱导的第7天显示出清晰的肌肉表型(图5E)。
如上文实施例3中所述，使用用于大鼠肌球蛋白轻链-3启动子-增强子的GFP报导构建体(慢病毒报导基因构建体)进行一小分子筛选，其旨在鉴别可在不存在Dox诱导型MyoD1的情况下将成纤维细胞转分化为肌细胞的小分子(图8)。因此，本发明人使用最近显示的小分子混合物的变体将小鼠和人类成纤维细胞转分化为心肌细胞(Cao等人所著2016；Fu等人所著2015)。GFP连接的MLC报导分子确保快速检测到成功的转化，如图5B至图5C所示。
应该注意的是，在重编程步骤中存在关于使用可影响DNA结构的一些小分子的调节问题。监管机构已经在人类再生医学中研究这一问题，而其他研究机构正在迅速生产用于转化的替代性小分子。与再生医学方法相反，本发明的一些实施例的灌注系统可以在所述过程终止之前快速冲洗系统并除去任何残留的小分子。另外或可替代地，可以使用Dox-诱导型分化方法，如图5A至图5E所示。
随着时间的推移进行灌注溶液和组织的代谢组学(metabolomic)分析以鉴别哪种营养素是限制速率的(即缺失)。建立组织的代谢通量平衡模型(metabolic flux balancemodel，如Levy等人于2016所述)，其允许观察通量变化并确定细胞的代谢需求。在获取中引入生长因子，并且通过蛋白质阵列分析确定它们被去除，因为小分子将取代它们。使用Jobst Technologies(Freiburg,German)代谢传感器和氧传感器进行代谢分析，显示增殖的CSIF以2.4纳摩尔/每分钟/每106个细胞的速率消耗氧气，以1.8纳摩尔/每分钟/每106个细胞的速率消耗葡萄糖，并在生长期期间以198皮摩尔/每分钟/每106个细胞的速率产生乳酸。
示例9：
生产基于植物的肉类替代产品与实验室生长的脂肪的杂合物：
一肉品类似物，也称为肉类替代品，近似于特定类型肉类的某些美学品质(主要是质地、风味和外观)或化学特性。许多类似物基于谷类、麸质或豆类，如大豆或豌豆。2014年全球肉类替代品市场为33亿美元，复合年增长率(CAGR)为7.5％，其中包括蔬菜汉堡，大豆热狗和鸡块等产品。然而，这些产品不能模仿动物肉的风味和香气。最近关于植物性肉类替代品的研究发现了发酵的豆血红蛋白(称为leghemoglobin，也称为leghaemoglobin或legoglobin)作为类似血液的金属风味的来源。使用分子美食工具公司(moleculargastronomy tools comapnies)，(如Impossible Foods和Beyond Meat等公司)生产的碎肉馅饼具有牛肉质地和香气。然而与蛋白质结合的饱和脂肪的烹饪产生了独特的肉味。目前的产品使用椰子油或棕榈油作为棕榈酸盐(16：0)的来源，在室温下是固体，但在62.9℃时迅速融化。这导致油腻、滴水产品不同于真正的牛肉。同样地，Beyond Meat等几家公司挤出层状豆类蛋白质，以创造鸡肉条的质地和口感。缺乏类似的动物脂肪导致干燥的口感与真正的鸡肉不同。
为了生产动物脂肪、CSIF在无血清培养基中培养，所述培养基由DMEM/F12组成，补充有地塞米松(0.1微摩尔浓度)、bFGF(10纳克/毫升)、长IGF-1(Sigma I1271)(5纳克/毫升)、12微摩尔浓度的亚油酸和2毫摩尔浓度的L-丙胺酸基-L-谷氨酰胺(L-Analyl-L-Glutamine)。将细胞在补料分批生物反应器、灌注生物反应器或上述封闭循环灌注中培养至密度为10×106个细胞/每毫升。培养基进一步补充400微摩尔浓度的油酸和10微摩尔浓度的罗格列酮。细胞获得脂滴并达到100×106个细胞/每毫升的密度。将脂肪细胞浆液(slurry)浓缩并作为原料加入到由谷类或豆类蛋白质分离物所组成的植物基质中，如豌豆蛋白质有机粉末(Now Sports)。原料密度根据所需的最终产品而变化。鸡条需要5％至10％的实验室生长的脂肪细胞，在最终产品中产生约1.5×108个细胞。汉堡包需要10％至20％的实验室生长的脂肪细胞，在最终产品中产生约3×108个细胞。
实施例10：
在搅拌的生物反应器中生成鸡肉或小块：
在搅拌的生物反应器中培养鸡类成纤维细胞：鸡类成纤维细胞可以在搅拌的生物反应器(320)中于250至400毫生体积的小型单次使用容器中培养。
将细胞聚集成小的微团簇(micro-cluster)，并在没有微载体珠(micro-carrierbeads)的情况下在悬浮液中培养。这允许细胞的高密度生长，高达4×106至6×106个细胞/每毫升。达到所述密度后，准备密度为200×106个细胞/每克的鸡肉饼或块状物，以用于公开品尝。
或者，成纤维细胞可以如前所述在胶原包被的微载体珠(例如SoloHillEngineering)上生长(Ang&Ma Sha 2015)。
实施例11：
鸡类胚胎内皮细胞的建立和分离：
鸡类诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)分化成内皮细胞：使用鸡类成纤维细胞(非永生化的)，本发明人基本上如Vodyanik等描述的那样产生鸡类诱导的多能干细胞(iPSC)。然后鸡类iPSC以与人类和小鼠来源的细胞类似的方式用于鸡类内皮细胞的分化(Giacomelli等人所著，Development 2017)。iPS衍生的鸡类内皮细胞可以用于有限的群体倍增(至多20)或可以用于产生如下所述的自发永生化的内皮细胞。
鸡类内皮细胞的自发永生化：鸡类微血管内皮细胞，其来自商业来源(CharlesRiver Labs)或根据已建立的方案从幼鸡中分离(Twal&Leach所著，体外细胞发展生物学动物期刊In Vitro Cell.Dev.Biol.Animal 1996)然后在标准培养基中培养50微克/毫升的I型胶原蛋白或0.2％明胶，如EGM2mv(Lonza，Switzerland)或含有bFGF(20纳克/毫升)，EGF(10纳克/毫升)和人血浆纤连蛋白(10微克/毫升)的无血清制剂(如ThermoFisher#11111044)，直至发生自发永生化，从而获得未经遗传修饰的鸡类内皮细胞系。
值得注意的是，本发明人能够从购自Vec Technologies(Rensselaer，NY)的大鼠心脏微血管内皮细胞中获得自发永生化内皮细胞，至少达到120倍的群体倍增(数据未显示)，从而证明自发永生化内皮细胞是可行的。
实施例12：
利用海绵生成鸡的肌肉：
通过在海绵(支架)上共培养自发永生化的成纤维细胞和自发永生化内皮细胞来产生鸡的肌肉组织：本发明人设计鸡的肌肉的产生，通过将自发永生化鸡类成纤维细胞和自发永生化的大鼠内皮细胞的混合物接种于一可生物降解的大孔海绵，如胶原水凝胶(collagen hydrogel)，可以快速血管化和使营养均匀分布。微组织以共聚焦和电子显微镜来表征。
其他合适的海绵(支架)包括但不限于聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)或聚(乳酸-共-羟基乙酸)(poly(lactic-co-glycolic acid))、海绵、聚乙二醇酸海绵(polyglicolic acid sponges)、variotisTM(Biometic，AU)或CelluspongeTM(羟丙基纤维素hydroxypropyl cellulose，Bio-Byblos目录号Z741057)。
应注意，通过灌注系统避免细胞损失的一种可能方式是首先将细胞嵌入可注射的水凝胶多肽基质中，然后将其注入可生物降解的海绵中。
在灌注下培养微组织支架，追踪营养物和生长因子的细胞增殖和代谢摄取，如下表2所示。即使在没有细胞的情况下，也监测系统的非特异性吸收，因为这可能导致肽和脂质的损失。
表2：
代谢通量 测量值
耗氧率 2.4纳摩尔/分钟/10<sup>6</sup>细胞
葡萄糖摄取率 1.8纳摩尔/分钟/10<sup>6</sup>细胞
乳酸生产率 :198皮摩尔/分钟/10<sup>6</sup>细胞
将生长速率和代谢参数重新引入模型并调整系统参数。
在没有透析的情况下测定细胞生长和最大细胞密度。
在灌注下成功证明细胞生长之后，组织的组织化和适当的血管连通性与分布的特征如图11A至图11C所示。将自发永生化的鸡类成纤维细胞(spontaneously immortalizedchicken fibroblasts，CSIF)和自发永生化的大鼠微血管内皮细胞(spontaneouslyimmortalized rat microvascular endothelial cells，RCEC)以150×106CSIF/毫升和15×106RCEC/毫升的密度悬浮在胶原蛋白1型支架中并接种用于显微镜评估和灌注。隔夜形成高密度组织并压缩胶原支架。如磺酰罗丹明B(sulforhodamine B)染色所示，培养的细胞显示出高蛋白质含量(图11A)。将接种在生物反应器中的组织密封并在不含抗生素的无血清培养基中灌注11天。没有观察到细胞质量的损失。共聚焦分析显示血管结构和相关组织的清晰组织化。
生长因子和细胞因子用于定义血管成熟。组织结合和生长实时成像和终点显微镜评估来表征。一旦细胞密度超过营养摄取，通过嵌套(nested)透析回路增加灌注速率以快速去除毒素，同时向生长的组织添加稳定的营养供应。上述模型显示，支持细胞生长所需的最小灌注速率随时间呈指数增加或与组织质量线性增加，以提供细胞的氧消耗速率。在氧气为21％的环境中，维持1千克组织所需的最小灌注速率为36.9毫升/秒，但如果在氧合器中氧气分压升高至95％则仅需要8.2毫升/秒。通过使用氧载体如全氟化碳乳液(perfluorocarbon emulsion，例如Fluosol)或改性血红蛋白(例如Hemopure)增加介质的载氧能力，可以降低最小灌注速率。是一种基于血红蛋白的氧载体，由HbO2Therapeutics LLC生产，其氧携带能力为1.39毫升O2/克Hb，这意味着如果我们每毫升培养基中加入3.55微克的Hemopure，我们使氧含量加倍，减少灌注大量的组织所需要的灌注速度。
所述模型还表明葡萄糖不是灌注的限制因素，因为低于0.4毫升/秒的流速可以向超过1千克的细胞提供足够的葡萄糖。然而，由于没有补充葡萄糖，1千克组织将在48分钟内消耗系统中的所有葡萄糖。组织生长需要总共140克葡萄糖。当组织质量超过24克时，葡萄糖才变得有限，并且需要在生长的最后两天以每小时的间隔加入葡萄糖。
或者，在可食用的中空纤维筒中探索组织生长，其中在没有整合血管网络的情况下营养供应均匀分布。在此筒体的纤维由可食用的天然或合成聚合物制成，例如纤维素(FiberCell，#C3008)，并且细胞形成围绕纤维的团块。纤维素被FDA批准为GRAS，用于控制水分和切碎的起司、面包和各种酱汁的稳定剂。
实施例13
根据本发明的一些实施例，设计了一种原型系统。原型系统在图2中示意性地示出，并且是基于封闭循环透析生物反应器。核心回路是循环灌注的生物反应器，体积为1至5升，生长的肌肉组织从20毫克增长到1000克，并使用中空纤维筒、填充床设计或血管化嵌入组织的配置来保留细胞。持续增加百分比的生物反应器流出物通过逆流透析而被循环，其孔设计为排除白蛋白，截留分子量约为30kDa。由于在所述过滤步骤期间不存在细胞，它可以在高压下发生。所述设计保留了白蛋白，并且在其中生长因子和脂质携带在培养基中。另一种灌注使透析液循环通过过滤器，所述过滤器除去氨和毒素(例如沸石分子筛(Zeolitemolecular sieve))。所述设计可以达到动物的体积/质量比，标称为每公斤质量100毫升。据估计，每5公升生物反应器体积可使用约2公升培养基。这种设计每10天可产生2.5千克质量，仅消耗2升培养基，因为它不需要接种适应(seed train)。仅对于培养基成本而言，这相当于每公斤质量4美元。
资本成本也被考虑在内。使用现成组件的零件的当前估计约为7,000美元，这表明具有5升生物反应器腔室的系统的制造成本约为300美元。拥有5000个此类系统的生产设施的成本约为150万美元，因此整个设施估计约为500万美元。假设每年相同的10％的折旧和维护成本，则可获得约450,000千克/年的生产能力，每年维持约500,000美元的成本。这导致每千克质量产生的资本成本仅为约1.1美元。
原型系统由主要组织灌注回路和用于营养和毒素交换的次级透析回路组成。主要回路包括培养基灌注溶液，其使用蠕动泵通过带夹套的(jacked)的组织生长腔室、氧合器、热交换器和气泡捕捉器而进行再循环。氧合器用95％O2、5％CO2和15％N2的混合物充气，保持恒定的pH。
一部分灌注溶液通过中空纤维透析器转移到次级回路，例如Spectrum Labs(Rancho Dominguez，CA)，膜面积高达790平方公分，截留分子量为30kDa(人体肾脏总过滤面积只有516.1平方厘米)。本实施例的透析的一特别的优点是分子量为66.5kDa的白蛋白保留在主灌注回路中，如上文进一步详细描述的。
次级回路使用逆流透析灌注溶液以使扩散最大化，以抵抗无蛋白质的透析液，使用另一蠕动泵通过一氨过滤器进行再循环。氨过滤器，如沸石捕捉器，从溶液中清除氨。生物反应器内的温度在38℃至40.5℃之间进行了优化，模仿了鸡类的正常体温。
还考虑了灌注溶液和营养素消耗率。在环境条件下，21％(160mmHg)氧气的分压导致浓度为220纳摩尔/毫升的培养基。发明人使用SeaHorse生物分析仪显示鸡类胚成纤维细胞消耗O22.4纳摩尔/每分钟/106细胞。考虑到1g组织含有约200×106个细胞，约36.9毫升/每秒的灌注速率足以在标准培养箱气体压力下维持1公斤的组织。如果氧分压升至95％，则灌注速率约为8.2毫升/每秒就足够了。
另外考虑葡萄糖消耗。使用在线传感器，测量鸡类胚胎成纤维细胞的葡萄糖摄取率为1.8纳摩尔/每分钟/106细胞、乳酸产生率为198皮摩尔/每分钟/106细胞细胞。考虑到DMEM/F12培养基含有3.15克/公升的葡萄糖，维持1公斤组织所需的灌注速率为0.36毫升/每秒。因此葡萄糖不是培养基灌注的限制因素。然而在晚期培养期间，任选地缩窄的间隔，优选连续添加葡萄糖，因为在所述速率下，1公斤组织在约48分钟内消耗1公升培养基中的葡萄糖。
图10A和图10B是显示产生质量和施加的灌注速率(图10A)和累积的葡萄糖消耗量(图10B)的曲线图。在这个例子中，采用了以倍增时间常数20h为特征的指数增长率。在所述生长速率下，优选从第13天开始添加葡萄糖，以提供葡萄糖需求。
选择蠕动泵以提供至少36毫升/每秒的灌注速率，特别是在循环的最后几天(例如第13天开始)。然而可以使用不同的策略(例如氧转运物oxygen transporter)来降低所述速率，以增加培养基中O2的基础水平。例如，是由HbO2Therapeutics LLC生产的基于血红蛋白的氧载体，其具有1.39毫升O2/克Hb的氧携带能力，这意味着每毫升培养基添加3.55微克的Hemopure，使氧含量可以加倍，并且灌注速率可以降低2倍。
下表3提供了补料分批(fed-batch)过程、浓缩灌注过程和根据本发明示例性实施例的技术之间的比较。
表3：
*工厂内有5,000个小型5L的生物反应器
虽然本发明结合其具体实施例而被描述，显而易见的是，许多替代、修改及变化对于那些本领域的技术人员将是显而易见的。因此，其意在包括落入所附权利要求书的范围内的所有替代、修改及变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请以其整体在此通过引用并入本说明书中。其程度如同各单独的出版物、专利或专利申请被具体及单独地指明而通过引用并入本文中。此外，所引用的或指出的任何参考文献不应被解释为承认这些参考文献可作为本发明的现有技术。本申请中标题部分在本文中用于使本说明书容易理解，而不应被解释为必要的限制。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明不限于前述说明的实施例的细节，并且在不脱离本发明的精神或基本属性的情况下，本发明可以以其他特定形式实施。因此本实施例在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的，本发明的范围是由所附权利要求所表示而不是前面的描述所表示，因此在权利要求的含义和等同范围内的所有变化都应包含在其中。
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(文中引用了其他参考文献)
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14.肝生物反应器中氧摄取的实时监测显示CYP450非依赖性的乙酰氨基酚和胺碘酮的线粒体毒性Real-time monitoring of oxygen uptake in hepatic bioreactorshows CYP450-independent mitochondrial toxicity of acetaminophen andamiodarone.S.Prill,D.Bavli,G.Levy,E.Ezra,E.Schmalzlin,M.S.Jaeger,M.Schwarz,C.Duschl,M.Cohen,Y.Nahmias.等人所著2016,毒理学文库Archives of toxicology,pp.1181-1191.
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16.胰岛素样生长因子I刺激肢体中的成肌细胞扩张和肌纤维发育Insulin-likegrowth factor I stimulates myoblast expansion and myofiber development in thelimb.P.J.Mitchell,S.E.Johnson,K.Hannon.等人所著2002,发展动态：美国解剖学家协会的官方出版物Developmental dynamics:an official publication of the AmericanAssociation of Anatomists,pp.12-23.
17.筛选和发现在癌细胞中激活表皮生长因子受体(EGFR)的硝基-苯并恶二唑化合物Screening and discovery of nitro-benzoxadiazole compounds activatingepidermal growth factor receptor(EGFR)in cancer cells.V.Sakanyan,M.Angelini,M.Le Bechec,M.F.Lecocq,F.Benaiteau,B.Rousseau,A.Gyulkhandanyan,L.Gyulkhandanyan,C.Loge,E.Reiter,C.Roussakis,F.Fleury.等人所著2014,科学报导Scientific reports,p.3977.
18.多能干细胞分化为肌纤维以模拟杜氏肌营养不良症Differentiation ofpluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne musculardystrophy.J.Chal,M.Oginuma,Z.Al Tanoury,B.Gobert,O.Sumara,A.Hick,F.Bousson,Y.Zidouni,C.Mursch,P.Moncuquet,O.Tassy,S.Vincent,A.Miyanari,A.Bera,J.M.Garnier,G.Guevara,M.Hestin,L.Kennedy,S.Hayashi,B.Drayton,T.Cherrier,B.Gayra.等人所著2015,自然生物科技期刊Nature biotechnology,pp.962-969.
19.MyoD将原代真皮成纤维细胞、成软骨细胞、平滑肌和视网膜色素上皮细胞转化为条纹单核成肌细胞和多核肌管MyoD converts primary dermal fibroblasts,chondroblasts,smooth muscle,and retinal pigmented epithelial cells intostriated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes.J.Choi,M.L.Costa,C.S.Mermelstein,C.Chagas,S.Holtzer,H.Holtzer.等人所著1990,美国国家科学院院刊Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,pp.7988-7992.
20.Tet-on诱导系统与卵内电穿孔相结合，在鸡胚的体形发生中剖析了基因的多种作用Tet-on inducible system combined with in ovo electroporation dissectsmultiple roles of genes in somitogenesis of chicken embryos.T.Watanabe,D.Saito,K.Tanabe,R.Suetsugu,Y.Nakaya,S.Nakagawa,Y.Takahashi.等人所著2007,发展生物学Developmental biology,pp.625-636.
21.高效选择具有新型真核载体的高表达转染子Efficient selection forhigh-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.H.Niwa,K.Yamamura,J.Miyazaki.等人所著1991,基因期刊Gene,pp.193-199.
22.斑马鱼胚胎培养系统定义了促进跨物种脊椎动物肌生成的因子A zebrafishembryo culture system defines factors that promote vertebrate myogenesisacross species.C.Xu,M.Tabebordbar,S.Iovino,C.Ciarlo,J.Liu,A.Castiglioni,E.Price,M.Liu,E.R.Barton,C.R.Kahn,A.J.Wagers,L.I.Zon.等人所著2013,细胞期刊Cell,pp.909-921.
23.人胚胎干细胞的骨胳肌生成Skeletal myogenesis by human embryonicstem cells.J.K.Zheng,Y.Wang,A.Karandikar,Q.Wang,H.Gai,A.L.Liu,C.Peng,H.Z.Sheng.等人所著2006,细胞研究Cell research,pp.713-722.
24.长期体外培养和具有多种形态发生潜力的禽类胚胎干细胞的表征Long-termin vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells withmultiple morphogenetic potentialities.B.Pain,M.E.Clark,M.Shen,H.Nakazawa,M.Sakurai,J.Samarut,R.J.Etches.等人所著1996,发生学Development,pp.2339-2348.
25.通过激活Wnt和抑制Smad2/3和Sonic Hedgehog途径，鉴别诱导胚胎干细胞骨胳肌分化的小分子Identification of Small Molecules Which Induce SkeletalMuscle Differentiation in Embryonic Stem Cells via Activation of the Wnt andInhibition of Smad2/3and Sonic Hedgehog Pathways.H.Lee,C.Haller,C.Manneville,T.Doll,I.Fruh,C.G.Keller,S.M.Richards,Y.Ibig-Rehm,M.Patoor,M.Goette,L.C.Bouchez,M.Mueller.2016,Stem cells,pp.299-310.
26.建立肌肉：肌生成的分子调节Building muscle:molecular regulation ofmyogenesis.C.F.Bentzinger,Y.X.Wang,M.A.Rudnicki.等人所著2012,冷泉港生物学观点Cold Spring Harbor perspectives in biology.
27.糖酵解介导的乙酰辅酶A和组蛋白乙酰化的变化控制胚胎干细胞的早期分化Glycolysis-mediated changes in acetyl-CoA and histone acetylation control theearly differentiation of embryonic stem cells.A.Moussaieff,M.Rouleau,D.Kitsberg,M.Cohen,G.Levy,D.Barasch,A.Nemirovski,S.Shen-Orr,I.Laevsky,M.Amit,D.Bomze,B.Elena-Herrmann,T.Scherf,M.Nissim-Rafinia,S.Kempa,J.Itskovitz-Eldor,E.Meshorer,D.Aberdam,Y.Nahmias.等人所著2015,细胞新陈代谢期刊Cell metabolism,pp.392-402.
28.鸡类中的洛克沙胂、无机砷和其他砷物质：以美国为基础的市场篮子样品Roxarsone,inorganic arsenic,and other arsenic species in chicken:a U.S.-basedmarket basket sample.K.E.Nachman,P.A.Baron,G.Raber,K.A.Francesconi,A.Navas-Acien,D.C.Love.等人所著2013,环境健康观点Environmental health perspectives,pp.818-824.
29.美国肉类和家禽中的多重耐药金黄色葡萄球菌Multidrug-ResistantStaphylococcus aureus in US Meat and Poultry.A.E.Waters,T.Contente-Cuomo,J.Buchhagen,C.M.Liu,L.Watson,K.Pearce,J.T.Foster,J.Bowers,E.M.Driebe,D.M.Engelthaler,P.S.Keim,L.B.Price.等人所著2011,临床传染病：美国传染病学会的官方出版物Clinical infectious diseases:an official publication of theInfectious Diseases Society of America,pp.1227-1230.
30.通过激光引导直接书写对活细胞进行微图案化：应用于制造肝脏内皮类正窦样结构Micropatterning of living cells by laser-guided direct writing:application to fabrication of hepatic-endothelial sinusoid-likestructures.Y.Nahmias,D.J.Odde.等人所著2006,自然方案Nature protocols,pp.2288-2296.
31.整合肝组织工程技术Integration of technologies for hepatic tissueengineering.Y.Nahmias,F.Berthiaume,M.L.Yarmush.等人所著2007,生物化学工程/生物技术进展Advances in biochemical engineering/biotechnology,pp.309-329.
32.来自iPSC衍生的器官芽移植物的血管化和功能性人类肝脏Vascularized andfunctional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.T.Takebe,K.Sekine,M.Enomura,H.Koike,M.Kimura,T.Ogaeri,R.R.Zhang,Y.Ueno,Y.W.Zheng,N.Koike,S.Aoyama,Y.Adachi,H.Taniguchi.等人所著2013,自然期刊Nature,pp.481-484.
33.含氧载体基质的新配方增强了培养肝细胞的肝脏特异性功能A novelformulation of oxygen-carrying matrix enhances liver-specific function ofcultured hepatocytes.Y.Nahmias,Y.Kramvis,L.Barbe,M.Casali,F.Berthiaume,M.L.Yarmush.等人所著2531-2533,s.l.:FASEB,2006.
序列表
<110> 耶路撒冷希伯来大学的益生研究开发有限公司
纳米雅思,亚寇夫
<120> 用于在体外培养细胞的系统和方法
<130> 70075
<150> US 62/360,495
<151> 2016-07-11
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10975
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(10975)
<223> pInducer20-cMyoD1
<400> 1
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620
gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccgaa ttcacaaatg 2040
gcagtattca tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa 2100
agaatagtag acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca 2160
aaaattcaaa attttcgggt ttattacagg gacagcagag atccagtttg gactaggatc 2220
ctttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca 2280
gtgatagaga aaagtgaaag tcgagtttac cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa 2340
agtcgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc 2400
ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact ccctatcagt gatagagaaa 2460
agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaag tcgagctcgg 2520
tacccgggtc gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg 2580
aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 2640
gaccgatcca gcctccgcgg ccccgaacta gtccagtgtg gtgggtcgag actagcgcta 2700
gcatggacct tttgggaccg atggaaatga ctgagggttc tctctgttct tttaccgctg 2760
cggatgattt ctatgatgac ccctgtttca acacgagcga tatgcacttt ttcgaagatc 2820
tggaccccag gctcgtccac gttggcggtc ttctgaaagc cgaagaacat cctcatcatc 2880
atgggcacca tcatggtaat cctcatgagg aggagcatgt aagggccccc agcggtcatc 2940
atcaggccgg taggtgcctg ctttgggcgt gcaaggcttg caaaaggaaa acaactaatg 3000
ctgaccggcg gaaagcagcc acgatgcgcg aacgccgcag gttgtctaaa gtcaacgaag 3060
cattcgagac gcttaagcgg tgtacaagta ctaatccaaa ccagaggctc cccaaagttg 3120
aaatccttcg gaatgcaatt cggtatatcg aaagcctgca agcgctgctc cgggaacaag 3180
aagacgcata ttaccccgtc ctcgaacact actctggaga aagtgacgcc tccagcccac 3240
gcagtaactg ctccgacggg atgatggaat attctggacc accgtgctct agccggcgca 3300
gaaattcata cgactcctct tactacacag agagcccgaa tgatccgaag cacgggaagt 3360
ctagcgtggt ctcttcactg gattgtctca gtagcattgt cgagcgcatc agtactgaca 3420
actccacctg cccgatattg ccgcccgccg aagctgttgc tgagggcagt ccatgtagcc 3480
cccaggaggg gggaaatctt tctgactccg gggctcaaat tccatccccg accaactgta 3540
ccccactgcc gcaggaatct agctccagta gttcaagcaa cccgatatat caagttcttt 3600
agtcgacgtc gagtctagag ggcccgcggt tcgaataccc atacgacgtc ccagactacg 3660
cttagtaatg attaattaaa ctagaaattc taccgggtag gggaggcgct tttcccaagg 3720
cagtctggag taacccaccc aagatctggc ctccgcgccg ggttttggcg cctcccgcgg 3780
gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca cgtcagacga agggcgcagc gagcgtcctg 3840
atccttccgc ccggacgctc aggacagcgg cccgctgctc ataagactcg gccttagaac 3900
cccagtatca gcagaaggac attttaggac gggacttggg tgactctagg gcactggttt 3960
tctttccaga gagcggaaca ggcgaggaaa agtagtccct tctcggcgat tctgcggagg 4020
gatctccgtg gggcggtgaa cgccgatgat tatataagga cgcgccgggt gtggcacagc 4080
tagttccgtc gcagccggga tttgggtcgc ggttcttgtt tgtggatcgc tgtgatcgtc 4140
acttggtgag tagcgggctg ctgggctggc cggggctttc gtggccgccg ggccgctcgg 4200
tgggacggaa gcgtgtggag agaccgccaa gggctgtagt ctgggtccgc gagcaaggtt 4260
gccctgaact gggggttggg gggagcgcag caaaatggcg gctgttcccg agtcttgaat 4320
ggaagacgct tgtgaggcgg gctgtgaggt cgttgaaaca aggtgggggg catggtgggc 4380
ggcaagaacc caaggtcttg aggccttcgc taatgcggga aagctcttat tcgggtgaga 4440
tgggctgggg caccatctgg ggaccctgac gtgaagtttg tcactgactg gagaactcgg 4500
tttgtcgtct gttgcggggg cggcagttat ggcggtgccg ttgggcagtg cacccgtacc 4560
tttgggagcg cgcgccctcg tcgtgtcgtg acgtcacccg ttctgttggc ttataatgca 4620
gggtggggcc acctgccggt aggtgtgcgg taggcttttc tccgtcgcag gacgcagggt 4680
tcgggcctag ggtaggctct cctgaatcga caggcgccgg acctctggtg aggggaggga 4740
taagtgaggc gtcagtttct ttggtcggtt ttatgtacct atcttcttaa gtagctgaag 4800
ctccggtttt gaactatgcg ctcggggttg gcgagtgtgt tttgtgaagt tttttaggca 4860
ccttttgaaa tgtaatcatt tgggtcaata tgtaattttc agtgttagac tagtaaattg 4920
tccgctaaat tctggccgtt tttggctttt ttgttagacg aagcttggta ccgagctcgg 4980
atctccaccc cgtaccggtc ctgcagtcga attcaccatg tctagactgg acaagagcaa 5040
agtcataaac ggagctctgg aattactcaa tggtgtcggt atcgaaggcc tgacgacaag 5100
gaaactcgct caaaagctgg gagttgagca gcctaccctg tactggcacg tgaagaacaa 5160
gcgggccctg ctcgatgccc tgccaatcga gatgctggac aggcatcata cccacttctg 5220
ccccctggaa ggcgagtcat ggcaagactt tctgcggaac aacgccaagt cataccgctg 5280
tgctctcctc tcacatcgcg acggggctaa agtgcatctc ggcacccgcc caacagagaa 5340
acagtacgaa accctggaaa atcagctcgc gttcctgtgt cagcaaggct tctccctgga 5400
gaacgcactg tacgctctgt ccgccgtggg ccactttaca ctgggctgcg tattggagga 5460
acaggagcat caagtagcaa aagaggaaag agagacacct accaccgatt ctatgccccc 5520
acttctgaga caagcaattg agctgttcga ccggcaggga gccgaacctg ccttcctttt 5580
cggcctggaa ctaatcatat gtggcctgga gaaacagcta aagtgcgaaa gcggcgggcc 5640
gaccgacgcc cttgacgatt ttgacttaga catgctccca gccgatgccc ttgacgactt 5700
tgaccttgat atgctgcctg ctgacgctct tgacgatttt gaccttgaca tgctccccgg 5760
gtaactaagt aaggatccgc ggccgcacta gaggaattcc gcccctctcc ctcccccccc 5820
cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt gtgtgtttgt ctatatgtta 5880
ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc 5940
ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat 6000
gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc 6060
ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt 6120
gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt 6180
gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtagtcaaca aggggctgaa ggatgcccag 6240
aaggtacccc attgtatggg aatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt 6300
ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg 6360
aaaaacacga tgataagctt accggtccac catgattgaa caagatggat tgcacgcagg 6420
ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg 6480
ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa 6540
gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct 6600
ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga 6660
ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc 6720
cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac 6780
ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc 6840
cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact 6900
gttcgccagg ctcaaggcga gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga 6960
tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg 7020
ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga 7080
agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga 7140
ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgatgta caagtaaagc 7200
ggccgcgact ctagatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa 7260
aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgttt 7320
agtccctccc aattcgatat caagcttatc gatcgataga tcctaatcaa cctctggatt 7380
acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg 7440
gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct 7500
cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc 7560
aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca 7620
ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac 7680
tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt 7740
ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct 7800
ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc 7860
cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga 7920
cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcctgagat cctttaagac caatgactta 7980
caaggcagct gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat 8040
tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca 8100
gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag 8160
cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 8220
atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct 8280
tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggcccgggtt 8340
aattaaggaa agggctagat cattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 8400
tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa 8460
atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 8520
tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 8580
aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 8640
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 8700
acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 8760
ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg 8820
ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 8880
caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 8940
ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 9000
aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 9060
aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 9120
tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 9180
aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 9240
cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 9300
ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 9360
gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 9420
agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 9480
atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 9540
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 9600
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aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccgaa ttcacaaatg 2040
gcagtattca tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa 2100
agaatagtag acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca 2160
aaaattcaaa attttcgggt ttattacagg gacagcagag atccagtttg gactaggatc 2220
ctttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca 2280
gtgatagaga aaagtgaaag tcgagtttac cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa 2340
agtcgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc 2400
ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact ccctatcagt gatagagaaa 2460
agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaag tcgagctcgg 2520
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aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 2640
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gctgaaaacg tctgggcaag cgggtcaggc atccccgaag aagaaaagga aggtcgggag 2760
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cgacgcactc gacgattttg accttgacat gctcatcaat tatccgtatg atgttcccga 2940
ttatgcgtct gggggaagtg gtggggggtc catggacctt ttgggaccga tggaaatgac 3000
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aatatgtact acaaacttag tagt 11244
<210> 4
<211> 11109
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(11109)
<223> pGreenfire慢病毒载体中大鼠MLC3增强子-启动子
<400> 4
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acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
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ggtggcggcg caggatgatg gcacgctgcc catgtcttgt gcccaggaga gcgggatgga 4260
ccgtcaccct gcagcctgtg cttctgctag gatcaatgtg accggtgagg gcagaggaag 4320
tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct tccggtatgg aagacgccaa 4380
aaacataaag aaaggcccgg cgccattcta tccgctagag gatggaaccg ctggagagca 4440
actgcataag gctatgaaga gatacgccct ggttcctgga acaattgctt ttacagatgc 4500
acatatcgag gtgaacatca cgtacgcgga atacttcgaa atgtccgttc ggttggcaga 4560
agctatgaaa cgatatgggc tgaatacaaa tcacagaatc gtcgtatgca gtgaaaactc 4620
tcttcaattc tttatgccgg tgttgggcgc gttatttatc ggagttgcag ttgcgcccgc 4680
gaacgacatt tataatgaac gtgaattgct caacagtatg aacatttcgc agcctaccgt 4740
agtgtttgtt tccaaaaagg ggttgcaaaa aattttgaac gtgcaaaaaa aattaccaat 4800
aatccagaaa attattatca tggattctaa aacggattac cagggatttc agtcgatgta 4860
cacgttcgtc acatctcatc tacctcccgg ttttaatgaa tacgattttg taccagagtc 4920
ctttgatcgt gacaaaacaa ttgcactgat aatgaactcc tctggatcta ctgggttacc 4980
taagggtgtg gcccttccgc atagaactgc ctgcgtcaga ttctcgcatg ccagagatcc 5040
tatttttggc aatcaaatca ttccggatac tgcgatttta agtgttgttc cattccatca 5100
cggttttgga atgtttacta cactcggata tttgatatgt ggatttcgag tcgtcttaat 5160
gtatagattt gaagaagagc tgtttttacg atcccttcag gattacaaaa ttcaaagtgc 5220
gttgctagta ccaaccctat tttcattctt cgccaaaagc actctgattg acaaatacga 5280
tttatctaat ttacacgaaa ttgcttctgg gggcgcacct ctttcgaaag aagtcgggga 5340
agcggttgca aaacgcttcc atcttccagg gatacgacaa ggatatgggc tcactgagac 5400
tacatcagct attctgatta cacccgaggg ggatgataaa ccgggcgcgg tcggtaaagt 5460
tgttccattt tttgaagcga aggttgtgga tctggatacc gggaaaacgc tgggcgttaa 5520
tcagagaggc gaattatgtg tcagaggacc tatgattatg tccggttatg taaacaatcc 5580
ggaagcgacc aacgccttga ttgacaagga tggatggcta cattctggag acatagctta 5640
ctgggacgaa gacgaacact tcttcatagt tgaccgcttg aagtctttaa ttaaatacaa 5700
aggataccag gtggcccccg ctgaattgga gtcgatattg ttacaacacc ccaacatctt 5760
cgacgcgggc gtggcaggtc ttcccgacga tgacgccggt gaacttcccg ccgccgttgt 5820
tgttttggag cacggaaaga cgatgacgga aaaagagatc gtggattacg tcgccagtca 5880
agtaacaacc gcgaaaaagt tgcgcggagg agttgtgttt gtggacgaag taccgaaagg 5940
tcttaccgga aaactcgacg caagaaaaat cagagagatc ctcataaagg ccaagaaggg 6000
cggaaagtcc aaattgtaat cgactcgaca atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa 6060
gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa 6120
tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat 6180
cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt 6240
gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc 6300
tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc 6360
ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg 6420
ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga 6480
cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc 6540
tgccggctct gcggcctctt ccgcatcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc 6600
tttgggccgc ctccccgcct ggaattaatt cgagctcggt accaaggatc tgcgatcgct 6660
ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 6720
gggtcggcaa ttgaacgggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 6780
tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 6840
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacagctg aagcttcgag 6900
gggctcgcat ctctccttca cgcgcccgcc gccctacctg aggccgccat ccacgccggt 6960
tgagtcgcgt tctgccgcct cccgcctgtg gtgcctcctg aactgcgtcc gccgtctagg 7020
taagtttaaa gctcaggtcg agaccgggcc tttgtccggc gctcccttgg agcctaccta 7080
gactcagccg gctctccacg ctttgcctga ccctgcttgc tcaactctac gtctttgttt 7140
cgttttctgt tctgcgccgt tacagatcca agctgtgacc ggcgcctacg ctagatgacc 7200
gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg tccccagggc cgtacgcacc 7260
ctcgccgccg cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgatcc ggaccgccac 7320
atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc 7380
aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc 7440
gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg 7500
ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg 7560
tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc 7620
gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc 7680
tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc 7740
gaggtgcccg aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc ctgaggtacc 7800
tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg 7860
gggactggaa gggctaattc actcccaacg aaaataagat ctgctttttg cttgtactgg 7920
gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 7980
gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg 8040
tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag 8100
tagtagttca tgtcatctta ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga 8160
gagtgagagg aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 8220
aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 8280
caatgtatct tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc 8340
cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg 8400
gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctaga cttttgcaga 8460
gacggcccaa attcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 8520
acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 8580
gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 8640
tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 8700
cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 8760
gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 8820
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 8880
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 8940
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 9000
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 9060
ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 9120
cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 9180
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 9240
actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 9300
tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 9360
gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 9420
ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 9480
cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 9540
ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 9600
tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 9660
agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 9720
gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 9780
ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 9840
gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 9900
cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 9960
acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 10020
cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 10080
cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 10140
ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 10200
tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 10260
atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 10320
tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 10380
actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 10440
aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 10500
ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 10560
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 10620
cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 10680
aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga 10740
cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa 10800
gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca 10860
tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta 10920
aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg 10980
cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg 11040
cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt 11100
gccaagctg 11109
<210> 5
<211> 900
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> gene
<222> (1)..(900)
<223> 鸡类MyoD1基因
<400> 5
atggaccttt tgggaccgat ggaaatgact gagggttctc tctgttcttt taccgctgcg 60
gatgatttct atgatgaccc ctgtttcaac acgagcgata tgcacttttt cgaagatctg 120
gaccccaggc tcgtccacgt tggcggtctt ctgaaagccg aagaacatcc tcatcatcat 180
gggcaccatc atggtaatcc tcatgaggag gagcatgtaa gggcccccag cggtcatcat 240
caggccggta ggtgcctgct ttgggcgtgc aaggcttgca aaaggaaaac aactaatgct 300
gaccggcgga aagcagccac gatgcgcgaa cgccgcaggt tgtctaaagt caacgaagca 360
ttcgagacgc ttaagcggtg tacaagtact aatccaaacc agaggctccc caaagttgaa 420
atccttcgga atgcaattcg gtatatcgaa agcctgcaag cgctgctccg ggaacaagaa 480
gacgcatatt accccgtcct cgaacactac tctggagaaa gtgacgcctc cagcccacgc 540
agtaactgct ccgacgggat gatggaatat tctggaccac cgtgctctag ccggcgcaga 600
aattcatacg actcctctta ctacacagag agcccgaatg atccgaagca cgggaagtct 660
agcgtggtct cttcactgga ttgtctcagt agcattgtcg agcgcatcag tactgacaac 720
tccacctgcc cgatattgcc gcccgccgaa gctgttgctg agggcagtcc atgtagcccc 780
caggaggggg gaaatctttc tgactccggg gctcaaattc catccccgac caactgtacc 840
ccactgccgc aggaatctag ctccagtagt tcaagcaacc cgatatatca agttctttag 900
<210> 6
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> gene
<222> (1)..(173)
<223> VP64转录激活因子
<400> 6
tgaaaacgtc tgggcaagcg ggtcaggcat ccccgaagaa gaaaaggaag gtcgggagag 60
cggacgcgct cgatgacttc gatttggaca tgctcggctc cgatgctctg gatgactttg 120
atctggacat gctcggttca gatgcgctgg atgattttga tttggatatg ctc 173
<210> 7
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> gene
<222> (1)..(684)
<223> cMyogenin编码序列
<400> 7
atggagctct ttgagaccaa cccttacttt ttcccggagc agaggtttta cgatggggaa 60
aacttcctgg gctcccgctt gcagggctac gaggcggccg cgtttcctga gcgtcccgag 120
gtgaccctgt gccctgaaag cagaggggct ttggaggaga aggactcgac gctgcccgag 180
cactgccccg ggcaatgctt gccatgggct tgcaaaatct gcaagcgcaa aaccgtgtcc 240
atcgaccggc gtcgggcggc cacgctgcgg gagaagcgga ggctgaagaa ggtgaacgaa 300
gccttcgagg ctctgaaacg cagcactctg ctcaacccca accagcggct gcccaaggtg 360
gagatcctgc gcagcgccat ccagtacatc gagcgcctgc agagcctgct cagcagcctc 420
aaccagcagg agcgtgagca gagggagctg cgctaccgcc ccgctgcacc acaacctgct 480
gcacccagcg agtgcggctc tggcagctca tcctgcagcc ctgagtggag cacccagctg 540
gagtttggca ccaaccccgc agatcacctc ctgagcgatg accaggcaga ggaccgcaac 600
ctccactcgc tctcctccat cgtggagagc atcgccgtgg aggacgtggc cgtgacgttc 660
ccagaggagc gggtccaaaa ctga 684
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(39)
<223> 最小的CMV启动子序列
<400> 8
ggtaggcgtg tacggtggga ggcctatata agcagagct 39
<210> 9
<211> 2341
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> enhancer
<222> (1)..(2341)
<223> 大鼠肌球蛋白轻链-3启动子-增强子（rMLC3-GFP）
<400> 9
gctattaatc ccagagccct tggaagccag aggaagatgt atctctgagt ttgaggctac 60
cctactctac agaaagagtt ccaggacaga cattacacga gaagccctgc cccctctcta 120
aaataaaagt attttcagaa gcataaaggt cacagtgtag agaaaatgac tgctacacgt 180
agtcttaatt atagagggct cttttttttt tttttttgat ctgtggtgta catgtcttta 240
catttttttc aagatagaaa agcatgatgt ctgtgcggta taaattgttc gttttgagcc 300
ttgtgtataa cgctttcctc tcaagatttt ataatagtgc tttaactgtc cccacgggct 360
aacttcagca cactgtcatg ggacctaacc ttattaaatt accatgtgtg aaccgctcat 420
aactcaagtc gcagcaggtg caaaaatgga gctgcgcagg cagaagagtg atcgtcattt 480
ttaaaatccc caccagctgg cgaagcaaca ggtgcctaat tcctcatctt ttaaaaataa 540
cttttcaaaa gcctgtgctg tataagcaaa tattttcaag tttgttttta aaccatcttc 600
aagttacctt cctcacaaaa tacattatgt gctgattttt ttgtctcaaa atgacatttg 660
aagtctaagc atataaaaat ttatttcttt ttagaaatga aattattatt taactggaga 720
cttaaattgt gtcttaactc ttgctcctcc ccttttcccc ttttgtccct tctctcccca 780
ctcccctccc cttctcttca catgctcatg gcgggctctt ctctttccta ctcttcttct 840
ttctctcatc cctctccctt gtcttgtcct ttcactaaac ctttccacat ggaaaaaata 900
aattgtatct taaagctcat aatgtcagga tgaagggaag cgatagaaag ggggacccca 960
agccattttt aaacttagat tatactcctg ctaatactgc ttgcaaaagc ctaatcttta 1020
atggcggttt gggaacctga tcaggttgcc acgtgggtgt atcctaacca gtccccagag 1080
cacgcattgc cctttcaaga cctcagaact ttaccataag gggcccagct ttggagactg 1140
ttctttctac accagttact atttcaaacc tcaacccagt tccatccacg aagctccatt 1200
aatacccagg cttgctgact agacacttgc aaggtctgta attacgcatc agaagccagt 1260
cgtagatgaa tcccacgttt tccacgagca aagcaatgtc ttaagcacag ttgcagggaa 1320
catctcagag atgaagacca taaaagtacc gacaggcttc agtctcacca gggctgttca 1380
cgtctggacg ctggattcct aaaaatagcc ctagggtaca tgtctctctt tctctttgcc 1440
ctaagaaagc taaagaactc ctccaggagg agtggcaact gccctgtgaa atccgatact 1500
agatatgagg tcagtttgcc cagaaataaa aggaagccac cgagaggtaa tgaagatcga 1560
gtgccgcatc accggcaccc tgaacggcgt ggagttcgag ctggtgggcg gcggagaggg 1620
cacccccgag cagggccgca tgaccaacaa gatgaagagc accaaaggcg ccctgacctt 1680
cagcccctac ctgctgagcc acgtgatggg ctacggcttc taccacttcg gcacctaccc 1740
cagcggctac gagaacccct tcctgcacgc catcaacaac ggcggctaca ccaacacccg 1800
catcgagaag tacgaggacg gcggcgtgct gcacgtgagc ttcagctacc gctacgaggc 1860
cggccgcgtg atcggcgact tcaaggtggt gggcaccggc ttccccgagg acagcgtgat 1920
cttcaccgac aagatcatcc gcagcaacgc caccgtggag cacctgcacc ccatgggcga 1980
taacgtgctg gtgggcagct tcgcccgcac cttcagcctg cgcgacggcg gctactacag 2040
cttcgtggtg gacagccaca tgcacttcaa gagcgccatc caccccagca tcctgcagaa 2100
cgggggcccc atgttcgcct tccgccgcgt ggaggagctg cacagcaaca ccgagctggg 2160
catcgtggag taccagcacg ccttcaagac ccccatcgcc ttcgccagat ctcgagatat 2220
cagccatggc ttcccgccgg cggtggcggc gcaggatgat ggcacgctgc ccatgtcttg 2280
tgcccaggag agcgggatgg accgtcaccc tgcagcctgt gcttctgcta ggatcaatgt 2340
g 2341
<210> 10
<211> 917
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> enhancer
<222> (1)..(917)
<223> 大鼠MLC3增强子
<400> 10
gctattaatc ccagagccct tggaagccag aggaagatgt atctctgagt ttgaggctac 60
cctactctac agaaagagtt ccaggacaga cattacacga gaagccctgc cccctctcta 120
aaataaaagt attttcagaa gcataaaggt cacagtgtag agaaaatgac tgctacacgt 180
agtcttaatt atagagggct cttttttttt tttttttgat ctgtggtgta catgtcttta 240
catttttttc aagatagaaa agcatgatgt ctgtgcggta taaattgttc gttttgagcc 300
ttgtgtataa cgctttcctc tcaagatttt ataatagtgc tttaactgtc cccacgggct 360
aacttcagca cactgtcatg ggacctaacc ttattaaatt accatgtgtg aaccgctcat 420
aactcaagtc gcagcaggtg caaaaatgga gctgcgcagg cagaagagtg atcgtcattt 480
ttaaaatccc caccagctgg cgaagcaaca ggtgcctaat tcctcatctt ttaaaaataa 540
cttttcaaaa gcctgtgctg tataagcaaa tattttcaag tttgttttta aaccatcttc 600
aagttacctt cctcacaaaa tacattatgt gctgattttt ttgtctcaaa atgacatttg 660
aagtctaagc atataaaaat ttatttcttt ttagaaatga aattattatt taactggaga 720
cttaaattgt gtcttaactc ttgctcctcc ccttttcccc ttttgtccct tctctcccca 780
ctcccctccc cttctcttca catgctcatg gcgggctctt ctctttccta ctcttcttct 840
ttctctcatc cctctccctt gtcttgtcct ttcactaaac ctttccacat ggaaaaaata 900
aattgtatct taaagct 917
<210> 11
<211> 632
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(632)
<223> 大鼠MLC3启动子序列
<400> 11
cataatgtca ggatgaaggg aagcgataga aagggggacc ccaagccatt tttaaactta 60
gattatactc ctgctaatac tgcttgcaaa agcctaatct ttaatggcgg tttgggaacc 120
tgatcaggtt gccacgtggg tgtatcctaa ccagtcccca gagcacgcat tgccctttca 180
agacctcaga actttaccat aaggggccca gctttggaga ctgttctttc tacaccagtt 240
actatttcaa acctcaaccc agttccatcc acgaagctcc attaataccc aggcttgctg 300
actagacact tgcaaggtct gtaattacgc atcagaagcc agtcgtagat gaatcccacg 360
ttttccacga gcaaagcaat gtcttaagca cagttgcagg gaacatctca gagatgaaga 420
ccataaaagt accgacaggc ttcagtctca ccagggctgt tcacgtctgg acgctggatt 480
cctaaaaata gccctagggt acatgtctct ctttctcttt gccctaagaa agctaaagaa 540
ctcctccagg aggagtggca actgccctgt gaaatccgat actagatatg aggtcagttt 600
gcccagaaat aaaaggaagc caccgagagg ta 632
<210> 12
<211> 792
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> gene
<222> (1)..(792)
<223> COP-GFP 序列
<400> 12
atgaagatcg agtgccgcat caccggcacc ctgaacggcg tggagttcga gctggtgggc 60
ggcggagagg gcacccccga gcagggccgc atgaccaaca agatgaagag caccaaaggc 120
gccctgacct tcagccccta cctgctgagc cacgtgatgg gctacggctt ctaccacttc 180
ggcacctacc ccagcggcta cgagaacccc ttcctgcacg ccatcaacaa cggcggctac 240
accaacaccc gcatcgagaa gtacgaggac ggcggcgtgc tgcacgtgag cttcagctac 300
cgctacgagg ccggccgcgt gatcggcgac ttcaaggtgg tgggcaccgg cttccccgag 360
gacagcgtga tcttcaccga caagatcatc cgcagcaacg ccaccgtgga gcacctgcac 420
cccatgggcg ataacgtgct ggtgggcagc ttcgcccgca ccttcagcct gcgcgacggc 480
ggctactaca gcttcgtggt ggacagccac atgcacttca agagcgccat ccaccccagc 540
atcctgcaga acgggggccc catgttcgcc ttccgccgcg tggaggagct gcacagcaac 600
accgagctgg gcatcgtgga gtaccagcac gccttcaaga cccccatcgc cttcgccaga 660
tctcgagata tcagccatgg cttcccgccg gcggtggcgg cgcaggatga tggcacgctg 720
cccatgtctt gtgcccagga gagcgggatg gaccgtcacc ctgcagcctg tgcttctgct 780
aggatcaatg tg 792
<210> 13
<211> 469
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 13
agccctccag gacaggctgc atcagaagag gccatcaagc agatcactgt ccttctgcca 60
tggccctgtg gatgcgcctc ctgcccctgc tggcgctgct ggccctctgg ggacctgacc 120
cagccgcagc ctttgtgaac caacacctgt gcggctcaca cctggtggaa gctctctacc 180
tagtgtgcgg ggaacgaggc ttcttctaca cacccaagac ccgccgggag gcagaggacc 240
tgcaggtggg gcaggtggag ctgggcgggg gccctggtgc aggcagcctg cagcccttgg 300
ccctggaggg gtccctgcag aagcgtggca ttgtggaaca atgctgtacc agcatctgct 360
ccctctacca gctggagaac tactgcaact agacgcagcc cgcaggcagc cccacacccg 420
ccgcctcctg caccgagaga gatggaataa agcccttgaa ccagcaaaa 469
<210> 14
<211> 110
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 14
Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly
20 25 30
Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
35 40 45
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly
50 55 60
Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu
65 70 75 80
Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
85 90 95
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
100 105 110
<210> 15
<211> 495
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 15
agccctccag gacaggctgc atcagaagag gccatcaagc aggtctgttc caagggcctt 60
tgcgtcagat cactgtcctt ctgccatggc cctgtggatg cgcctcctgc ccctgctggc 120
gctgctggcc ctctggggac ctgacccagc cgcagccttt gtgaaccaac acctgtgcgg 180
ctcacacctg gtggaagctc tctacctagt gtgcggggaa cgaggcttct tctacacacc 240
caagacccgc cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag gtggagctgg gcgggggccc 300
tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc ctgcagaagc gtggcattgt 360
ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct ctaccagctg gagaactact gcaactagac 420
gcagcccgca ggcagcccca cacccgccgc ctcctgcacc gagagagatg gaataaagcc 480
cttgaaccag caaaa 495
<210> 16
<211> 110
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 16
Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly
20 25 30
Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
35 40 45
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly
50 55 60
Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu
65 70 75 80
Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
85 90 95
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
100 105 110
<210> 17
<211> 648
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 17
agccctccag gacaggctgc atcagaagag gccatcaagc aggtctgttc caagggcctt 60
tgcgtcaggt gggctcagga ttccagggtg gctggacccc aggccccagc tctgcagcag 120
ggaggacgtg gctgggctcg tgaagcatgt gggggtgagc ccaggggccc caaggcaggg 180
cacctggcct tcagcctgcc tcagccctgc ctgtctccca gatcactgtc cttctgccat 240
ggccctgtgg atgcgcctcc tgcccctgct ggcgctgctg gccctctggg gacctgaccc 300
agccgcagcc tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct 360
agtgtgcggg gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct 420
gcaggtgggg caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc 480
cctggagggg tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc 540
cctctaccag ctggagaact actgcaacta gacgcagccc gcaggcagcc ccacacccgc 600
cgcctcctgc accgagagag atggaataaa gcccttgaac cagcaaaa 648
<210> 18
<211> 110
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 18
Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly
20 25 30
Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
35 40 45
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly
50 55 60
Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu
65 70 75 80
Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
85 90 95
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
100 105 110
<210> 19
<211> 529
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 19
agccctccag gacaggctgc atcagaagag gccatcaagc aggtctgttc caagggcctt 60
tgcgtcaggt gggctcagga ttccagggtg gctggacccc agatcactgt ccttctgcca 120
tggccctgtg gatgcgcctc ctgcccctgc tggcgctgct ggccctctgg ggacctgacc 180
cagccgcagc ctttgtgaac caacacctgt gcggctcaca cctggtggaa gctctctacc 240
tagtgtgcgg ggaacgaggc ttcttctaca cacccaagac ccgccgggag gcagaggacc 300
tgcaggtggg gcaggtggag ctgggcgggg gccctggtgc aggcagcctg cagcccttgg 360
ccctggaggg gtccctgcag aagcgtggca ttgtggaaca atgctgtacc agcatctgct 420
ccctctacca gctggagaac tactgcaact agacgcagcc cgcaggcagc cccacacccg 480
ccgcctcctg caccgagaga gatggaataa agcccttgaa ccagcaaaa 529
<210> 20
<211> 110
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 20
Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly
20 25 30
Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
35 40 45
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly
50 55 60
Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu
65 70 75 80
Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
85 90 95
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
100 105 110
<210> 21
<211> 288
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 21
Met Val Gly Val Gly Gly Gly Asp Val Glu Asp Val Thr Pro Arg Pro
1 5 10 15
Gly Gly Cys Gln Ile Ser Gly Arg Gly Ala Arg Gly Cys Asn Gly Ile
20 25 30
Pro Gly Ala Ala Ala Trp Glu Ala Ala Leu Pro Arg Arg Arg Pro Arg
35 40 45
Arg His Pro Ser Val Asn Pro Arg Ser Arg Ala Ala Gly Ser Pro Arg
50 55 60
Thr Arg Gly Arg Arg Thr Glu Glu Arg Pro Ser Gly Ser Arg Leu Gly
65 70 75 80
Asp Arg Gly Arg Gly Arg Ala Leu Pro Gly Gly Arg Leu Gly Gly Arg
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Ala Pro Glu Arg Val Gly Gly Arg Gly Arg Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Ala Ala Pro Arg Ala Ala Pro Ala Ala Arg Gly Ser Arg Pro
115 120 125
Gly Pro Ala Gly Thr Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala
130 135 140
Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys
145 150 155 160
Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile
165 170 175
His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His
180 185 190
Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys
195 200 205
Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu
210 215 220
Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu
225 230 235 240
Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp
245 250 255
Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr
260 265 270
Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
275 280 285
<210> 22
<211> 6774
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 22
cggccccaga aaacccgagc gagtaggggg cggcgcgcag gagggaggag aactgggggc 60
gcgggaggct ggtgggtgtg gggggtggag atgtagaaga tgtgacgccg cggcccggcg 120
ggtgccagat tagcggacgc ggtgcccgcg gttgcaacgg gatcccgggc gctgcagctt 180
gggaggcggc tctccccagg cggcgtccgc ggagacaccc atccgtgaac cccaggtccc 240
gggccgccgg ctcgccgcgc accaggggcc ggcggacaga agagcggccg agcggctcga 300
ggctggggga ccgcgggcgc ggccgcgcgc tgccgggcgg gaggctgggg ggccggggcc 360
ggggccgtgc cccggagcgg gtcggaggcc ggggccgggg ccgggggacg gcggctcccc 420
gcgcggctcc agcggctcgg ggatcccggc cgggccccgc agggaccatg gcagccggga 480
gcatcaccac gctgcccgcc ttgcccgagg atggcggcag cggcgccttc ccgcccggcc 540
acttcaagga ccccaagcgg ctgtactgca aaaacggggg cttcttcctg cgcatccacc 600
ccgacggccg agttgacggg gtccgggaga agagcgaccc tcacatcaag ctacaacttc 660
aagcagaaga gagaggagtt gtgtctatca aaggagtgtg tgctaaccgt tacctggcta 720
tgaaggaaga tggaagatta ctggcttcta aatgtgttac ggatgagtgt ttcttttttg 780
aacgattgga atctaataac tacaatactt accggtcaag gaaatacacc agttggtatg 840
tggcactgaa acgaactggg cagtataaac ttggatccaa aacaggacct gggcagaaag 900
ctatactttt tcttccaatg tctgctaaga gctgatttta atggccacat ctaatctcat 960
ttcacatgaa agaagaagta tattttagaa atttgttaat gagagtaaaa gaaaataaat 1020
gtgtatagct cagtttggat aattggtcaa acaatttttt atccagtagt aaaatatgta 1080
accattgtcc cagtaaagaa aaataacaaa agttgtaaaa tgtatattct cccttttata 1140
ttgcatctgc tgttacccag tgaagcttac ctagagcaat gatctttttc acgcatttgc 1200
tttattcgaa aagaggcttt taaaatgtgc atgtttagaa acaaaatttc ttcatggaaa 1260
tcatatacat tagaaaatca cagtcagatg tttaatcaat ccaaaatgtc cactatttct 1320
tatgtcattc gttagtctac atgtttctaa acatataaat gtgaatttaa tcaattcctt 1380
tcatagtttt ataattctct ggcagttcct tatgatagag tttataaaac agtcctgtgt 1440
aaactgctgg aagttcttcc acagtcaggt caattttgtc aaacccttct ctgtacccat 1500
acagcagcag cctagcaact ctgctggtga tgggagttgt attttcagtc ttcgccaggt 1560
cattgagatc catccactca catcttaagc attcttcctg gcaaaaattt atggtgaatg 1620
aatatggctt taggcggcag atgatataca tatctgactt cccaaaagct ccaggatttg 1680
tgtgctgttg ccgaatactc aggacggacc tgaattctga ttttatacca gtctcttcaa 1740
aaacttctcg aaccgctgtg tctcctacgt aaaaaaagag atgtacaaat caataataat 1800
tacactttta gaaactgtat catcaaagat tttcagttaa agtagcatta tgtaaaggct 1860
caaaacatta ccctaacaaa gtaaagtttt caatacaaat tctttgcctt gtggatatca 1920
agaaatccca aaatattttc ttaccactgt aaattcaaga agcttttgaa atgctgaata 1980
tttctttggc tgctacttgg aggcttatct acctgtacat ttttggggtc agctcttttt 2040
aacttcttgc tgctcttttt cccaaaaggt aaaaatatag attgaaaagt taaaacattt 2100
tgcatggctg cagttccttt gtttcttgag ataagattcc aaagaactta gattcatttc 2160
ttcaacaccg aaatgctgga ggtgtttgat cagttttcaa gaaacttgga atataaataa 2220
ttttataatt caacaaaggt tttcacattt tataaggttg atttttcaat taaatgcaaa 2280
tttgtgtggc aggattttta ttgccattaa catatttttg tggctgcttt ttctacacat 2340
ccagatggtc cctctaactg ggctttctct aattttgtga tgttctgtca ttgtctccca 2400
aagtatttag gagaagccct ttaaaaagct gccttcctct accactttgc tggaaagctt 2460
cacaattgtc acagacaaag atttttgttc caatactcgt tttgcctcta tttttcttgt 2520
ttgtcaaata gtaaatgata tttgcccttg cagtaattct actggtgaaa aacatgcaaa 2580
gaagaggaag tcacagaaac atgtctcaat tcccatgtgc tgtgactgta gactgtctta 2640
ccatagactg tcttacccat cccctggata tgctcttgtt ttttccctct aatagctatg 2700
gaaagatgca tagaaagagt ataatgtttt aaaacataag gcattcgtct gccatttttc 2760
aattacatgc tgacttccct tacaattgag atttgcccat aggttaaaca tggttagaaa 2820
caactgaaag cataaaagaa aaatctaggc cgggtgcagt ggctcatgcc tatattccct 2880
gcactttggg aggccaaagc aggaggatcg cttgagccca ggagttcaag accaacctgg 2940
tgaaaccccg tctctacaaa aaaacacaaa aaatagccag gcatggtggc gtgtacatgt 3000
ggtctcagat acttgggagg ctgaggtggg agggttgatc acttgaggct gagaggtcaa 3060
ggttgcagtg agccataatc gtgccactgc agtccagcct aggcaacaga gtgagacttt 3120
gtctcaaaaa aagagaaatt ttccttaata agaaaagtaa tttttactct gatgtgcaat 3180
acatttgtta ttaaatttat tatttaagat ggtagcacta gtcttaaatt gtataaaata 3240
tcccctaaca tgtttaaatg tccattttta ttcattatgc tttgaaaaat aattatgggg 3300
aaatacatgt ttgttattaa atttattatt aaagatagta gcactagtct taaatttgat 3360
ataacatctc ctaacttgtt taaatgtcca tttttattct ttatgtttga aaataaatta 3420
tggggatcct atttagctct tagtaccact aatcaaaagt tcggcatgta gctcatgatc 3480
tatgctgttt ctatgtcgtg gaagcaccgg atgggggtag tgagcaaatc tgccctgctc 3540
agcagtcacc atagcagctg actgaaaatc agcactgcct gagtagtttt gatcagttta 3600
acttgaatca ctaactgact gaaaattgaa tgggcaaata agtgcttttg tctccagagt 3660
atgcgggaga cccttccacc tcaagatgga tatttcttcc ccaaggattt caagatgaat 3720
tgaaattttt aatcaagata gtgtgcttta ttctgttgta ttttttatta ttttaatata 3780
ctgtaagcca aactgaaata acatttgctg ttttataggt ttgaagaaca taggaaaaac 3840
taagaggttt tgtttttatt tttgctgatg aagagatatg tttaaatatg ttgtattgtt 3900
ttgtttagtt acaggacaat aatgaaatgg agtttatatt tgttatttct attttgttat 3960
atttaataat agaattagat tgaaataaaa tataatggga aataatctgc agaatgtggg 4020
ttttcctggt gtttccctct gactctagtg cactgatgat ctctgataag gctcagctgc 4080
tttatagttc tctggctaat gcagcagata ctcttcctgc cagtggtaat acgatttttt 4140
aagaaggcag tttgtcaatt ttaatcttgt ggataccttt atactcttag ggtattattt 4200
tatacaaaag ccttgaggat tgcattctat tttctatatg accctcttga tatttaaaaa 4260
acactatgga taacaattct tcatttacct agtattatga aagaatgaag gagttcaaac 4320
aaatgtgttt cccagttaac tagggtttac tgtttgagcc aatataaatg tttaactgtt 4380
tgtgatggca gtattcctaa agtacattgc atgttttcct aaatacagag tttaaataat 4440
ttcagtaatt cttagatgat tcagcttcat cattaagaat atcttttgtt ttatgttgag 4500
ttagaaatgc cttcatatag acatagtctt tcagacctct actgtcagtt ttcatttcta 4560
gctgctttca gggttttatg aattttcagg caaagcttta atttatacta agcttaggaa 4620
gtatggctaa tgccaacggc agtttttttc ttcttaattc cacatgactg aggcatatat 4680
gatctctggg taggtgagtt gttgtgacaa ccacaagcac tttttttttt tttaaagaaa 4740
aaaaggtagt gaatttttaa tcatctggac tttaagaagg attctggagt atacttaggc 4800
ctgaaattat atatatttgg cttggaaatg tgtttttctt caattacatc tacaagtaag 4860
tacagctgaa attcagagga cccataagag ttcacatgaa aaaaatcaat ttatttgaaa 4920
aggcaagatg caggagagag gaagccttgc aaacctgcag actgcttttt gcccaatata 4980
gattgggtaa ggctgcaaaa cataagctta attagctcac atgctctgct ctcacgtggc 5040
accagtggat agtgtgagag aattaggctg tagaacaaat ggccttctct ttcagcattc 5100
acaccactac aaaatcatct tttatatcaa cagaagaata agcataaact aagcaaaagg 5160
tcaataagta cctgaaacca agattggcta gagatatatc ttaatgcaat ccattttctg 5220
atggattgtt acgagttggc tatataatgt atgtatggta ttttgatttg tgtaaaagtt 5280
ttaaaaatca agctttaagt acatggacat ttttaaataa aatatttaaa gacaatttag 5340
aaaattgcct taatatcatt gttggctaaa tagaataggg gacatgcata ttaaggaaaa 5400
ggtcatggag aaataatatt ggtatcaaac aaatacattg atttgtcatg atacacattg 5460
aatttgatcc aatagtttaa ggaataggta ggaaaatttg gtttctattt ttcgatttcc 5520
tgtaaatcag tgacataaat aattcttagc ttattttata tttccttgtc ttaaatactg 5580
agctcagtaa gttgtgttag gggattattt ctcagttgag actttcttat atgacatttt 5640
actatgtttt gacttcctga ctattaaaaa taaatagtag atacaatttt cataaagtga 5700
agaattatat aatcactgct ttataactga ctttattata tttatttcaa agttcattta 5760
aaggctacta ttcatcctct gtgatggaat ggtcaggaat ttgttttctc atagtttaat 5820
tccaacaaca atattagtcg tatccaaaat aacctttaat gctaaacttt actgatgtat 5880
atccaaagct tctcattttc agacagatta atccagaagc agtcataaac agaagaatag 5940
gtggtatgtt cctaatgata ttatttctac taatggaata aactgtaata ttagaaatta 6000
tgctgctaat tatatcagct ctgaggtaat ttctgaaatg ttcagactca gtcggaacaa 6060
attggaaaat ttaaattttt attcttagct ataaagcaag aaagtaaaca cattaatttc 6120
ctcaacattt ttaagccaat taaaaatata aaagatacac accaatatct tcttcaggct 6180
ctgacaggcc tcctggaaac ttccacatat ttttcaactg cagtataaag tcagaaaata 6240
aagttaacat aactttcact aacacacaca tatgtagatt tcacaaaatc cacctataat 6300
tggtcaaagt ggttgagaat atatttttta gtaattgcat gcaaaatttt tctagcttcc 6360
atcctttctc cctcgtttct tctttttttg ggggagctgg taactgatga aatcttttcc 6420
caccttttct cttcaggaaa tataagtggt tttgtttggt taacgtgata cattctgtat 6480
gaatgaaaca ttggagggaa acatctactg aatttctgta atttaaaata ttttgctgct 6540
agttaactat gaacagatag aagaatctta cagatgctgc tataaataag tagaaaatat 6600
aaatttcatc actaaaatat gctattttaa aatctatttc ctatattgta tttctaatca 6660
gatgtattac tcttattatt tctattgtat gtgttaatga ttttatgtaa aaatgtaatt 6720
gcttttcatg agtagtatga ataaaattga ttagtttgtg ttttcttgtc tccc 6774

Claims (90)

1.一种用于培养细胞的系统，其特征在于：所述系统包括：
一生物反应器腔室，用于培养多个细胞；
一输送系统，配置用以将一灌注溶液输送到所述生物反应器腔室，用于以一灌注速率灌注所述灌注溶液通过所述细胞；
一透析系统，具有：一透析器和一透析液，用于进行一透析；以及一过滤器，用于降低所述透析液中的氨含量；以及
一控制器，配置用以循环所述灌注溶液通过所述透析器从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室，并循环所述透析液通过所述过滤器从所述透析器离开并返回所述透析器。
2.一种培养细胞的方法，其特征在于：所述方法包括：
在一生物反应器腔室中培养多个细胞；
向所述生物反应器腔室输送一灌注溶液，用于灌注所述灌注溶液通过所述细胞；
循环所述灌注溶液通过具有一透析器于其中的一透析器从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室；以及
循环所述透析液通过所述过滤器从所述透析器离开并返回所述透析器，所述过滤器选择用于降低所述透析液中的氨含量。
3.如权利要求1和2任一项所述的系统或方法，其特征在于：离开所述生物反应器腔室的所述灌注溶液的一体积的至少90％，在所述细胞的一完整个生长期期间，循环回到所述生物反应器腔室中。
4.一种用于培养细胞的系统，其特征在于：所述系统包括：
一生物反应器腔室，用于培养多个细胞；
一输送系统，配置用以将一灌注溶液输送到所述生物反应器腔室，用于以一灌注速率灌注所述灌注溶液通过所述细胞；
一透析系统，具有一透析器，用于进行一透析；以及
一控制器，配置用以随时间增加所述灌注速率，并循环所述灌注溶液分别地通过所述透析器和所述输送系统从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室；其中离开所述生物反应器腔室的所述灌注溶液的一体积的至少90％，在所述细胞的一完整个生长期期间，循环回到所述生物反应器腔室中。
5.一种培养细胞的方法，其特征在于：所述方法包括：
在一生物反应器腔室中培养多个细胞；
通过一输送系统向所述生物反应器腔室输送一灌注溶液，用于以一随时间增加的灌注速率灌注所述灌注溶液通过所述细胞；以及
循环所述灌注溶液分别地通过一透析器和所述输送系统从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室；
其中离开所述生物反应器腔室的所述灌注溶液的一体积的至少90％，在所述细胞的一完整个生长期期间，循环回到所述生物反应器腔室中。
6.如权利要求1所述的方法或系统，其特征在于：所述细胞形成一组织。
7.如权利要求2至5任一项所述的方法或系统，其特征在于：所述细胞形成一组织。
8.如权利要求1所述的方法或系统，其特征在于：所述细胞形成一培养的肉制品。
9.如权利要求2至7任一项所述的方法或系统，其特征在于：所述细胞形成一培养的肉制品。
10.一种用于培养悬浮细胞培养物的系统，其特征在于：所述系统包括：
一生物反应器腔室，用于培养一悬浮细胞培养物；
一输送系统，配置用以将一灌注溶液输送到所述生物反应器腔室，用于以一灌注速率灌注所述灌注溶液通过所述悬浮细胞培养物；
一透析系统，具有一透析器，用于进行一透析；以及
一控制器，配置用以循环所述灌注溶液通过所述透析器从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室，同时在所述循环期间保持至少95％的细胞在所述生物反应器腔室中形成所述悬浮细胞培养物。
11.一种培养悬浮细胞培养物的方法，其特征在于：所述方法包括：
在一生物反应器腔室中培养一悬浮细胞培养物；
向所述生物反应器腔室输送一灌注溶液，用于灌注所述灌注溶液通过所述悬浮细胞培养物；以及
循环所述灌注溶液通过一透析器从所述生物反应器腔室离开并返回所述生物反应器腔室，同时在所述循环期间保持至少95％的细胞在所述生物反应器腔室中形成所述悬浮细胞培养物。
12.如权利要求10至11任一项所述的方法或系统，其特征在于：所述透析器包括一过滤器，所述过滤器选择用于降低所述灌注溶液的氨含量。
13.如权利要求1、2、10和11任一项所述的方法或系统，其特征在于：所述灌注速率随时间增加。
14.如权利要求13任一项所述的方法或系统，其特征在于：所述增加是呈指数型增加的。
15.如权利要求1、2、4、5、6、10和11任一项所述的方法或系统，其特征在于：存在多个生物反应器腔室，所有所述生物反应器腔室均与同一所述透析器流体连通，并且其中所述透析器施用所述透析至多个灌注溶液，所述多个灌注溶液从各个所述多个生物反应器腔室的各者循环离开。
16.如权利要求3、7、8及12至14任一项所述的方法或系统，其特征在于：存在多个生物反应器腔室，所有所述生物反应器腔室均与同一所述透析器流体连通，并且其中所述透析器施用所述透析至多个灌注溶液，所述多个灌注溶液从各个所述多个生物反应器腔室的各者循环离开。
17.如权利要求1所述的方法或系统，其特征在于：所述透析器配置用以确保与所述灌注溶液一起离开所述生物反应器腔室的至少一种蛋白质循环回到所述生物反应器腔室。
18.如权利要求2至14任一项所述的方法或系统，其特征在于：所述透析器配置用以确保与所述灌注溶液一起离开所述生物反应器腔室的至少一种蛋白质循环回到所述生物反应器腔室。
19.如权利要求17所述的系统，其特征在于：所述至少一种蛋白质是白蛋白。
20.如权利要求18所述的方法或系统，其特征在于：所述至少一种蛋白质是白蛋白。
21.如权利要求1所述的系统，其特征在于：在所述生物反应器腔室中对于每千克细胞存在约0.1升至约10升所述灌注溶液。
22.如权利要求2至19任一项所述的系统或方法，其特征在于：在所述生物反应器腔室中对于每千克细胞存在约0.1升至约10升所述灌注溶液。
23.如权利要求1至22任一项所述的系统或方法，其特征在于：所述灌注溶液的输送是通过一流体回路进行，所述流体回路构造成为通过一培养基和氧气来富集所述灌注溶液。
24.如权利要求23所述的系统或方法，其特征在于：所述流体回路构造成为还通过二氧化碳来富集所述灌注溶液。
25.如权利要求23和24任一项所述的系统或方法，其特征在于：所述流体回路构造成为用以捕获或去除存在于所述灌注溶液中的多个气泡。
26.如权利要求23至25任一项所述的系统或方法，其特征在于：所述流体回路构造成为用以加热所述灌注溶液。
27.如权利要求1所述的系统，其特征在于：所述输送和所述循环在整个所述细胞生长过程中不丢弃所述灌注溶液。
28.如权利要求2至26任一项所述的系统或方法，其特征在于：所述输送和所述循环在整个所述细胞生长过程中不丢弃所述灌注溶液。
29.如权利要求1所述的系统或方法，其特征在于：所述细胞形成一培养的肉制品，并且其中所述生物反应器腔室的体积最多为5升。
30.如权利要求1至28任一项所述的系统或方法，其特征在于：所述生物反应器腔室的体积最多为5升。
31.一种在体外从成纤维细胞产生脂肪细胞的方法，其特征在于：所述方法包括：在一无血清培养基中培养一自发永生化的成纤维细胞，从而产生一脂肪细胞，其中所述无血清培养基含有油酸和一PPAR-γ激动剂或活化剂。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于：所述成纤维细胞是一禽类的成纤维细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于：所述禽类选自于由鶏、鸭、鹅和鹌鹑所组成的一群组。
34.如权利要求31或32所述的方法，其特征在于：所述成纤维细胞是一鶏胚胎成纤维细胞。
35.如权利要求31至34任一项所述的方法，其特征在于：所述自发永生化的成纤维细胞是未经遗传修饰的。
36.如权利要求31至35任一项所述的方法，其特征在于：所述PPAR-γ激动剂或激活剂是一小分子。
37.如权利要求36的方法，其特征在于：所述小分子选自噻唑烷二酮、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、芬那米尔、GW7845、RG14620和哈尔明碱。
38.如权利要求36的方法，其特征在于：所述小分子是罗格列酮。
39.如权利要求31至38任一项所述的方法，其特征在于：所述无血清培养基不含动物污染物。
40.如权利要求31至39任一项所述的方法，其特征在于：所述无血清培养基不含人类污染物。
41.如权利要求31至40任一项所述的方法，其特征在于：所述无血清培养基包含：胰岛素或其替代物；和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或其替代物；和至少一种其他试剂，其中所述其他试剂选自于由地塞米松、转铁蛋白、硒、EGF或其替代物，和PGE2所组成的一群组。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于：所述胰岛素的替代物包括IGF-1或一稳定化的长R3IGF-1。
43.如权利要求41所述的方法，其特征在于：所述EGF的替代物包括EGF-R激动剂。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于：所述EGF-R激动剂包含浓度为5至50纳克/毫升的NSC-228155。
45.如权利要求41所述的方法，其特征在于：所述bFGF的替代物是FGF-信号传导途径的一小分子或一合成激动剂。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于：所述合成激动剂是浓度为10至20纳克/毫升的C19-jun。
47.如权利要求41所述的方法，其特征在于：所述地塞米松的浓度范围为0.01纳摩尔浓度至10微摩尔浓度。
48.如权利要求41所述的方法，其特征在于：所述bFGF以0.1至30纳克/毫升的浓度范围提供。
49.如权利要求41所述的方法，其特征在于：所述EGF以0.1至30纳克/毫升的浓度范围提供。
50.如权利要求41所述的方法，其特征在于：所述PGE2以0.01纳摩尔浓度至10微摩尔浓度的浓度范围提供。
51.一种脂肪细胞，其特征在于：所述脂肪细胞是根据权利要求31至50任一项所述的方法获得的。
52.一种在一蛋白质基质上产生一培养的脂肪的方法，其特征在于：所述方法包括：根据权利要求31至51任一项所述的方法，从所述成纤维细胞产生所述脂肪细胞，其中所述培养是在一植物来源的蛋白质基质上进行，从而在所述蛋白质基质上产生所述培养的脂肪。
53.如权利要求52的方法，其特征在于：所述植物来源的蛋白质基质来自豆科(蝶形花科)、来自谷科或来自假谷科。
54.如权利要求53的方法，其特征在于：所述植物来源的蛋白质基质包含一大豆蛋白质或一豌豆蛋白质。
55.一种培养的脂肪，其特征在于：所述培养的脂肪位在一植物来源的蛋白质基质中。
56.如权利要求55所述的培养的脂肪，其特征在于：所述培养的脂肪通过根据权利要求52至54任一项所述的方法获得。
57.一种在体外从成纤维细胞产生肌细胞的方法，其特征在于：所述方法包括：上调一自发永生化的成纤维细胞内的一多肽的表达，所述多肽选自于由myoD1和肌细胞生成素所组成的一群组。
58.如权利要求57的方法，其特征在于：所述上调是所述myoD1和肌细胞生成素的多肽的上调。
59.如权利要求57或58所述的方法，其特征在于：鶏类的所述myoD1的多肽由包括SEQID NO：5所示的核酸序列的一多核苷酸所编码。
60.如权利要求57或58所述的方法，其特征在于：鶏类的所述肌细胞生成素的多肽由包括SEQ ID NO：7所示的核酸序列的一多核苷酸所编码。
61.如权利要求57或58所述的方法，其特征在于：鶏类的所述myoD1的多肽由SEQ IDNO：1或3所示的核酸构建体所编码。
62.如权利要求57或58所述的方法，其特征在于：鶏类的所述肌细胞生成素的多肽由SEQ ID NO：2所示的核酸构建体所编码。
63.一种肌细胞，其特征在于：所述肌细胞是根据权利要求57至62任一项所述的方法获得的。
64.一种在体外筛选能够产生肌细胞的小分子的方法，其特征在于：所述方法包括：
步骤a：用一核酸构建体转染一自发永生化的成纤维细胞，所述核酸构建体包含一核酸序列，所述核酸序列用以在特异性活化于多个肌细胞中的一启动子的一转录控制下编码一报导多肽；
步骤b：使在步骤a中转染的成纤维细胞与多种小分子的至少一种小分子接触；以及
步骤c：在步骤b之后检测所述转染的成纤维细胞中的所述报导多肽是否高于一预定阈值的活性，其中高于所述预定阈值的所述活性的存在表示所述至少一种小分子能够将所述自发永生化的成纤维细胞转化成为所述肌细胞。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于：所述成纤维细胞是禽类的成纤维细胞。
66.如权利要求64的方法，其特征在于：所述禽类选自于由鶏、鸭、鹅和鹌鹑所组成的一群组。
67.一种在体外产生一可食用肉的方法，其特征在于：所述方法包括：培养：
(a)一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一脂肪细胞的条件下；及/或
(b)另一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一肌细胞的条件下，
从而产生所述可食用肉。
68.一种在体外产生一可食用肉的方法，其特征在于：所述方法包括：培养：
(a)一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一脂肪细胞的条件下；及/或
(b)一自发永生化的成纤维细胞，位在一无血清培养基中，并处在适于将所述成纤维细胞转化为一肌细胞的条件下；以及
(c)一内皮细胞，
从而产生所述可食用的肉。
69.如权利要求67或68所述的方法，其特征在于：所述无血清培养基包含油酸和PPAR-γ激动剂。
70.如权利要求69所述的方法，其特征在于：所述内皮细胞是一自发永生化的内皮细胞。
71.如权利要求68至70任一项所述的方法，其特征在于：所述内皮细胞是未经遗传修饰的。
72.如权利要求67或68所述的方法，其特征在于：步骤a和步骤b在同一培养系统中同时进行。
73.如权利要求67或68所述的方法，其特征在于：步骤a和步骤b在两种不同的培养系统中进行。
74.如权利要求68的所述方法，其特征在于：步骤a、步骤b和步骤c在同一培养系统中同时进行。
75.如权利要求68至74任一项所述的方法，其特征在于：所述培养在一支架上进行。
76.如权利要求68至75任一项所述的方法，其特征在于：所述培养在一灌注系统中进行。
77.如权利要求68至75任一项所述的方法，其特征在于：所述培养在一可食用的中空纤维筒上进行。
78.如权利要求68至75任一项所述的方法，其特征在于：所述培养在一植物来源的基质上进行。
79.如权利要求78所述的方法，其特征在于：所述植物来源的基质来自一谷科、一豆科(蝶形花科)或一假谷科。
80.如权利要求79所述的方法，其特征在于：所述豆科是大豆或豌豆。
81.如权利要求68至70任一项所述的方法，其特征在于：所述培养在没有基质粘附的一悬浮培养基中进行。
82.一种可食用肉，其特征在于：所述可食用肉是根据权利要求67至81任一项所述的方法获得的。
83.如权利要求82所述的可食用肉，其特征在于：所述可食用肉为一肉饼或块状的形式，且具有一密度为约200×106个细胞/克。
84.一种产生自发永生化的成纤维细胞的方法，其特征在于：所述方法包括：
步骤a：在多个粘附培养条件下，于一含有血清的培养基的存在下，培养多个禽类胚胎细胞，从而获得多个鶏类胚胎成纤维细胞；
步骤b：在所述多个粘附培养条件下，于所述含有血清的培养基中，传代所述禽类胚胎成纤维细胞至少10至12代，直至培养物崩坏，其中所述培养物崩坏的特征为至少90％的所述禽类胚胎成纤维细胞的衰老和/或死亡；及
步骤c：在所述含血清培养基的所述培养物崩坏中，分离出存活额外至少20代的至少一群落，
从而产生所述自发永生化的成纤维细胞。
85.如权利要求84的方法，其特征在于：所述含血清的培养基是基于一DMEM/F12的培养基。
86.如权利要求84至85任一项所述的方法，其特征在于：所述培养基中的所述血清包含约15％的胎牛血清(FBS)。
87.如权利要求84至86中任一项所述的方法，其特征在于：所述鶏类胚胎从生长10至12天的一受精肉鶏的卵获得。
88.一种自发永生化的鶏类成纤维细胞，其特征在于：所述自发永生化的鶏类成纤维细胞是根据权利要求84至87中任一项所述的方法获得的。
89.如权利要求88所述的自发永生化的鶏类成纤维细胞，其特征在于：所述自发永生化的鶏类成纤维细胞能够连续传代至少30代。
90.如权利要求88所述的自发永生化的鶏类成纤维细胞，其特征在于：所述自发永生化的鶏类成纤维细胞能够进行至少90次群体倍增。
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