CN114752554B - 一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用 - Google Patents

一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114752554B
CN114752554B CN202210041678.9A CN202210041678A CN114752554B CN 114752554 B CN114752554 B CN 114752554B CN 202210041678 A CN202210041678 A CN 202210041678A CN 114752554 B CN114752554 B CN 114752554B
Authority
CN
China
Prior art keywords
serum
myogenic
medium
differentiation
free
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210041678.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114752554A (zh
Inventor
关欣
堵国成
严其洋
周景文
陈坚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202210041678.9A priority Critical patent/CN114752554B/zh
Publication of CN114752554A publication Critical patent/CN114752554A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114752554B publication Critical patent/CN114752554B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用，属于动物细胞培养及细胞培养肉技术领域。本发明通过细胞分化状态的表观观察及肌肉特异性蛋白MyHC免疫荧光染色，并通过Image J等软件分析分化率及融合率，表征改良无血清培养基对肌源性细胞分化状态的影响。此外，通过免疫印迹和荧光定量PCR证明添加生长因子、植源性天然产物及其他辅助因子的无血清肌源性分化培养基可以使肌源性细胞的蛋白合成能力与在含2％马血清分化培养基下相当。大大降低细胞培养肉技术在分化过程中的成本，并且进一步保证产品的生物安全性，为细胞培养肉产业高效经济的生产优质肌肉蛋白提供技术支持。

Description

一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用
技术领域
本发明涉及一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用，属于动物细胞培养及细胞培养肉技术领域。
背景技术
随着人口的增长，肉类需求增加，以畜牧业为主的传统肉类生产方式面临着巨大挑战。“替代蛋白”逐渐走进人们的视野，诸如植物肉、昆虫蛋白、细胞培养肉。其中，细胞培养肉以动物干细胞为源，体外扩增后，经3D打印技术或生物支架后分化并合成接近真实肉类纹理结构及风味的肉类的新兴生产技术。相较于其他肉类生产方式，细胞培养肉技术具备广阔的前景。理论上，细胞培养肉可以实现其他替代蛋白无法做到的真实肉类的营养及口感，同时大大降低肉类生产过程中资源消耗及污染。目前，细胞培养肉技术距离商业化存在较大的距离，其中最关键的问题是成本过高。培养基中的血清是导致成本过高的主要因素。而最常用的成肌分化培养基的核心成分即为2％的马血清。除开成本问题，马血清成分不明确可能导致培养肉批次之间的差异，并且马血清的使用也与“无动物来源”的理念相矛盾。因此，亟需开发一种成分明确且成本可接受的无血清分化培养基配方。
生长因子参与控制肌细胞的增殖和分化过程。外源添加表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、类胰岛素一号生长因子(Insulin-like GrowthFactors-1，IGF-1)等因子都被证明可以上调肌细胞的蛋白质合成并减少蛋白质分解。此外，生长因子对细胞具有保护作用，外源性IGF-1通过上调线粒体生物合成及Bnip3诱导的线粒体自噬，提高自噬通量，促进细胞在代谢或线粒体应激下的存活。成肌细胞的分化存在着从糖酵解为供能方式到氧化磷酸化为供能方式的转换。这种变化需要大量的线粒体生物合成，并伴随着活性氧(ROS)的大量产生，活性氧的生成需要通过抗氧化系统与之平衡。ROS水平过度上调导致DNA损伤和细胞的凋亡。植物来源的天然产物在促进成肌分化方面具有显著作用，一方面添加植源性天然产物有利于上调生肌因子的表达，另一方面植源性天然产物能提高内源性抗氧化酶的表达防止分化过程中ROS上升引起的细胞凋亡。例如，白藜芦醇和表儿茶素促进生肌调节因子和肌细胞增强因子的表达。同时通过清除脂质自由基，降低脂质过氧化，实现对生物膜结构的保护。并且上调胞内超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)等表达降低细胞氧化损伤。因此，生长因子及植物来源天然产物组合应用于无血清成肌分化培养基具有结实的理论基础及巨大的应用潜力。
发明内容
本发明针对培养肉生产分化过程中使用马血清导致成本过高、易存在病原体污染的现状，提供一种包含生长因子、植源性天然产物及其他辅助因子的组合物替代传统肌源性细胞成肌分化培养基中血清。
本发明的第一个目的是提供一种细胞培养添加剂，所述细胞培养添加剂为如下(a)～(d)的组合物：
(a)组分A；
(b)组分A和组分B；
(c)组分A和组分C；
(d)组分A、组分B和组分C。
在一种实施方式中，所述组分A包括胰岛素、乙醇胺、转铁蛋白、血清白蛋白、纤粘连蛋白、亮氨酸、谷氨酰胺、维生素C、胆固醇、硬脂酸、肌醇、亚油酸、油酸、软脂酸；所述组分B包括IGF-1及EGF；组分C包括柚皮素或柚皮素类似物。
在一种实施方式中，组分A在替代成肌分化培养基血清中的使用浓度范围为0.1μg/mL-1mg/mL。
在一种实施方式中，所述胰岛素的使用浓度为0.5～2μg/mL、乙醇胺的使用浓度为5～15μg/mL、转铁蛋白的使用浓度为1～5μg/mL、血清白蛋白的使用浓度为0.5～2mg/mL、纤粘连蛋白的使用浓度为1～5μg/mL、亮氨酸的使用浓度为80～120μg/mL、谷氨酰胺的使用浓度为450～550μg/mL、维生素C的使用浓度为0.5～2μg/mL、肌醇的使用浓度为0.1μg/mL、胆固醇的使用浓度为0.5～2μg/mL、硬脂酸的使用浓度为0.1～0.5μg/mL、亚油酸的使用浓度为0.1～0.5μg/mL、油酸的使用浓度为0.1～0.5μg/mL、软脂酸的使用浓度为0.1～0.5μg/mL。
在一种实施方式中，所述胰岛素的使用浓度为1μg/mL、乙醇胺的使用浓度为10μg/mL、转铁蛋白的使用浓度为5μg/mL、血清白蛋白的使用浓度为1mg/mL、纤粘连蛋白的使用浓度为5μg/mL、亮氨酸的使用浓度为100μg/mL、谷氨酰胺的使用浓度为500μg/mL、维生素C的使用浓度为1μg/mL、肌醇的使用浓度为0.1μg/mL、胆固醇的使用浓度为1μg/mL、硬脂酸的使用浓度为0.2μg/mL、亚油酸的使用浓度为0.2μg/mL、油酸的使用浓度为0.2μg/mL、软脂酸的使用浓度为0.2μg/mL。
在一种实施方式中，所述IGF-1的使用浓度为10-50ng/mL，EGF的使用浓度为1-20ng/mL。
在一种实施方式中，柚皮素或柚皮素类似物的使用浓度为1-100μM。
在一种实施方式中，柚皮素或柚皮素类似物的使用浓度为5-50μM。
本发明的第二个目的是提供一种肌源性细胞无血清培养基，所述培养基包括基础培养基和上述细胞培养添加剂。
在一种实施方式中，所述基础培养选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种。
在一种实施方式中，所述培养基中还含有青霉素-链霉素双抗溶液。
在一种实施方式中，所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。
本发明的第三个目的是提供一种诱导肌源性细胞分化的使用方法，所述使用方法为将肌源性细胞在培养20～30h后，将培养基更换为上述肌源性细胞无血清培养基。
在一种实施方式中，所述方法为将肌源性细胞置于含有组合物(a)的培养基分化5天，或将肌源性细胞置于含有组合物(b)的培养基分化5天，或将肌源性细胞置于含有组合物(c)的培养基分化5天，或将肌源性细胞置于含有组合物(d)的培养基分化5天，或将肌源性细胞置于含有组合物(b)的培养基分化2天后，于包含组合物(d)的培养基中分化3天。
在一种实施方式中，所述方法为将肌源性细胞置于包含组合物(d)的培养基分化5天。
在一种实施方式中，所述肌源性细胞包含但不限骨骼肌卫星细胞、肌肉祖细胞、成肌细胞。
在一种实施方式中，所述肌源性细胞的来源包括但不限于猪、牛、兔、人或禽类。
本发明还保护上述细胞培养添加剂、上述肌源性细胞无血清培养基和上述方法在细胞培养领域的应用。
有益效果：
本发明提供的以生长因子及植物来源天然产物为核心包含其他辅助因子的组合物，能有效替代成肌分化培养基中的血清成分。使用添加组合物的无血清改良培养基与传统含2％马血清的分化培养基相比，前者体外分化率可达后者的80％-120％，另外前者成肌相关基因Myogenin和MyHC达后后者的90％-110％和95％-105％，同时前者肌肉特异性蛋白Myogenin、MyHC表达量分别可达后者的85％-110％、75％-105％。不仅有效缓解细胞培养肉工业生产中血清带来的高成本问题，还有效避免血清成分不明带来的批次差异及病原体污染的危害。为细胞培养肉的商品化之路奠定基础。
附图说明
图1示出肌源性细胞于无血清分化培养基中分化5天，使用倒置显微镜，在4×视野下细胞状态。
图2示出肌源性细胞于含2％马血清分化培养基中分化5天，使用倒置显微镜，在4×视野下细胞状态。
图3示出肌源性细胞于含组合物的改良无血清分化培养基中分化5天，使用倒置显微镜，在4×视野下细胞状态。
图4示出利用免疫荧光染色，在10×视野下确定无血清分化培养基、含2％马血清分化培养基及含组合物的改良无血清培养基中肌源性细胞分化5天后成肌分化率的差异。
图5示出上图免疫荧光染色数据分析，得到肌源性细胞分化率及融合率的变化。分化率为表达MyHC细胞的细胞核数与总细胞核数之比，融合率为2核及以上表达MyHC细胞的细胞核数与表达MyHC细胞的细胞核数之比。图A表示分化培养基中的细胞成肌分化率，图B表示不同分化培养基中的细胞成肌分融合率。图中a、b、c分别代表使用的分化培养基为无血清培养基、2％马血清培养基、含组合物的改良无血清培养基。
图6示出利用荧光定量PCR，确定无血清分化培养基、含2％马血清分化培养基及含组合物的改良无血清培养基中肌源性细胞成肌分化相关基因Myogenin及MyHC，凋亡基因Caspase 3的表达变化。图A的数据为Myogenin经18S标准化后的统计结果，图B的数据为MyHC经18S标准化后的统计结果，图C的数据为Caspase 3经18S标准化后的统计结果。各图中a、b、c分别代表使用的分化培养基为无血清培养基、2％马血清培养基、含组合物组合物的改良无血清培养基。
图7示出利用免疫印迹，确定无血清分化培养基、含2％马血清分化培养基及含组合物的改良无血清培养基中肌源性细胞成肌分化的特异性蛋白Myogenin及MyHC的表达是否增加。其中图B的数据为MyHC以Tubulin标准化后的统计结果，图C是Myogenin以Tubulin标准化后的统计结果。图B、C中a、b代表肌源性细胞于2％马血清分化培养基、含组合物的改良无血清培养基分化3天，c、d代表肌源性细胞于2％马血清分化培养基、含组合物的改良无血清培养基分化5天。
具体实施方式
下面通过实例进一步详细说明本发明。
但下述实例仅为实例性，本发明的内容不限于下述实施例。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
下述所用肌源性细胞的体外扩增及分化方法与常规的肌源性细胞体外培养方法一致。
下述实例采用的肌源性生长培养基为：10vol％胎牛血清、79vol％DMEM培养基、1vol％青霉素链霉素双抗溶液，所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。
下述实例采用的肌源性无血清分化培养基为：99vol％DMEM培养基、1vol％青霉素链霉素双抗溶液，所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。
下述实例采用的传统肌源性分化培养基为：2vol％马血清、97vol％DMEM培养基、1vol％青霉素链霉素双抗溶液，所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。
下述实例采用的改良无血清肌源性分化培养基a为：99vol％DMEM培养基、1vol％青霉素链霉素双抗溶液，并添加上述浓度的组分A、组分B及组分C，所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。
下述实例采用的改良无血清肌源性分化培养基b为：99vol％DMEM培养基、1vol％青霉素链霉素双抗溶液，并添加上述浓度的组分A，所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。
下述实例采用的改良无血清肌源性分化培养基c为：99vol％DMEM培养基、1vol％青霉素链霉素双抗溶液，并添加上述浓度的组分A及组分B，所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。
下述实例采用的改良无血清肌源性分化培养基d为：99vol％DMEM培养基、1vol％青霉素链霉素双抗溶液，并添加上述浓度的组分A及组分C，所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。
表1
Figure BDA0003470511200000051
Figure BDA0003470511200000061
下述实例中采用的培养条件为5％(v/v)CO2培养箱，37℃培养。
下述实例中采用的检测方法，除说明外，其他都为公开的实验方法。
实施例1表观鉴定成肌分化状态
将小鼠成肌细胞C2C12按8×104个/孔量接种于24孔板中，共接种3孔，培养于肌源性生长培养基中24h，待细胞汇合度达70％-90％，吸去上清，3孔的细胞分别于1mL肌源性无血清分化培养基、传统肌源性分化培养基及改良无血清肌源性分化培养基a中分化5天，隔2天更换相对应的新鲜培养基，于倒置显微镜下观测分化5天细胞的表观变化。
结果如图1～图3所示，成肌细胞在肌源性无血清分化培养基中发生明显凋亡，在分化第5天仅部分细胞贴壁。而在改良无血清肌源性分化培养基a中细胞状态优良显微镜下明显可见已分化的胞质明亮呈长条状的肌管，在肌管大小及数量、细胞状态上与在传统肌源性分化培养基中一致。说明改良无血清肌源性分化培养基a的可以替代传统含血清的分化培养基。
实施例2分化特异性蛋白免疫荧光表征成肌分化的效果
将实施例1中分化5天的三组细胞分别进行免疫荧光检测，用PBS清洗细胞3次，用300μL4％多聚甲醛固定15min，再次用PBS清洗3次。300μL 0.5％Triton-X100处理15min后，PBS清洗3次。加入300μL封闭液(1％BSA、22.52mg/mL甘氨酸、0.1vol％Tween 20的PBS)封闭30min，PBS清洗3次加入1：100稀释的MyHC一抗250μL，4℃孵育过夜。用PBS清洗3次后，避光加入1：200二抗，37℃孵育1h。PBS清洗3次，DAPI室温孵育7min。PBS清洗3次后于倒置荧光显微镜下观察采集图像。
结果如图4和图5所示，在改良无血清肌源性分化培养基a中成肌细胞的分化率约19％，融合率约为27％，远高于无血清分化培养基的5％和7％，与传统肌源性分化培养基的分化率(19.5％)及融合率(27％)相当。表明改良无血清肌源性分化培养基对成肌细胞的肌源性分化具有良好的诱导作用。
实施例3实时荧光定量PCR检测成肌基因及凋亡基因的表达
将小鼠成肌细胞C2C12按8×104个/孔量接种于12孔板中，接种6孔，培养于肌源性生长培养基中24h，待细胞汇合度达70％-90％，吸去上清，分别添加1.5mL肌源性无血清分化培养基、传统肌源性分化培养基和改良无血清肌源性分化培养基a，每组2孔，1孔分化3天，另一孔分化5天，隔2天更换相对应的新鲜培养基。于第三天或第5天提取RNA逆转录为cDNA。
(1)收集细胞：弃去培养基，用PBS清洗，去除残留的培养基。加入0.25％胰酶进行消化，待细胞脱落后，加入胰酶量二倍体积的培养基终止消化反应，吹打混合均匀。将细胞悬液转移至1.5mL离心管，1000rpm，5min离心，弃去上清，获得细胞沉淀。
(2)裂解：在细胞沉淀中加入350μL TRK Lysis Buffer吹打混匀后，转移至匀浆柱中，匀浆柱套入收集管中，14000g，离心2min。收集滤液，加入等体积的70％乙醇到滤液中，涡旋混匀。
(3)提取RNA：将RNA结合柱套入收集管中，将步骤(2)中的混合液转移至RNA结合柱中，室温10000g，离心1min去除收集管中滤液，将RNA结合柱套入收集管中，加入500μL RNAWash Buffer I，10000g，离心30s，弃滤液。再次将RNA结合柱套回收集管中，加入500μL RNAWash Buffer II，10000g，离心1min，弃滤液。重复上一步骤。RNA结合柱套回收集管中，10000g，空离2min；RNA结合柱套入新的1.5mL离心管中，加入30-70μL Nuclease-freeWater至结合柱中央，10000g，离心2min，RNA放置-70℃保存。
(4)去除基因组：冰上配置反应液，即2μL 5×gDNA eraser buffer，1μL gDNAeraser，1μL RNA，2μL RNase-free Water，于42℃反应2min。
(5)逆转录：在步骤(4)中的反应液中加入4μL 5×HiScript III qRT SuperMix，37℃反应15min，85℃5s终止反应获得cDNA，保存至-20℃冰箱。
(6)实时荧光定量PCR：将步骤(5)中的cDNA按照SYBR Green Master Mix说明书稀释并与引物(Myogenin：F-GAGACATCCCCCTATTTCTACCA，R-GCTCAGTCCGCTCATAGCC；MyHC：F-CTCAAGCTGCTCAGCAATCTATTT，R-GGAGCGCAAGTTTGTCATAAGGT；Caspase 3：F-GGAGTCTGACTGGAAAGCCGAA，R-CTTCTGGCAAGCCATCTCCTCA；18S：F-GTAACCCGTTGAACCCCATT，R-CCATCCAATCGGTAGTAGCG)混合配制反应液，于实时荧光定量PCR仪按95℃预变性30s，扩增(95℃熔解5s，60℃退火延伸30s)40个循环，获得Ct值，按照ΔΔCT法以18S为内参基因计算成肌基因Myogenin，MyHC和凋亡基因Caspase 3。
结果如图6所示，改良肌源性无血清分化培养基a中成肌细胞成肌相关基因Myogenin和MyHC的表达量是肌源性无血清分化培养基中细胞的4-6倍，凋亡基因Caspase 3仅为其1/3-1/2，并且与传统肌源性分化培养基相比两者表达水平基本持平。说明改良肌源性无血清分化培养基a能诱导正常的肌源性分化并降低分化过程中细胞的凋亡。
实施例4 Western blot检测分化特异性蛋白表达量
将C2C12细胞按4×105个/孔量接种于6孔板中，共接种3孔，培养于肌源性生长培养基中24h，待细胞汇合度达70％-90％，吸去上清，3孔的细胞分别于3mL肌源性无无血清分化培养基、传统肌源性分化培养基及改良无血清肌源性分化培养基a中分化5天，隔2天更换相对应的新鲜培养基。
取分化5天的C2C12细胞，0.25％胰酶消化离心后加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30min，离心取上清。按照碧云天BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度，按照体积比3：1加入4×loading buffer，混匀后95℃蛋白变性5min。
SDS-PAGE凝胶电泳：配置好电泳缓冲液，将样品加入10％变性琼脂糖预制凝胶板，取含50μg蛋白样品加至上样孔中，设置电压120V电泳2h。
转膜：配置好转膜液，并于冰上提前预冷1h。将PVDF膜于甲醇活化10s后，同凝胶、滤纸在转膜液中浸泡5min。按照黑色海绵、双层滤纸、凝胶、PVDF膜、双层滤纸、白色海绵的顺序放置，夹紧后，放入槽中以300mA电流转膜210min。
封闭：将转膜完成的PVDF膜用含0.1vol％Tween 20 TBST清洗3次，每次5min。加入封闭液(1％BSA的TBST)封闭15min。
一抗和二抗孵育：分别按1：500稀释MyHC抗体、1：20000稀释GAPDH抗体，4℃孵育过夜。孵育后回收一抗，含0.1vol％Tween 20 TBST清洗3次，每次5min，加入1：20000稀释的二抗，37℃摇床孵育1h，结束后用含0.1vol％Tween 20 TBST清洗3次，每次5min。
显影：使用ECL显影液暗处覆盖PVDF膜，于凝胶成像仪下拍照。并使用Image J分析软件进行灰度分析。
结果如图7所示，与传统肌源性分化培养基相比，成肌细胞于改良肌源性分化培养基a肌肉特异性蛋白MyHC在分化第3天和第5天表达量无显著性差异，且随着分化天数的增加，蛋白表达量提高。说明改良肌源性分化培养基a在促进成肌细胞合成优质蛋白的作用上可替代传统含血清的肌源性分化培养基。
实施例5诱导肌源性细胞分化
将小鼠成肌细胞C2C12按8×104个/孔量接种于24孔板中培养于肌源性生长培养基中24h，待细胞汇合度达70％-90％，吸去上清，添加1mL改良无血清肌源性分化培养基b中分化5天，隔2天更换相对应的新鲜培养基，于倒置显微镜下观测分化5天细胞的表观变化。
实施例6诱导肌源性细胞分化
将小鼠成肌细胞C2C12按8×104个/孔量接种于24孔板中，培养于肌源性生长培养基中24h，待细胞汇合度达70％-90％，吸去上清，添加1mL改良无血清肌源性分化培养基c中分化5天，隔2天更换相对应的新鲜培养基，于倒置显微镜下观测分化5天细胞的表观变化。
实施例7诱导肌源性细胞分化
将小鼠成肌细胞C2C12按8×104个/孔量接种于24孔板中，培养于肌源性生长培养基中24h，待细胞汇合度达70％-90％，吸去上清，添加1mL改良无血清肌源性分化培养基d中分化2天，吸取上清，添加改良无血清肌源性分化培养基d中分化3天，隔2天更换相对应的新鲜培养基，于倒置显微镜下观测分化后的细胞的表观变化。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种细胞培养添加剂，其特征在于，为组分A、组分B和组分C组成的组合物；
所述组分A为胰岛素、乙醇胺、转铁蛋白、血清白蛋白、纤粘连蛋白、亮氨酸、谷氨酰胺、维生素C、胆固醇、硬脂酸、肌醇、亚油酸、油酸和软脂酸；所述组分B为类胰岛素一号生长因子及表皮细胞生长因子；组分C为柚皮素；
所述胰岛素的使用浓度为1μg/mL、乙醇胺的使用浓度为10μg/mL、转铁蛋白的使用浓度为5μg/mL、血清白蛋白的使用浓度为1mg/mL、纤粘连蛋白的使用浓度为5μg/mL、亮氨酸的使用浓度为100μg/mL、谷氨酰胺的使用浓度为500μg/mL、维生素C的使用浓度为1μg/mL、肌醇的使用浓度为0.1μg/mL、胆固醇的使用浓度为1μg/mL、硬脂酸的使用浓度为0.2μg/mL、亚油酸的使用浓度为0.2μg/mL、油酸的使用浓度为0.2μg/mL、软脂酸的使用浓度为0.2μg/mL；
所述类胰岛素一号生长因子的使用浓度为20ng/mL，表皮细胞生长因子的使用浓度为2ng/mL；
柚皮素的使用浓度为20μM。
2.一种肌源性细胞无血清培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和权利要求1所述细胞培养添加剂。
3.根据权利要求2所述的一种肌源性细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种。
4.一种诱导肌源性细胞分化的使用方法，其特征在于，所述使用方法为将肌源性细胞在肌源性生长培养基中培养20～30h后，将培养基更换为权利要求2或3所述的肌源性细胞无血清培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法为将肌源性细胞置于权利要求2或3所述的肌源性细胞无血清培养基分化5天。
6.权利要求1所述细胞培养添加剂、权利要求2或3所述肌源性细胞无血清培养基或权利要求4或5所述方法在肌源性细胞培养领域的应用。
CN202210041678.9A 2022-01-14 2022-01-14 一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用 Active CN114752554B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210041678.9A CN114752554B (zh) 2022-01-14 2022-01-14 一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210041678.9A CN114752554B (zh) 2022-01-14 2022-01-14 一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114752554A CN114752554A (zh) 2022-07-15
CN114752554B true CN114752554B (zh) 2023-06-13

Family

ID=82325579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210041678.9A Active CN114752554B (zh) 2022-01-14 2022-01-14 一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114752554B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116004526A (zh) * 2022-12-27 2023-04-25 超技良食(深圳)生物科技有限公司 一种用于鸡骨骼肌卫星细胞体外分化的培养基及制备方法和应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010031190A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 UNIVERSITé LAVAL Culture medium for myoblasts, precursors thereof and derivatives thereof
WO2016130734A1 (en) * 2015-02-11 2016-08-18 Bristol-Myers Squibb Company Use of phenolic antioxidants in cell culture for the production of proteins
EP3481191A2 (en) * 2016-07-11 2019-05-15 Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Systems and methods for growing cells in vitro
CN112553147B (zh) * 2020-12-17 2023-07-18 江南大学 一种促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合物及其应用
CN112592890A (zh) * 2020-12-17 2021-04-02 江南大学 一种促进肌肉干细胞增殖的方法
CN112553148A (zh) * 2020-12-24 2021-03-26 南京农业大学 一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基及其应用
CN112708591B (zh) * 2020-12-24 2022-04-29 南京周子未来食品科技有限公司 一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基

Also Published As

Publication number Publication date
CN114752554A (zh) 2022-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fink et al. Adipogenic differentiation of human mesenchymal stem cells
US20230066648A1 (en) Method for inducing transdifferentiation of somatic cells into mammary epithelial cells in vitro using small molecule compound
Quaroni Development of fetal rat intestine in organ and monolayer culture.
CN112708591B (zh) 一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基
US11339372B2 (en) Serum-free medium inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cell into insulin-secretion-like cell and preparation method and use thereof
CN112608894A (zh) 一种间充质干细胞培养基
CN114752554B (zh) 一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用
KR102292132B1 (ko) 무혈청 배지 조성물
CN110462025A (zh) 增强干细胞存活和增殖的培养基和方法
US20130059378A1 (en) Human epidermis-derived mesenchymal stem cell-like pluripotent cells and preparation method thereof
CN113403271A (zh) 一种间充质干细胞无血清培养基
CN114574433B (zh) 一种化学成分明确的用于肌源性细胞体外增殖的培养基
WO2021009778A2 (en) Methods for culturing mesenchymal stem cells, products thereof, and applications thereof
CN115927172A (zh) 一种诱导体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基及其应用
Wu et al. Derivation of clinical-grade mesenchymal stromal cells from umbilical cord under chemically defined culture condition–platform for future clinical application
CN115404210A (zh) 一种抑制脐带间充质干细胞衰老的方法
Lim et al. Decellularized feeders: an optimized method for culturing pluripotent cells
CN102041244A (zh) 一种诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的试剂盒及其应用和诱导细胞分化的方法
CN103484426B (zh) 一种无动物源的低蛋白培养基
CN106867965B (zh) 一种脂肪干细胞高效诱导分化剂和诱导分化培养基
Nagase et al. Neurospheres from human adipose tissue transplanted into cultured mouse embryos can contribute to craniofacial morphogenesis: a preliminary report
CN117660313A (zh) 一种诱导间充质干细胞成脂分化的培养基及方法
Hong et al. Myogenesis of Porcine Muscle Satellite Cells by Extracellular Matrix From Fibrotic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells
Lee et al. Enhancement of milk protein expression in mammary epithelial cells via co-culturing with preadipocyte cells
CN114540282B (zh) 多能干细胞诱导分化获得间充质干细胞的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant