CN115927172A - 一种诱导体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种诱导体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基及其应用，能帮助间充质干细胞、成纤维细胞在体外更安全、廉价、高效地进行成脂诱导分化。该改良培养基相较于现有的含血清成脂分化培养基，能够在分化成熟阶段，极显著地提高细胞地成脂效率，显著提高C/EBPα、FABP4、Plin‑1、PPARγ的基因表达水平，显著提高FABP4、Plin‑1、PPARγ的蛋白表达水平，并且该改良培养基在较大的浓度范围内都能达到现有的间充质干细胞含血清成脂分化培养基的效果，在细胞培养肉生产中也能诱导形成更多更大的脂滴，为细胞培养肉形成更多的脂肪提供了更高效、廉价、安全的方法。

Description

一种诱导体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基及其应用

技术领域

本发明属于干细胞和动物细胞培养肉技术领域，具体地，涉及一种诱导体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基及其应用。

背景技术

肉类中富含蛋白质、脂肪和微量营养素，被人类广泛食用。其中脂肪能够提供大量的能量、蛋白质和营养物质，使肉类富有风味、口感和多汁性，因此备受消费者的青睐。但是随着社会的发展和人口的增长，肉类的消费量逐年增加，依赖于畜牧业的传统肉类生产方式已无法满足快速膨胀的肉类需求缺口，且在资源利用、环境保护、动物福利、流行病控制等多方面存在风险。因此，为了实现肉类的可持续安全生产，迫切需要开发一种绿色高效的肉类生产方式来部分替代传统肉类生产。

细胞培养肉是依据动物肉类生长机理，利用其干细胞进行体外培养而获得的肉类，它不需要经过动物养殖，直接用细胞工厂化生产肉类。细胞培养肉作为一种颠覆性肉类生产方式为补充未来肉类供应、实现肉类绿色生产提供了新的途径。根据测算，相较于传统的畜牧业，细胞培养肉产业能减少35％～60％的能耗、少占用98％的土地和少产生80％以上的温室气体。

细胞培养肉中，包括体外培养获得的肌肉细胞和脂肪细胞。其中，脂肪细胞的分化来源可以是脂肪间充质干细胞或成纤维细胞。

脂肪间充质干细胞是指从脂肪组织提取物中分离的具有自我更新及多向分化潜能的细胞，它同时具有横向的跨胚层分化的能力。脂肪间充质干细胞由于具有提取简单、来源广泛等特点，而且不涉及伦理道德问题，近年来已经成为了干细胞研究的热点之一。其中脂肪间充质干细胞能够体外分化形成脂滴的能力可以被用于细胞培养脂肪的生产，因此选择一种优良的间充质干细胞成脂分化培养基是细胞培养脂肪生产的关键一环，直接影响脂肪的形成和质量。

成纤维细胞是哺乳动物体内最常见的结缔组织细胞，由胚胎时期的中胚层间充质细胞分化而来，在组织细胞更新、组织修复以及组织再生等多方面发挥作用。近期研究发现，成纤维细胞除了有成肌分化、成骨分化、成神经分化、ECM分泌等诱导方向，还可以进行成脂分化诱导，为细胞培养脂肪的生产提供新的方案支持，因此一种性能优良的成纤维细胞成脂分化培养基成了细胞培养肉行业的需求之一，影响到细胞诱导分化后脂肪的形成和质量。

目前普遍使用的体外间充质干细胞或成纤维细胞诱导分化脂滴形成的培养基配方以DMEM/F12基础培养基加入一定比例的胎牛血清和/或双抗为基础，添加1μM地塞米松、100μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/mL胰岛素、100μM吲哚美辛和2μM罗格列酮。该培养基配方能够支持基本的细胞成脂分化过程，对于间充质干细胞，在分化第3-5天开始有脂滴形成，在第10天左右达到最高的脂滴形成率；对于成纤维细胞，在分化第14天左右能看到一定的脂滴形成。但是该培养基配方由于胎牛血清的添加，导致存在化学成分不明确、不同批次成分不稳定、易存在病毒等病原体污染、成本高昂等问题。此外，该培养基条件下的脂肪间充质干细胞成脂分化效率低。这意味这运用该含血清的体外脂肪间充质干细胞诱导成脂分化培养基无法大规模高效、稳定、廉价、质量可控地生产细胞培养脂肪，严重阻碍了细胞培养肉产业化地进程。因此，开发一种化学成分明确的、能够促进间充质干细胞或成纤维细胞高效成脂分化的无血清分化培养基变得尤为重要。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是替代传统的成脂分化培养基，提供一套化学成分明确的成纤维细胞体外成脂分化的培养基及其应用方法。

本发明的第一个目的是提供一种体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基，所述改良分化培养基包括基础分化培养基和细胞培养补充因子，所述改良分化培养基不含血清成分。本发明的改良分化培养基能够应用于能够成脂分化的所有细胞，包括但不限于细胞为间充质干细胞或成纤维细胞。

所述无血清成分是指不添加有包括马血清、胎牛血清、牛血清、人血清等任何动物血清成分。

本发明所述改良分化培养基通过添加细胞培养补充因子，来替代传统间充质干细胞成脂分化培养基中的血清成分。

进一步的，所述基础分化培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基、F12培养基中的一种。

进一步的，所述细胞培养补充因子包括激素类化合物、蛋白类物质、小分子化合物中的一种或多种。

进一步的，所述激素类化合物选自胰岛素、地塞米松、皮质醇中的一种或多种的组合；

所述蛋白质类物质选自转铁蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、白蛋白、胰岛素样生长因子、表皮生长因子中的一种或多种的组合；

所述小分子化合物选自亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸磷酸三钠盐、Rock抑制剂、ALK5抑制剂、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、罗格列酮、吲哚美辛中的一种或多种的组合。

本发明所述Rock抑制剂种类无限制，作为举例，所述Rock抑制剂选自ZINC00881524、Y-27632 2HCl、Thiazovivin。

本发明所述ALK5抑制剂种类无限制，作为举例，所述ALK5抑制剂为SB431542、LY2157299、LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947。

进一步的，所述改良分化培养基中，细胞培养补充因子添加的总浓度范围不低于0.4mg/mL；

优选的，细胞培养补充因子添加的总浓度范围为0.4mg/mL-205mg/mL；

进一步优选的，细胞培养补充因子添加的总浓度范围为2.0mg/mL-205mg/mL；

更进一步优选的，细胞培养补充因子添加的总浓度范围4.04mg/mL-41mg/mL。

进一步的，所述任一细胞培养补充因子的浓度不低于0.1ng/mL；

优选的，任一细胞培养补充因子的浓度范围为0.1ng/mL-200mg/mL；

进一步优选的，任一细胞培养补充因子的浓度范围为0.5ng/mL-200mg/mL

更优选的，任一细胞培养补充因子的浓度范围为1ng/mL-40mg/mL。

本发明的第二个目的是提供前述的改良分化培养基在体外诱导细胞成脂分化中的应用。

本发明的改良分化培养基能够应用于能够成脂分化的所有细胞体外诱导成脂分化，包括但不限于细胞为间充质干细胞或成纤维细胞。

进一步的，在体外诱导细胞成脂分化的全过程均采用唯一配方的改良分化培养基，或者在体外诱导细胞成脂分化的不同阶段分别采用本发明方案内不同配方的改良分化培养基。

作为一种特殊的实施方式，本发明的体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基中，细胞培养补充因子如下表A所示：

表A

或者，作为另一种特殊的实施方式，本发明的体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基中，细胞培养补充因子如下表B所示：

表B

优选的，在体外诱导细胞成脂分化过程中，在表A或表B的基础上，按如下表C或表D进行换液：

表C

表D

进一步的，所述的改良分化培养基能够在体外诱导间充质干细胞的成脂分化，具体的，能够提高间充质干细胞、成纤维细胞在体外成脂分化过程中的分化效率、分化能力、分化水平。

进一步的，所述改良分化培养基在体外诱导细胞成脂分化中，能够提高成纤维细胞成脂分化的效率，诱导分化成熟期的成纤维细胞经油红染色定量后有更高的吸光值。

本发明所述“效率”是指单位细胞能产生更多的脂滴，相对于传统培养基，等量的初始细胞数，分化成熟时能得到更多脂滴。

进一步的，所述改良分化培养基能够提高成脂相关基因C/EBPα、FABP4、Plin-1、PPARγ的基因表达量，能够提高成脂相关蛋白FABP4、Plin-1、PPARγ的蛋白表达量。

采用本发明改良分化培养基对间充质干细胞体外诱导分化10天后，细胞成脂效率经油红定量测定提高了1.25倍。细胞成脂相关基因C/EBPα提高了1.23倍、FABP4提高了2.87倍、Plin-1提高了1.75倍、PPARγ提高了1.21倍。细胞成脂相关蛋白FABP4表达量提高了1.85倍、Plin-1表达量提高了1.73倍，PPARγ表达量提高了1.96倍。

采用本发明改良分化培养基对成纤维细胞体外诱导分化22天后，细胞成脂效率经油红定量测定提高了4.36倍。细胞成脂相关基因C/EBPα提高了24.00倍、FABP4提高了11961.45倍、Plin-1提高了859.73倍、PPARγ提高了18.91倍。细胞成脂相关蛋白FABP4表达量提高了4.50倍、Plin-1表达量提高了12.21倍。

本发明的第三个目的是提供前述的改良分化培养基在制备细胞培养肉中的应用，采用前述的改良分化培养基对细胞培养肉凝胶中的细胞进行体外成脂诱导分化。

本发明的改良分化培养基能够应用于能够成脂分化的所有细胞，包括但不限于细胞为间充质干细胞或成纤维细胞。具体的，所述应用为在培养肉生产的3D成脂分化过程中，采用前述的改良分化培养基，使细胞诱导分化形成更多的脂滴。

所述用于间充质干细胞或成纤维细胞体外成脂分化的改良分化培养基在制备细胞培养肉过程中，能够提高培养肉中脂滴的数量与单个脂滴的大小。

作为该应用的一种特殊的实施方式，将用于间充质干细胞或成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基应用于细胞培养肉的制备，包括以下步骤：

1)将海藻酸钠溶于DMEM/F12(1:1)中，配制2％(m/v)海藻酸钠溶液；将氯化钙溶于水中，配制2％(m/v)氯化钙溶液。

2)将间充质干细胞以2×10⁷个/mL的密度与上述2％(m/v)海藻酸钠溶液混合均匀。

3)将上述的细胞/海藻酸钠混合液注射入含2％(m/v)氯化钙溶液的培养皿中，待细胞培养肉凝胶结构形成后，用PBS清洗1-2遍。

4)用间充质干细胞增殖培养基或成纤维细胞增殖培养基培养细胞培养肉，1天后用上述的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基润洗两次后并持续培养，间充质干细胞持续培养10天，成纤维细胞持续培养18天；优选的，每隔2天换液。

进一步的，前述细胞培养的环境条件为常规细胞体外培养条件，作为举例，在CO₂培养箱中37℃培养，CO₂培养箱中CO₂浓度为5％(v/v)。

本发明的第四个目的是提供采用前述的改良分化培养基进行成脂诱导分化得到的细胞培养肉。所述应用为采用前述的改良分化培养基对细胞培养肉凝胶进行体外诱导分化。

与采用常规的含血清培养基诱导细胞培养肉分化相比，可以提高细胞的成脂分化效率，进而提高细胞培养肉的脂肪含量。

本发明技术方案所实现的有益效果为：

本发明为用于成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基，通过细胞培养补充因子的添加，代替血清在分化培养基中的使用，避免了血清使用存在的诸多问题。同时，在体外诱导成纤维细胞成脂分化过程中，能够极显著地提高分化效率、激发其分化潜能，产生更多的脂滴，脂滴更大。此外，采用本发明所述的成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基在制作细胞培养肉时，也能产生更多、更大的脂滴，生产出品质更高的细胞培养脂肪，助力细胞培养肉产业的发展。

与现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基相比，本发明所述的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基在诱导分化8天后，产生的脂滴经油红染色定量后，吸光值显著高于含血清培养基组；从成脂分化相关基因表达水平来看，本发明所述的改良培养基对于间充质干细胞，在诱导分化6天后，极显著提高C/EBPα的基因表达水平；在诱导分化2天后，极显著提高FABP4的基因表达水平；在诱导分化6天后，极显著提高Plin-1的基因表达水平；在诱导分化6天后，显著提高PPARγ的基因表达水平。从成脂分化相关蛋白表达水平来看，本发明所述的改良培养基对于间充质干细胞，在诱导分化8天后，极显著提高FABP4的蛋白表达水平；在诱导分化8天后，显著提高Plin-1的蛋白表达水平；在诱导分化10天后，显著提高PPARγ的蛋白表达水平。此外，本发明所述的改良培养基所添加的细胞补充因子的浓度范围较大，在较低浓度下也能达到含血清对照组的效果。

与常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基相比，本发明的成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基在诱导分化22天后，产生的脂滴经油红染色定量后，吸光值显著高于含血清培养基组；成脂分化相关基因Plin-1、FABP4、PPARγ、C/EBPα的表达水平都有至少几十倍的提高。成脂分化相关蛋白Plin-1和FABP4的表达水平都显著提高。

此外，采用本发明的改良分化培养基体外诱导间充质干细胞或成纤维细胞体外成脂分化生产细胞培养肉，可以诱导分化出更多、更大的脂滴，为细胞培养肉形成更多的脂肪提供了更高效、廉价、安全的方法。

附图说明

图1本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基用于诱导间充质干细胞体外成脂分化第0、2、4、6、8、10天的明场拍照图片。

图2本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基用于诱导间充质干细胞体外成脂分化第0、2、4、6、8、10天细胞油红染色后明场拍照图片。

图3本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基用于诱导间充质干细胞体外成脂分化第0、2、4、6、8、10天细胞油红染色后在510nm波长处测定吸光值的统计图。

图4本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基用于诱导间充质干细胞体外成脂分化，细胞在第0、2、4、6、8、10天C/EBPα、FABP4、Plin-1、PPARγ基因的表达情况统计图。

图5本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基用于诱导间充质干细胞体外成脂分化，细胞在第0、2、4、6、8、10天FABP4、Plin-1、PPARγ蛋白的表达情况显影条带及灰度值分析统计图。

图6本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基分别诱导细胞培养肉中的间充质干细胞成脂分化，尼罗红染色结果荧光(530nm)图片。

图7本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基中不同的细胞培养补充因子浓度，对于间充质干细胞成脂分化效果的影响，成脂分化第10天明场拍照图片。

图8本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基中不同的细胞培养补充因子浓度，对于间充质干细胞成脂分化效果的影响，成脂分化第10天收样油红染色后拍照结果。

图9本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基中不同的细胞培养补充因子浓度，对于间充质干细胞成脂分化效果的影响，成脂分化第10天收样油红染色定量统计图。

图10本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基用于诱导成纤维细胞体外成脂分化第1、6、10、14、18、22天的明场拍照图片。

图11本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基用于诱导成纤维细胞体外成脂分化第22天细胞油红染色后明场拍照图片。

图12本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基用于诱导成纤维细胞体外成脂分化第22天细胞油红染色后在510nm波长处测定吸光值的统计图。

图13本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基用于诱导成纤维细胞体外成脂分化，细胞在第22天C/EBPα、FABP4、Plin-1、PPARγ基因的表达情况统计图。

图14本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基用于诱导成纤维细胞体外成脂分化，细胞在第22天FABP4、Plin-1蛋白的表达情况显影条带及灰度值分析统计图。

图15本发明体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基分别诱导细胞培养肉中的成纤维细胞成脂分化，分化第18天尼罗红染色结果荧光(530nm)图片。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1间充质干细胞体外诱导分化及油红染色定量

本实验分为两组，分别为现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基方法和本发明所述的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基处理组。

本实施例中，增殖阶段使用的间充质干细胞增殖培养基配方均为90vol％F10基础培养基、10vol％胎牛血清并加入5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。

本实施例中，现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基方法(阳性对照)如下：

基础配方为90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、10vol％胎牛血清，在分化不同时间，按表1所示方案更换为在基础配方基础上添加相应因子的分化培养基。

即：诱导分化的第0～4天，采用在90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、10vol％胎牛血清的基础配方基础上，添加1μM地塞米松、0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/mL胰岛素、0.1mM吲哚美辛、2μM罗格列酮的诱导分化培养基，分别在0、2、4天换液；诱导分化的第5天时更换为90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、10vol％胎牛血清的基础配方基础上，添加10μg/mL胰岛素的诱导分化培养基；诱导分化的第7～10天，更换为90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、10vol％胎牛血清的基础配方，分别在7、9天换液。

表1

本发明所述的化学成分明确的改良分化培养基如下：

基础分化培养基为DMEM/F12(1:1)，按表2所示方案添加细胞培养补充因子A～L作为基础配方，在分化不同时间，按表3所示方案更换为在基础配方基础上添加相应因子的分化培养基。即：诱导分化的第0～4天，采用在90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、表2所示方案添加细胞培养补充因子A～L的基础配方基础上，添加1μM地塞米松、0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/mL胰岛素、2μM罗格列酮的改良诱导分化培养基，分别在0、2、4天换液；诱导分化的第5天时更换为90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、表2所示方案添加细胞培养补充因子A～L的基础配方基础上，添加10μg/mL胰岛素的改良诱导分化培养基；诱导分化的第7～10天，更换为90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、表2所示方案添加细胞培养补充因子A～L的基础配方，分别在7、9天换液。

表2

表3

本实施例中采用的细胞为幼猪间充质干细胞，进一步的为贴壁细胞，更进一步的是幼猪脂肪来源间充质干细胞，更进一步的，是从幼猪身上分离得到的，采用CD31、CD45、CD29、CD140a表面抗体通过流式分选仪分选得到的猪脂肪间充质干细胞。

本实施例中采用的培养条件皆为CO₂培养箱中37℃培养，CO₂的浓度皆为5％(v/v)。

本实施例中采用的检测方法，除非另外说明，否则都是领域内公开的实验方法、检测方法和制备方法。具体参见WenJuan Song等人的文献“Identification of porcineadipose progenitor cells by fluorescence-activated cell sorting for thepreparation of cultured fat by 3D bioprinting”(DOI:10.1016/j.foodres.2022.111952)。

本实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

具体处理方法如下：

1)细胞接种：分选后的P6之前的幼猪脂肪来源间充质干细胞按80000个/皿的细胞密度接种到3.5cm的细胞培养皿中，用间充质干细胞增殖培养基培养，每2天换液1次。

2)诱导分化：待细胞增殖指铺满整个培养皿后(90％以上密度)，吸去间充质干细胞增殖培养基，分别用现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基方法(阳性对照)按上述表1的换液方法换液和本发明的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基按上述表2和表3的诱导分化换液方法进行换液。用光学显微镜观察记录脂滴形成情况。

3)油红染色定量：取上述两组诱导分化10天的细胞，用4％vol多聚甲醛常温固定30min或4℃固定12h，用PBS清洗2遍后，加入染色洗涤液覆盖细胞20秒，吸出染色洗涤液，加入1mL油红O染色工作液，染色10-20分钟，之后去除油红O染色工作液，加入1mL染色洗涤液，静置30秒后去除，用PBS洗涤20秒后用1mLPBS覆盖细胞，在显微镜下观察和拍照。吸去PBS，加入1mL异丙醇，避光环境中在摇床中摇15分钟，结束后取200ul至96孔板中，采用酶标仪在510nm波长处测定吸光值。

4)结果显示：本发明提供的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基，相对于现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基，能够提高间充质干细胞的成脂分化效率，明场拍照能观察到更多的脂滴形成(图1)。油红染色定量结果表明，在诱导分化8天后，细胞的成脂效率极显著地优于现有的含血清培养基，具体的，对间充质干细胞体外诱导分化10天后，细胞成脂效率经油红定量测定提高了1.25倍。(图2、3)。

实施例2幼猪间充质干细胞诱导成脂分化相关基因、蛋白水平检测

1)基因水平检测：

按照实施例1的处理方法，在步骤2)诱导分化的第0、2、4、6、8、10天分别取样，用实时荧光定量PCR分别检测现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)和本发明提供的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基诱导分化第0、2、4、6、8、10天C/EBPα、FABP4、Plin-1、PPARγ的基因表达量(图4)。这四种基因一般随着成脂分化进程的进行，基因的表达量逐渐升高，因此可用于表征成脂分化的水平。

结果表明，本发明的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基相对于现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)能显著提高其成脂相关基因的表达水平，具体的，在诱导分化6天后，极显著提高C/EBPα的基因表达水平；在诱导分化2天后，极显著提高FABP4的基因表达水平；在诱导分化6天后，极显著提高Plin-1的基因表达水平；在诱导分化6天后，显著提高PPARγ的基因表达水平。具体的，在第10天时，细胞成脂相关基因C/EBPα提高了1.23倍、FABP4提高了2.87倍、Plin-1提高了1.75倍、PPARγ提高了1.21倍。因此，本发明所述的化学成分明确的改良培养基提高了间充质干细胞的成脂分化能力和水平。

2)蛋白水平：

按照实施例1的处理方法，在步骤2)诱导分化的第0、2、4、6、8、10天分别取样，分别取现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)和本发明所述的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基诱导成脂分化第0、2、4、6、8、10天的细胞各2盘，各加入100μL的RIPA(另加终浓度1mM PMSF)，在冰上裂解30min收集-20℃保存待用。之后12000g离心5分钟，收集上清,使用赛默飞的BCA试剂盒测定和蛋白浓度，按照4:1(V:V)加入5X的loading buffer，混匀后95℃加热5min变性蛋白,-80℃保存。

SDS-page凝胶电泳:提前配置好电泳缓冲液和转印液(转印液需要另加10％的甲醇)，电泳缓冲液没过12％的变性琼脂糖预制凝胶板情况下，取含20ug变性后的蛋白分别加至上样孔之中，设置电压80V电泳30min和120电泳90min及以上两个程序，观察蛋白上样液是否到达预制板的底部。

转膜：将PVDF膜放入甲醇之中活化10s左右，放入转印液里保存待用，按照海绵、2层滤纸、凝胶、活化的PVDF膜、2层滤纸、海绵放置，用转印夹夹紧，放入电泳槽后加入配置好的转印液90V运行90min。

封闭：将转印结束的PVDF膜放入封闭液(用TBST配置的5％脱脂奶粉)之中，室温摇床封闭2h后吸掉封闭液。

一抗和二抗孵育：按照抗体的具体情况稀释FABP4、Plin-1、PPARγ、GAPDH一抗，4℃孵育14-16h。一抗孵育结束后回收一抗，TBST清洗三遍，每遍5min。加入稀释后的二抗并孵育2h，结束后TBST清洗三遍，每遍5min。

显影：使用显影液暗处覆盖PVDF膜，孵育5min后吸去显影液，凝胶成像仪下拍照。并使用Quantity One分析软件进行灰度分析。本实验使用的内参蛋白为GADPH(图5)。

FABP4、Plin-1、PPARγ这三种蛋白一般随着成脂分化进程的进行，蛋白的表达量逐渐升高，因此可用于表征成脂分化的水平。

结果表明，本发明的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基相对于现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)能显著提高其成脂相关蛋白的表达水平，具体的，在诱导分化8天后，极显著提高FABP4的蛋白表达水平；在诱导分化8天后，显著提高Plin-1的蛋白表达水平；在诱导分化10天后，显著提高PPARγ的蛋白表达水平。具体的，细胞成脂相关蛋白FABP4表达量提高了1.85倍、Plin-1表达量提高了1.73倍，PPARγ表达量提高了1.96倍。因此，本发明所述的化学成分明确的改良培养基提高了间充质干细胞的成脂分化能力和水平。

实施例3基于间充质干细胞的细胞培养肉的制备及尼罗红染色

1)将海藻酸钠溶于DMEM/F12(1:1)中，配制2％(m/v)海藻酸钠溶液；将氯化钙溶于水中，配制2％(m/v)氯化钙溶液。

2)将间充质干细胞以2×10⁷个/mL的密度与上述2％(m/v)海藻酸钠溶液混合均匀；

3)将上述的细胞/海藻酸钠混合液注射入含2％(m/v)氯化钙溶液的培养皿中，待细胞培养肉凝胶结构形成后，用PBS清洗1-2遍。

4)用间充质干细胞增殖培养基培养细胞培养肉，1天后用分别用本发明的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)润洗两次后并持续培养10天，每隔2天换液。具体培养基换液方法同实施例1步骤2)。

5)取上述诱导分化10天的细胞培养肉凝胶，用4％vol多聚甲醛常温固定30min或4℃固定12h，用PBS清洗3遍后，用1％牛血清白蛋白溶液以1：100的比例稀释尼罗红染料，并加入细胞培养肉凝胶样品中，染色20min。染色结束后用PBS清洗染色液并将样品泡在PBS中，用530nm的激发波长观察拍照(图6)。

结果显示，与现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)相比，本发明所述的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基用于细胞培养肉生产过程中的诱导成脂分化，能使细胞培养肉中形成更多更大的脂滴，提高细胞培养肉的生产效率与质量。

实施例4改良培养基浓度范围探究

为了探究本发明的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基对于间充质干细胞成脂诱导分化的适用浓度范围，本实施例以上述表2中各成分浓度为基准，分别同时调整所用成分的浓度，进而探究，具体组别设置如表4。

表4

1)细胞接种：分选后的P6之前的幼猪脂肪来源间充质干细胞按20000个/孔的细胞密度接种到24孔板中，用间充质干细胞增殖培养培养，每2天换液1次。

2)诱导分化：待细胞增殖指铺满整个培养皿后(90％以上密度)，吸去间充质干细胞增殖培养基，分别用表4中的各组别的不同配方浓度的成脂分化培养基诱导细胞成脂分化。其中组别1-14的换液方法按表3步骤进行，组别15的换液方法按表1步骤进行。用细胞成像分析仪进行观察记录脂滴形成情况。

3)油红染色定量：取上述诱导分化10天的细胞，用4％vol多聚甲醛常温固定30min或4℃固定12h，用PBS清洗2遍后，加入染色洗涤液覆盖细胞20秒，吸出染色洗涤液，加入0.5mL油红O染色工作液，染色10-20分钟，之后去除油红O染色工作液，加入0.5mL染色洗涤液，静置30秒后去除，用PBS洗涤20秒后用0.5mLPBS覆盖细胞，在显微镜下观察和拍照。吸去PBS，加入0.5mL异丙醇，避光环境中在摇床中摇15分钟，结束后取200ul至96孔板中，采用酶标仪在510nm波长处测定吸光值。

结果表明，和现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)(组别15)相比，本发明的改良培养基在细胞补充因子浓度大于表2所述的1/5的情况下，并按表3步骤进行换液(组别1-10)均能产生比含血清培养基对照组更多的脂滴(图7)。油红染色及定量结果表明，本发明的改良培养基在细胞补充因子浓度为表2所述的1/10～50倍的情况下，并按表3步骤进行换液(组别1-11)，间充质干细胞产生脂滴的数量显著大于或等于含血清培养基对照组，其中1/2～50倍情况下间充质干细胞产生脂滴的数量均显著大于含血清培养基对照组，在1-10倍情况下间充质干细胞产生脂滴的数量更加优异(图8、9)。因此得出结论，本发明所述的用于间充质干细胞体外成脂分化的化学成分明确的培养基所添加的各细胞补充因子的浓度为表2所述浓度的1/10～50倍范围内，并按表3步骤进行换液，其诱导间充质干细胞成脂分化的效果就能够与现有的现有的间充质干细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)相同或更好。

实施例5幼猪成纤维细胞诱导分化及油红染色定量：

本实施例实验分为两组，分别为常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基方法和本发明所述的成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基处理组。

本实施例中，增殖阶段使用的成纤维细胞增殖培养基配方均为90vol％DMEM/F12(1：1)基础培养基、10vol％胎牛血清，并加入2.5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。

本实施例中，常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基方法(阳性对照)如下：

基础配方为90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、10vol％胎牛血清，在分化不同时间，按表5所示方案更换为在基础配方基础上添加相应因子的分化培养基。

即：诱导分化的第0～10天，采用在90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、10vol％胎牛血清的基础配方基础上，添加1μM地塞米松、0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/mL胰岛素、0.1mM吲哚美辛、2μM罗格列酮的诱导分化培养基，分别在0、2、4、6、8天换液；诱导分化的第10～13天时更换为90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、10vol％胎牛血清的基础配方基础上，添加10μg/mL胰岛素的诱导分化培养基，分别在10、12天换液；诱导分化的第14～22天，更换为90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、10vol％胎牛血清的基础配方，分别在第14、16、18、20天换液。

表5

本发明所述的化学成分明确的改良分化培养基如下：

基础分化培养基为DMEM/F12(1:1)，按表6所示方案添加细胞培养补充因子A～L作为基础配方，在分化不同时间，按表7所示方案更换为在基础配方基础上添加相应因子的分化培养基。

即：诱导分化的第0～10天，采用在90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、表6所示方案添加细胞培养补充因子A～L的基础配方基础上，添加1μM地塞米松、0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/mL胰岛素、2μM罗格列酮的诱导分化培养基，分别在0、2、4、6、8天换液；诱导分化的第10～13天时更换为90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、表6所示方案添加细胞培养补充因子A～L的基础配方基础上，添加10μg/mL胰岛素的诱导分化培养基，分别在10、12天换液；诱导分化的第14～22天，更换为90vol％DMEM/F12(1:1)基础培养基、表6所示方案添加细胞培养补充因子A～L的基础配方，分别在第14、16、18、20天换液。

表6

表7

本实施例中采用的细胞为幼猪猪耳成纤维细胞，进一步的，是从幼猪身上分离得到的，经过Vimentin、TE-7、TCF-4蛋白抗体免疫鉴定纯度高于90％的细胞。

本实施例中采用的培养条件皆为CO₂培养箱中37℃培养，CO₂的浓度皆为5％(v/v)。

本实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1)细胞接种：取幼猪成纤维细胞按80000个/皿的细胞密度接种到3.5cm的细胞培养皿中，用成纤维细胞增殖培养基培养，每2天换液1次。

2)诱导分化：待细胞增殖指铺满整个培养皿后(90％以上密度)，吸去成纤维细胞增殖培养基，分别用常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基方法(阳性对照)按上述表5的换液方法换液和本发明的成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基方法按上述表6和表7的诱导分化换液方法进行换液。用光学显微镜观察记录脂滴形成情况。

3)油红染色定量：取上述两组诱导分化22天的细胞，用4％vol多聚甲醛常温固定30min或4℃固定12h，用PBS清洗2遍后，加入染色洗涤液覆盖细胞20秒，吸出染色洗涤液，加入1mL油红O染色工作液，染色10-20分钟，之后去除油红O染色工作液，加入1mL染色洗涤液，静置30秒后去除，用PBS洗涤20秒后用1mLPBS覆盖细胞，在显微镜下观察和拍照。吸去PBS，加入1mL异丙醇，避光环境中在摇床中摇15分钟，结束后取200ul至96孔板中，采用酶标仪在510nm波长处测定吸光值。

4)结果显示：本发明提供的成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基，相对于常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基，能够提高成纤维细胞的成脂分化效率，明场拍照能观察到更多的脂滴形成(图10)。油红染色定量结果表明，在诱导分化22天后，成纤维细胞的成脂效率极显著地优于常规的含血清培养基，细胞成脂效率经油红定量测定提高了4.36倍。(图11、12)。

实施例6幼猪成纤维细胞诱导成脂分化相关基因、蛋白水平检测

1)基因水平检测：

按照实施例5的处理方法，在步骤2)诱导分化的第22天取样，用实时荧光定量PCR分别检测常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)和本发明提供的成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基诱导分化第22天C/EBPα、FABP4、Plin-1、PPARγ的基因表达量(图13)。这四种基因一般随着成脂分化进程的进行，基因的表达量逐渐升高，因此可用于表征成脂分化的水平。

结果表明，本发明的成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基相对于常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)能显著提高其成脂相关基因的表达水平，具体的，在诱导分化22天后，能够提高C/EBPα的表达水平，极显著提高Plin-1、FABP4、PPARγ的基因表达水平。具体的，细胞成脂相关基因C/EBPα提高了24.00倍、FABP4提高了11961.45倍、Plin-1提高了859.73倍、PPARγ提高了18.91倍。因此，本发明所述的化学成分明确的改良培养基提高了成纤维细胞的成脂分化能力和水平。

2)蛋白水平：

按照实施例1的处理方法，在步骤2)诱导分化的第22天取样，分别取常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)和本发明所述的成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基诱导成脂分化第22天的细胞各2盘，各加入100μL的RIPA(另加终浓度1mM PMSF)，在冰上裂解30min收集-20℃保存待用。之后12000g离心5分钟，收集上清,使用赛默飞的BCA试剂盒测定和蛋白浓度，按照4:1(V:V)加入5X的loading buffer，混匀后95℃加热5min变性蛋白,-80℃保存。

SDS-page凝胶电泳:提前配置好电泳缓冲液和转印液(转印液需要另加10％的甲醇)，电泳缓冲液没过12％的变性琼脂糖预制凝胶板情况下，取含20ug变性后的蛋白分别加至上样孔之中，设置电压80V电泳30min和120电泳90min及以上两个程序，观察蛋白上样液是否到达预制板的底部。

转膜：将PVDF膜放入甲醇之中活化10s左右，放入转印液里保存待用，按照海绵、2层滤纸、凝胶、活化的PVDF膜、2层滤纸、海绵放置，用转印夹夹紧，放入电泳槽后加入配置好的转印液90V运行90min。

封闭：将转印结束的PVDF膜放入封闭液(用TBST配置的5％脱脂奶粉)之中，室温摇床封闭2h后吸掉封闭液。

一抗和二抗孵育：按照抗体的具体情况稀释FABP4、Plin-1、PPARγ、GAPDH一抗，4℃孵育14-16h。一抗孵育结束后回收一抗，TBST清洗三遍，每遍5min。加入稀释后的二抗并孵育2h，结束后TBST清洗三遍，每遍5min。

显影：使用显影液暗处覆盖PVDF膜，孵育5min后吸去显影液，凝胶成像仪下拍照。并使用Quantity One分析软件进行灰度分析。本实验使用的内参蛋白为GADPH。

FABP4、Plin-1这2种蛋白一般随着成脂分化进程的进行，蛋白的表达量逐渐升高，因此可用于表征成脂分化的水平。

结果表明，本发明的成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基相对于常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)能显著提高其成脂相关蛋白的表达水平，具体的，在诱导分化22天后，极显著提高FABP4的蛋白表达水平，显著提高Plin-1的蛋白表达水平。具体的，细胞成脂相关蛋白FABP4表达量提高了4.50倍、Plin-1表达量提高了12.21倍。(图14)因此，本发明所述的化学成分明确的改良培养基提高了成纤维细胞的成脂分化能力和水平。

实施例7基于成纤维细胞的细胞培养肉的制备及尼罗红染色

1)将海藻酸钠溶于DMEM/F12(1:1)中，配制2％(m/v)海藻酸钠溶液；将氯化钙溶于水中，配制2％(m/v)氯化钙溶液。

2)将成纤维细胞以2×10⁷个/mL的密度与上述2％(m/v)海藻酸钠溶液混合均匀；

3)将上述的细胞/海藻酸钠混合液注射入含2％(m/v)氯化钙溶液的培养皿中，待细胞培养肉凝胶结构形成后，用PBS清洗1-2遍。

4)用成纤维细胞增殖培养基培养细胞培养肉，1天后用分别用本发明的成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基和常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)润洗两次后并持续培养18天，每隔2天换液。具体培养基换液方法同实施例5。

5)取上述诱导分化18天的细胞培养肉凝胶，用4％vol多聚甲醛常温固定30min或4℃固定12h，用PBS清洗3遍后，用1％牛血清白蛋白溶液以1：100的比例稀释尼罗红染料，并加入细胞培养肉凝胶样品中，染色20min。染色结束后用PBS清洗染色液并将样品泡在PBS中，用530nm的激发波长观察拍照(图15)。

结果显示，与常规的成纤维细胞体外成脂分化的含血清培养基(阳性对照)相比，本发明所述的成纤维细胞体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基用于细胞培养肉生产过程中的诱导成脂分化，能使细胞培养肉中形成更多更大的脂滴，提高细胞培养肉的生产效率与质量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种体外诱导细胞成脂分化的化学成分明确的改良分化培养基，其特征在于，所述改良分化培养基包括基础分化培养基和细胞培养补充因子，所述改良分化培养基不含血清成分。

2.根据权利要求1所述的改良分化培养基，其特征在于，所述基础分化培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基、F12培养基中的一种。

3.根据权利要求1所述的改良分化培养基，其特征在于，所述细胞培养补充因子包括激素类化合物、蛋白类物质、小分子化合物中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的改良分化培养基，其特征在于，所述激素类化合物选自胰岛素、地塞米松、皮质醇中的一种或多种的组合；

所述蛋白质类物质选自转铁蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、白蛋白、胰岛素样生长因子、表皮生长因子中的一种或多种的组合；

所述小分子化合物选自亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸磷酸三钠盐、Rock抑制剂、ALK5抑制剂、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、罗格列酮、吲哚美辛中的一种或多种的组合。

5.根据权利要求3所述的改良分化培养基，其特征在于，所述改良分化培养基中，细胞培养补充因子添加的总浓度范围不低于0.4mg/mL；

优选的，细胞培养补充因子添加的总浓度范围为0.4mg/mL-205mg/mL；

进一步优选的，细胞培养补充因子添加的总浓度范围为2.0mg/mL-205mg/mL；

更进一步优选的，细胞培养补充因子添加的总浓度范围4.04mg/mL-41mg/mL。

6.根据权利要求3所述的改良分化培养基，其特征在于，所述任一细胞培养补充因子的浓度不低于0.1ng/mL；

优选的，任一细胞培养补充因子的浓度范围为0.1ng/mL-200mg/mL；

进一步优选的，任一细胞培养补充因子的浓度范围为0.5ng/mL-200mg/mL

更优选的，任一细胞培养补充因子的浓度范围为1ng/mL-40mg/mL。

7.权利要求1所述的改良分化培养基在体外诱导细胞成脂分化中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞为间充质干细胞或成纤维细胞。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述改良分化培养基在体外诱导细胞成脂分化中，能够提高成纤维细胞成脂分化的效率，诱导分化成熟期的成纤维细胞经油红染色定量后有更高的吸光值。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述改良分化培养基能够提高成脂相关基因C/EBPα、FABP4、Plin-1、PPARγ的基因表达量，能够提高成脂相关蛋白FABP4、Plin-1、PPARγ的蛋白表达量。

11.权利要求1所述的改良分化培养基在制备细胞培养肉中的应用，其特征在于，采用权利1要求所述的改良分化培养基对细胞培养肉凝胶中的细胞进行体外成脂诱导分化。

12.采用权利要求1所述的改良分化培养基进行成脂诱导分化得到的细胞培养肉。

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