CN115181718B - 一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法 - Google Patents

一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法，涉及水产动物细胞培养技术领域。该方法包括以下步骤：黄喉拟水龟卵巢组织依次经胶原蛋白酶Ⅰ型和胰蛋白酶消化后，终止消化反应，之后分离得到消化后细胞；所述消化后细胞在完全培养基中经原代培养和传代培养得到所述黄喉拟水龟卵巢细胞。本发明提供的分离培养方法操作方便，培养细胞的成活率高，能够建立稳定的黄喉拟水龟卵巢细胞体外原代及传代培养体系。本发明培养的黄喉拟水龟卵巢细胞系能够成功感染外源基因，为研究黄喉拟水龟生殖发育及相关领域研究提供了体外技术平台。

Description

一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及水产动物细胞培养技术领域，特别是涉及一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法。
背景技术
黄喉拟水龟 (Mauremys mutica)俗称石龟、石金龟，隶属龟鳖目(Testudines)、潮龟科(Geoemydidae)、拟水龟属(Mauremys)。黄喉拟水龟生性温顺，体态美观，无异味，有灵性，且是培育绿毛龟的主要基龟品种，观赏价值较高。20世纪90年代以来，黄喉拟水龟人工繁育技术方面取得了较大进展，黄喉拟水龟已成为新兴的大宗淡水养殖龟类。然而，黄喉拟水龟繁殖周期较长，需经过5-6年才能性成熟。
目前，龟鳖动物关于体组织细胞培养存在着生长缓慢、无法稳定传代、生长不稳定等诸多问题，主要原因是没有摸索出龟鳖动物细胞生长的培育条件，而龟鳖动物卵巢细胞的培养也只在中华鳖中有相关报道。然而，黄喉拟水龟卵巢细胞与中华鳖卵巢细胞在细胞的最佳培养条件(温度、pH)、培养基配方上存在着不同，使用中华鳖卵巢细胞的培养基，黄喉拟水龟卵巢细胞无法生长。鉴于此，探寻一种黄喉拟水龟卵巢细胞体外分离培养的方法对于黄喉拟水龟繁殖效率提高及珍稀物种种质资源的保存利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法，以解决上述现有技术存在的问题，能获得高存活率且稳定传代的黄喉拟水龟卵巢细胞系。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)黄喉拟水龟卵巢组织依次经胶原蛋白酶Ⅰ型和胰蛋白酶消化后，终止消化反应，之后分离得到消化后细胞；
(2)所述消化后细胞在完全培养基中经原代培养和传代培养得到所述黄喉拟水龟卵巢细胞；所述完全培养基包括以下成分：杜氏伊格尔培养基13.5-14g/L、HEPES粉末4.76g/L、非必需氨基酸0.01-0.02mM、丙酮酸钠0.1-0.2mM、双抗 penicillin/streptomycin 50-100μM、β-巯基乙醇100-150μM、亚硒酸钠1-2nM、胎牛血清150-200mL/L、鱼血清2-4mL/L、鸡血清10-15mL/L、生长因子5-10ng/L。
进一步地，在步骤(1)中，所述胶原蛋白酶Ⅰ型的工作浓度为1mg/mL。
进一步地，在步骤(1)中，所述胶原蛋白酶Ⅰ型的消化时间为20min。
进一步地，在步骤(1)中，所述胰蛋白酶的质量百分含量为0.025-0.25％。
进一步地，在步骤(1)中，所述胰蛋白酶的消化时间为5～20min。
进一步地，在步骤(1)中，利用胎牛血清终止消化反应。
进一步地，在步骤(2)中，所述完全培养基的pH为7.4～7.6。
进一步地，在步骤(2)中，所述原代培养和传代培养的培养温度为27～29℃。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了一种能够高效分离培养黄喉拟水龟卵巢细胞的方法，该方法操作方便，培养细胞的成活率高，能够建立稳定的黄喉拟水龟卵巢细胞体外原代及传代培养体系。本发明培养的黄喉拟水龟卵巢细胞系能够成功感染外源基因，为研究黄喉拟水龟生殖发育及相关领域研究提供了体外技术平台。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1体外传代培养的黄喉拟水龟卵巢细胞显微照片；
图2为实施例1体外培养的黄喉拟水龟卵巢细胞染色体分析照片；
图3为实施例1体外培养的黄喉拟水龟卵巢细胞免疫荧光鉴定图片；
图4为实施例1体外培养的黄喉拟水龟卵巢细胞感染外源基因的图片；
图5为实施例2体外传代培养的黄喉拟水龟卵巢细胞显微照片；
图6为实施例2体外培养的黄喉拟水龟卵巢细胞染色体分析照片；
图7为实施例2体外培养的黄喉拟水龟卵巢细胞免疫荧光鉴定图片；
图8为实施例2体外培养的黄喉拟水龟卵巢细胞感染外源基因的图片；
图9为实施例3体外传代培养的黄喉拟水龟卵巢细胞显微照片；
图10为实施例3体外培养的黄喉拟水龟卵巢细胞染色体分析照片；
图11为实施例3体外培养的黄喉拟水龟卵巢细胞免疫荧光鉴定图片；
图12为实施例3体外培养的黄喉拟水龟卵巢细胞感染外源基因的图片；
图13为对比例1体外传代培养的黄喉拟水龟卵巢细胞显微照片。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中所涉及的仪器与试剂来源如下：超净工作台，恒温细胞培养箱(上海博迅，中国)，水浴锅，荧光显微镜(Eclipse Ti2，Nikon Corp，Japan)，细胞培养瓶 (NuncTMEasYFlaskTM，Thermo)，离心机(Thermo，Germany)，PBS(碧云天，中国)，胶原蛋白酶(solarbio，China)，胰蛋白酶Ⅰ型(LS004196，Worthington)，0.25％trypsin (TLS003703，Worthington)，杜氏伊格尔培养基、非必需氨基酸、丙酮酸钠、双抗、胎牛血清均购自Gibco公司，β-巯基乙醇(MPBiomedicals，LLC)，鱼血清、鸡血清(鸿泉生物，中国)，亚硒酸钠(MPBiomedicals，Santa Ana)，HEPES(MP Biomedicals， LLC)，生长因子(Peprotech)。
实施例1
一种黄喉拟水龟卵巢细胞分离培养方法，包括如下步骤：
(1)卵巢采集：采集健康的1龄黄喉拟水龟的卵巢组织，用75％酒精冲(喷)洗一遍消毒，冲去血污后迅速拿入细胞培养室中。用PBS缓冲液冲洗3次后，将干净的卵巢组织放入新的装有PBS的无菌培养皿中。
(2)卵巢细胞收集：将步骤(1)得到的卵巢组织用眼科剪剪成小块组织，在室温下用1mg/mL胶原蛋白酶Ⅰ型(100mg胶原蛋白酶Ⅰ型溶于100mL PBS配制)，在 pH7.4条件下，室温消化组织块20min，然后用0.25％胰蛋白酶(0.25g胰酶溶于100mL PBS配制)，在pH7.2条件下，消化卵巢组织20min(5～20min可达相同效果)，之后向消化完全的卵巢组织加入与胰蛋白酶等体积的胎牛血清，终止消化。将消化后的卵巢用细胞筛过滤，并用完全细胞培养基冲洗滤网，在15mL的离心管中封口1000rmp 离心10min，弃上清，再加入完全培养基悬浮细胞，重复此过程一次。
(3)卵巢细胞原代培养：将步骤(2)离心收集的细胞沉淀加入1mL完全培养基重悬，然后全部转移至含有5mL完全培养基的细胞培养瓶中，pH7.4(pH7.4～7.6可达相同效果)，放入28℃培养箱内(温度在27～29℃可达相同效果)，培养10天。在培养瓶上标注细胞种类、日期等信息。在显微镜下观察细胞贴壁状态，细胞每24h换液一次。
(4)卵巢细胞传代培养：待原代培养的细胞增殖铺满瓶底后弃去培养基，加入1mLPBS缓冲液清洗贴壁细胞，加入1mL 0.25％胰蛋白酶室温消化4min至细胞全部皱缩变圆，出现大量流动状态时加入与胰蛋白酶等量的完全培养基终止胰蛋白酶消化反应，混匀后将混合液转入1.5mL无菌离心管，1000rmp离心10min，弃上清液，加入1mL 完全培养基重悬细胞，之后转入无菌细胞培养瓶中进行传代培养，培养箱温度设置为 28℃。在倒置显微镜下详细观察、记录细胞形态及生长情况，并拍照。
上述步骤(3)中1L完全培养基成分为：杜氏伊格尔培养基(Dulbecco's ModifiedEagle Medium，DMEM)13.5g、HEPES粉末(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2磺酸)4.76g、非必需氨基酸(MEMNEAA)0.01mM、丙酮酸钠0.1mM、双抗penicillin/streptomycin(青霉素/链霉素)50μM、β-巯基乙醇100μM、亚硒酸钠1nM、胎牛血清150mL、鱼血清2 mL、鸡血清10mL、生长因子5ng。
将传代培养获得的黄喉拟水龟卵巢细胞进行细胞形态观察、染色体数目统计、基因表达分析及外源基因感染检测。如图1所示，体外传代培养的黄喉拟水龟卵巢细胞形态规则均一，细胞贴壁良好。细胞的染色体分析显示，黄喉拟水龟细胞染色体数目为2n＝56条(图2)，与黄喉拟水龟行业标准报道的数目一致。细胞免疫荧光分析显示，体外传代培养的黄喉拟水龟卵巢细胞能够表达生殖细胞基因Vasa，且荧光在细胞质周围，表明分离培养的细胞为卵巢细胞具有生殖细胞特性(图3)。此外，在室温下将携带表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的靶基因tdrd7载体腺病毒(HBAD-tdrd7-EGFP) 与黄喉拟水龟卵巢细胞(腺病毒：细胞培养基＝1:1000)孵育1h后，将感染的细胞接种到25cm2的瓶中(NuncTM EasYFlaskTM，Thermo)，然后在28℃下培养。病毒感染后48-72 小时，在倒置荧光显微镜(Eclipse Ti2，尼康公司)下观察细胞并拍照。结果发现，黄喉拟水龟卵巢细胞能够成功感染外源基因(图4)，因此，本实施例的黄喉拟水龟卵巢细胞分离培养方法能够获得稳定传代生长的黄喉拟水龟卵巢细胞系，且此细胞系能够表达外源基因，为黄喉拟水龟生殖生理等机制的研究提供了体外研究平台。
实施例2
同实施例1，区别在于，步骤(1)卵巢采集中用PBS缓冲液冲洗5次后，将干净的卵巢组织放入装有PBS及双抗的无菌培养皿中。步骤(2)中胰蛋白酶浓度为0.025％，消化时间为20min。
实施例3
同实施例1，区别在于，步骤(1)卵巢采集中先用75％酒精冲洗卵巢组织，去除血污后，转入细胞培养室中，即刻放入遇冷的PBS缓冲液中清洗3次。之后加入75％酒精浸泡30s，倒掉酒精，PBS缓冲液冲洗5次。步骤(3)中1L完全培养基成分为：杜氏伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)14g、HEPES粉末4.76g、非必需氨基酸(MEMNEAA)0.02mM、丙酮酸钠0.2mM、双抗penicillin/streptomycin 100μM、β-巯基乙醇150μM、亚硒酸钠2nM、胎牛血清200mL、鱼血清4mL、鸡血清 15mL、生长因子10ng。
将实施例2和3传代培养获得的黄喉拟水龟卵巢细胞分别进行细胞形态观察、染色体数目统计、基因表达分析及外源基因感染检测，发现实施例2及实施例3能够获得和实施例1相同的结果(实施例2的结果见图5-8；实施例3的结果见图9-12)，体外传代培养的黄喉拟水龟卵巢细胞形态规则均一，细胞贴壁良好(实施例2的结果见图5；实施例3的结果见图9)。细胞的染色体分析显示，黄喉拟水龟卵巢细胞染色体数目为2n＝56条(实施例2的结果见图6；实施例3的结果见图10)，与黄喉拟水龟行业标准报道的数目一致。细胞免疫荧光分析显示，我们培养的细胞能够表达生殖细胞基因Vasa，且荧光在细胞质周围，表明我们分离培养的细胞为卵巢细胞具有生殖细胞特性(实施例2的结果见图7；实施例3的结果见图11)。此外，在室温下将携带表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的靶基因tdrd7载体腺病毒(HBAD-tdrd7-EGFP)与黄喉拟水龟卵巢细胞(腺病毒：细胞培养基＝1:1000)孵育1h后，将感染的细胞接种到 25cm2的瓶中(NuncTM EasYFlaskTM，Thermo)，然后在28℃下培养。病毒感染后48-72h，在倒置荧光显微镜(Eclipse Ti2，尼康公司)下观察细胞并拍照。结果发现，黄喉拟水龟卵巢细胞能够成功感染外源基因(实施例2的结果见图8；实施例3的结果见图12)，因此，实施例2和3中黄喉拟水龟卵巢细胞分离及体外培养方法能够获得稳定传代生长的黄喉拟水龟卵巢细胞系，且此细胞系能够表达外源基因，为黄喉拟水龟生殖生理等机制的研究提供了体外研究平台。
对比例1
同实施例1，区别在于，步骤(3)中1L完全培养基成分为：杜氏伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)13.5g、HEPES粉末4.76g、非必需氨基酸(MEMNEAA)0.01mM、丙酮酸钠0.1mM、双抗penicillin/streptomycin(青霉素/ 链霉素)50μM、β-巯基乙醇100μM、亚硒酸钠1nM、胎牛血清150mL、生长因子5ng。
基础培养基中主要含有低分子营养物，在完全培养基中添加鱼血清和鸡血清，能提供维持黄喉拟水龟卵巢细胞指数生长的激素。此外，鱼血清和鸡血清同时也是黄喉拟水龟卵巢细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子的来源。对比例1的培养基中去掉鱼血清和鸡血清后，培养的黄喉拟水龟卵巢细胞生长缓慢，严重的会引起细胞死亡，无法达到传代要求(图13)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）黄喉拟水龟卵巢组织依次经胶原蛋白酶Ⅰ型和胰蛋白酶消化后，终止消化反应，之后分离得到消化后细胞；
（2）所述消化后细胞在完全培养基中经原代培养和传代培养得到所述黄喉拟水龟卵巢细胞；所述完全培养基包括以下成分：杜氏伊格尔培养基13.5-14g/L、HEPES粉末4.76g/L、非必需氨基酸0.01-0.02mM、丙酮酸钠0.1-0.2mM、双抗penicillin/streptomycin 50-100μM、β-巯基乙醇100-150μM、亚硒酸钠1-2nM、胎牛血清150-200mL/L、鱼血清2-4mL/L、鸡血清10-15mL/L和Peprotech生长因子5-10ng/L。
2.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述胶原蛋白酶Ⅰ型的工作浓度为1mg/mL。
3.根据权利要求2所述的分离培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述胶原蛋白酶Ⅰ型的消化时间为20min。
4.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述胰蛋白酶的质量百分含量为0.025-0.25%。
5.根据权利要求4所述的分离培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述胰蛋白酶的消化时间为5～20min。
6.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，利用胎牛血清终止消化反应。
7.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述完全培养基的pH为7.4～7.6。
8.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述原代培养和传代培养的培养温度为27～29℃。
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