CN114891726B - 一种人类全能样干细胞诱导培养基及其应用 - Google Patents

一种人类全能样干细胞诱导培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及发育生物学领域，尤其涉及一种人类全能样干细胞诱导培养基及其应用。本发明提供一种基础培养基，在该基础培养基的基础上添加特定种类及含量的组分，开发出人类植入前上胚层干细胞制备培养基和人类全能样干细胞诱导培养基；本发明的人类植入前上胚层干细胞制备培养基制备得到的人类植入前上胚层干细胞可实现单细胞传代，且能够稳定培养八十代以上而保持正常核型和分化潜能；人类全能样干细胞诱导培养基制备得到的人类全能样干细胞，不仅具有与人类八细胞胚胎非常相似的转录组特征，而且拥有同时分化形成人类囊胚中的内细胞群和滋养层细胞谱系的潜能，为人类早期胚胎发育研究、构建组织或细胞疾病模型及再生医学应用奠定了基础。

Description

一种人类全能样干细胞诱导培养基及其应用
技术领域
本发明涉及发育生物学领域，尤其涉及一种人类全能样干细胞诱导培养基及其应用。
背景技术
人类胚胎干细胞来源于人类囊胚中的内细胞群，但其特征却类似于植入后胚胎中的上胚层细胞的“始发态”(primed)，展示出比“原始态”(naive)的干细胞更加限制性的发育潜能，因此建立类似内细胞群的“原始态”的人类多能干细胞将为再生医学等领域提供巨大希望。
在过去几年的研究中，研究人员在建立和维持“原始态”人类多能干细胞方面取得了重要进展，如通过过表达多能性转录因子(例如NANOG和KLF2)和改变培养条件，获得了
Figure BDA0003705457210000011
5iLA等各种“原始态”人类多能干细胞，但这些细胞类型仍然存在很多需要克服的问题：1.基因编辑的效率限制及其引发的安全隐患；2.长期培养所面临的基因组不稳定及核型异常等问题；3.DNA去甲基化导致基因印记障碍；4.直接分化外、中、内三胚层的潜能和效率低下；5.细胞间异质性明显，导致其具有向某些谱系分化的不同倾向。上述问题表明，目前建立的“原始态”人类多能干细胞系与人类植入前上胚层细胞存在较大差异，并限制了它们的应用，因此仍需继续优化培养条件以建立更加稳定、高质量、且具有人类植入前上胚层特征的新型多能干细胞系。
另一方面，在“原始态”小鼠多能干细胞的培养过程中，可自发产生0.5-1％的小鼠二细胞胚胎样细胞(2CLC)亚群，该细胞具有全能性的特征，是一种比“原始态”多能干细胞更具发育潜能的细胞类型。而“原始态”小鼠多能干细胞的这种异质性，近期也开始在某些“原始态”人类多能干细胞系中得到证实，但由于人类全能性的鉴定尚无统一标准，且该细胞亚群比例极低，为后续分离培养带来很大困难，因此获得和维持培养高质量的人类八细胞胚胎样全能性细胞(8CLC)是一个亟待解决的挑战。该细胞无疑将成为理解人类早期胚胎发育调控规律的重要细胞模型，而且由于其更强的发育潜能，也必将具有强大的再生医学应用潜力。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人类全能样干细胞诱导培养基及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种基础培养基，所述基础培养基包括体积比为1：1的DMEM/F12和NeurobasalTM培养基；还包括以下浓度的组分：2mM L-谷氨酰胺、1X非必需氨基酸、1％N-2添加物、2％B-27TM添加物、50～100μg/ml L-抗坏血酸、50ng/ml Bovine Albumin Fraction V、10～20ng/ml IL-6、10～20ng/ml sIL-6Rα、0.1mMβ-巯基乙醇和0.1mg/ml抗生素。
研究表明，尽管建立和维持“原始态”人类多能干细胞方面取得了重要进展，但这些细胞类型仍然存在许多问题，如基因编辑的效率限制、基因组不稳定及核型异常、基因印记障碍、分化潜能低下，细胞异质性较大等。本发明通过对培养体系组分的种类及含量的选择，提供一种基础培养基，并根据该基础培养基制备出人类植入前上胚层干细胞制备培养基和人类全能样干细胞诱导培养基，并采用上述培养基制备人类植入前上胚层干细胞和人类全能样干细胞，为人类早期胚胎发育研究、构建组织或细胞的疾病模型以及再生医学应用奠定了基础。
本发明还提供一种人类植入前上胚层干细胞制备培养基，所述培养基包括人类胚胎干细胞维持培养基、人类植入前上胚层干细胞诱导培养基和人类植入前上胚层干细胞维持培养基；
所述人类胚胎干细胞维持培养基为Essential 8TM培养基；
所述人类植入前上胚层干细胞诱导培养基包括基础培养基和以下浓度的组分：5～10ng/ml BMP4，0.01～5μM EZH2抑制剂，0.05～0.50μM GSK1120212，0.1～1.0μMA419259，1～5μM XAV-939和0.05～2.00μM Go6983；
所述人类植入前上胚层干细胞维持培养基包括所述的基础培养基和以下浓度的组分：0～5ng/ml BMP4，0.05～0.50μM GSK1120212，1～5μM XAV-939和0.05～2μM Go6983。
DMEM/F12、NeurobasalTM培养基、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、N-2添加物、B-27TM添加物、Bovine Albumin Fraction V、β-巯基乙醇等为来自Thermo Fisher的商品化试剂；本发明的人类植入前上胚层干细胞诱导培养基中的EZH2抑制剂可选择DZNep、UNC1999、EPZ005687或GSK343等，其中选择DZNep时，其添加量为0.01～0.05μM；选择UNC1999时，添加量为0.1～2μM；选择EPZ005687时，添加量为0.1～5μM；选择GSK343时，添加量为0.1～2μM；GSK1120212是一种高效选择性MEK1/2抑制剂；XAV-939是一种Tankyrase抑制剂；Go6983是一种广谱的PKC抑制剂；BMP4是骨形成蛋白4；IL-6是白介素-6；sIL-6Rα是可溶性白介素-6受体α。
本申请发明人通过对组分种类及含量进行筛选，提供人类植入前上胚层干细胞制备培养基，该培养基为人类植入前上胚层干细胞的诱导及维持提供良好的培养环境，在短期内获得大量、纯度较高的人类植入前上胚层干细胞。
本发明还提供一种体外制备人类植入前上胚层干细胞的方法，采用所述的人类植入前上胚层干细胞制备培养基对人类胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞进行培养。
作为本发明所述的体外制备人类植入前上胚层干细胞的方法的优选实施方式，具体包括以下步骤：
S1：将人类胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞消化为单细胞，并接种于由基质胶和饲养层细胞包被的培养板中，采用所述人类胚胎干细胞维持培养基培养1～2天，使细胞形成100～200μm直径大小的克隆；
S2：弃去步骤S1的培养基，更换为所述的人类植入前上胚层干细胞诱导培养基培养细胞五天，隔天换液；
S3：将步骤S2的细胞进行传代，并更换为所述的人类植入前上胚层干细胞维持培养基培养细胞，隔天换液；
S4：步骤S3的细胞培养5～10天后呈现较大的突起克隆，将这些克隆消化为单细胞，并接种于由基质胶和饲养层细胞包被的培养板中，继续采用人类植入前上胚层干细胞维持培养基培养细胞，隔天换液，每四天传代一次，得所述人类植入前上胚层干细胞。
本发明所述的体外制备人类植入前上胚层干细胞的方法中采用的人胚胎干细胞由未经过体内发育的受精14天以内的人胚胎分离、建系得到，因此不存在伦理问题。本发明采用人类胚胎干细胞以单细胞传代的方式，通过直接更换培养基快速获得大量、高纯度的与人类植入前上胚层细胞相似的多能干细胞。
本发明还提供一种人类植入前上胚层干细胞，采用所述的体外制备人类植入前上胚层干细胞的方法制备得到。
本发明还提供一种人类全能样干细胞诱导培养基，所述培养基包括所述的人类植入前上胚层干细胞维持培养基和人类全能样干细胞培养基；
所述人类全能样干细胞培养基包括所述的基础培养基和以下浓度的组分：0～5ng/ml BMP4，0.1～0.5μM GSK1120212,1～5μM XAV-939,0.05～2.00μM Go6983,0.01～5μM EZH2抑制剂,0～200μM组蛋白去乙酰化酶抑制剂，0.1～1.0μM CBL0137,0.5～2.0μMAG14361,0.5～5.0μM GSK’872和0.1～2.0μM Ac-DEVD-CHO。
本发明的人类全能样干细胞培养基中的EZH2抑制剂可选择DZNep、UNC1999、EPZ005687或GSK343等，其中当选择DZNep时，其添加量为0.01～0.05μM；当选择UNC1999时，添加量为0.1～2μM；当选择EPZ005687时，添加量为0.1～5μM；当选择GSK343时，添加量为0.1～2μM；本发明的人类全能样干细胞培养基中的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可选择Sodiumbutyrate、TSA或VPA等，其中当选择Sodium butyrate时，其添加量为0～200μM；当选择TSA时，添加量为0～0.05μM；当选择VPA时，添加量为0～1μM；GSK1120212是一种高效选择性MEK1/2抑制剂；XAV-939是一种Tankyrase抑制剂；Go6983是一种广谱的PKC抑制剂；CBL0137是一种组蛋白分子伴侣FACT的抑制剂，可同时抑制NF-κB并激活p53；AG14361是一种PARP1抑制剂；GSK’872是一种特异的RIP3激酶抑制剂；Ac-DEVD-CHO是一种Group II caspases抑制剂。
本申请发明人通过对组分种类及含量进行筛选，提供一种人类全能样干细胞诱导培养基，该培养基能够提供将人类植入前上胚层干细胞或“原始态”人类多能干细胞诱导为人类全能样干细胞的微环境，有利于短期内获得与人类八细胞胚胎更相似的全能样干细胞，为探讨人类多能干细胞向全能性状态转变的调控机制提供了新的研究线索。
本发明还提供一种体外诱导人类植入前上胚层干细胞为人类全能样干细胞的方法，采用所述的人类全能样干细胞诱导培养基对人类植入前上胚层干细胞进行培养。
作为本发明所述体外诱导人类植入前上胚层干细胞为人类全能样干细胞的方法的优选实施方式，包括以下步骤：
S1：将人类植入前上胚层干细胞接种于由基质胶和饲养层细胞包被的培养板中，使用所述的人类植入前上胚层干细胞维持培养基培养24～48小时；
S2：弃去步骤S1的培养基，更换为所述的人类全能样干细胞培养基，隔天换液，细胞每四天传代一次，得所述人类全能样干细胞。
本发明的体外诱导人类植入前上胚层干细胞为人类全能样干细胞的方法，该方法制备得到的人类全能样干细胞不仅具有与人类八细胞胚胎高度相似的转录组特征，而且拥有同时分化形成人类囊胚的内细胞群和滋养层谱系的潜能，是一种全能样干细胞。本发明的体外诱导人类植入前上胚层干细胞为人类全能样干细胞的方法操作简单，成本低廉，为人类早期胚胎发育研究、构建组织或细胞的疾病模型以及再生医学应用奠定了基础。
本发明还提供一种人类全能样干细胞，采用所述的体外诱导人类植入前上胚层干细胞为人类全能样干细胞的方法制备得到。
本发明还提供所述人类植入前上胚层干细胞或所述人类全能样干细胞在构建组织或细胞疾病模型中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供一种基础培养基，并通过大量的实验筛选在该基础培养基的基础上添加特定种类及含量的组分，制备出人类植入前上胚层干细胞制备培养基和人类全能样干细胞诱导培养基，本发明的人类植入前上胚层干细胞制备培养基能够将人类胚胎干细胞诱导为人类植入前上胚层干细胞，该人类植入前上胚层干细胞可实现单细胞传代，且能够稳定维持培养80代以上并保持正常核型，还具有向外、中、内三胚层完全分化的潜能；本发明的人类全能样干细胞诱导培养基能够在短期内将人类植入前上胚层干细胞诱导为人类全能样干细胞，该人类全能样干细胞不仅在转录组水平与人类八细胞细胞胚胎更为相似，而且具有同时分化形成人类囊胚的内细胞群和滋养层谱系的能力，为人类早期胚胎发育研究、构建组织或细胞的疾病模型以及再生医学应用奠定了基础。
附图说明
图1为人类植入前上胚层干细胞(prEpiSC)的建系，其中A为人类植入前上胚层干细胞(prEpiSC)的诱导流程；B为人类植入前上胚层干细胞维持培养基中各组分在prEpiSC形态维持中的作用。
图2为人类植入前上胚层干细胞(prEpiSC)的鉴定，其中A为多能性相关基因在prEpiSC中的表达水平及其与人类囊胚中的植入前上胚层细胞以及“原始态”人类多能干细胞(HNES、t2iLGo)的比较；B为细胞免疫荧光检测多能性标记蛋白在prEpiSC中的表达；C为核型分析结果，显示传代80次后的prEpiSC仍保持正常核型；D为RT-qPCR结果，显示由prEpiSC分化而来的细胞表达外、中、内三个胚层的标记基因；E为细胞免疫荧光结果，显示由prEpiSC分化而来的细胞表达外、中、内三个胚层的标记蛋白。
图3为人类植入前上胚层干细胞(prEpiSC)与植入前上胚层及其他类型多能干细胞的转录组比较，其中A为主成分分析结果，显示prEpiSC与人类植入前上胚层聚在一起，表明它们具有相似的转录组特征；B为主成分分析结果，显示prEpiSC与人类受精后第6天(D6)胚胎中的上胚层细胞的转录组最相似。
图4为人类全能样干细胞(ci8CLC)的诱导，其中A为利用人类八细胞特异性报告基因系统(8C::mCherry)筛选小分子化合物，鉴定出可有效将prEpiSC转变成ci8CLC的小分子化合物；B为ci8CLC的典型形态；C为RT-qPCR结果，显示人类八细胞胚胎特异性基因在ci8CLC高表达，ST，短期培养；LT，长期培养；D为Western blot结果，显示人类八细胞胚胎特异性转录因子LEUTX只在ci8CLC中表达。
图5为人类全能样干细胞(ci8CLC)的转录组分析，其中A为ci8CLC与prEpiSC差异表达基因分析结果，显示人类八细胞胚胎特异性基因高表达于ci8CLC；B为基因集合富集分析结果，显示人类八细胞胚胎特异性基因显著富集于ci8CLC；C为ci8CLC与prEpiSC差异表达转座子分析结果，显示人类八细胞胚胎特异性反转录转座子高表达于ci8CLC；D为主成分分析结果，显示ci8CLC的转录组与人类八细胞胚胎(8C)更相似。
图6为由人类全能样干细胞(ci8CLC)发育而形成的类囊胚，其中A为将20-25个ci8CLC注射至小鼠空透明带中并在类囊胚培养基中培养五天后，ci8CLC自行发育而形成囊胚样结构；B为ci8CLC在形成类囊胚过程中经历了细胞紧密化(ZO-1标记)和极化(PKCα标记)等人类早期胚胎发育中的关键生物学事件；C为ci8CLC在形成类囊胚过程中可暂时形成的桑椹胚样结构，表现为内外两种细胞群体；D为由ci8CLC形成的典型类囊胚，具有内细胞群(OCT4标记)和滋养层(GATA3标记)；E～H为ci8CLC发育的类囊胚在hESC维持培养基中培养而形成的人类胚胎干细胞克隆，这些人类胚胎干细胞表达多能性基因、且具有向外、中、内三个胚层分化的潜能；I～K为ci8CLC发育的类囊胚在人类滋养层干细胞培养基中培养而形成的滋养层干细胞克隆，这些滋养层干细胞表达滋养层标记基因。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1体外诱导人类胚胎干细胞为人类植入前上胚层干细胞
1、本实施例提供一种人类植入前上胚层干细胞制备培养基，所述培养基的配方如表1所示。
表1
Figure BDA0003705457210000081
2、采用上述人类植入前上胚层干细胞制备培养基体外诱导人类胚胎干细胞为人类植入前上胚层干细胞(prEpiSC)的方法，具体包括以下步骤：
S1：将人类胚胎干细胞消化为单细胞，以该单细胞做为种子细胞接入基质胶和饲养层细胞包被的培养板中，在Essential 8TM培养基中培养24～48小时，确保克隆长至100～200μm直径大小；
S2：弃去步骤S1的培养基，更换为人类植入前上胚层干细胞诱导培养基培养细胞五天；
S3：将步骤S2的细胞传代并更换为人类植入前上胚层干细胞维持培养基培养细胞，并隔天换液；
S4：步骤S3的细胞在培养5-10天后呈现较大的突起克隆，将这些克隆消化为单细胞，并接种于由基质胶和饲养层细胞包被的培养板中，继续采用人类植入前上胚层干细胞维持培养基培养细胞，隔天换液，每四天传代一次。
S5：将步骤S4的人类植入前上胚层干细胞用荧光蛋白GFP进行标记。
3、人类植入前上胚层干细胞(prEpiSC)的细胞身份鉴定
本实施例对采用上述方法诱导得到的人类植入前上胚层干细胞进行细胞身份鉴定，具体实验步骤如下：
S1：于37℃下，使用Accutase消化液处理上述诱导并传代10次后的人类植入前上胚层干细胞，消化三分钟；
S2：在步骤S1中加入1.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)，并将细胞轻轻吹打下来，转移至15ml离心管中，300g离心五分钟。
S3：弃上清，加入含0.1％Bovine Albumin Fraction V的PBS重悬细胞沉淀，并使用40μm滤网进行过滤，样品收集于流式管中。
S4：使用流式细胞分选仪实现GFP阳性细胞的富集。
S5：将富集的细胞300g离心五分钟，弃上清，收集细胞沉淀以用于RNA抽提。
S6：利用步骤S5的RNA进行RT-qPCR，鉴定多能性相关基因的表达水平；RT-qPCR的步骤参照RNA提取和逆转录试剂盒的制造商说明书指示完成。
S7：利用步骤S5中的RNA进行RNA-seq文库制备，使用Illumina Hiseq平台进行测序，最后分析人类植入前上胚层干细胞的转录组特征。
S8：使用细胞免疫荧光方法对prEpiSC进行染色。首先使用4％多聚甲醛固定人类植入前上胚层干细胞约15分钟，PBS清洗三次，每次五分钟；然后使用0.1％Triton X-100室温破膜30分钟，用PBS清洗三次，每次五分钟；使用3％山羊血清和0.1％Triton X-100进行室温封闭一小时；再加入一抗(兔抗OCT4抗体使用1：200稀释，山羊抗NANOG抗体使用1：100稀释，山羊抗TFCP2L1抗体使用1：100稀释，鼠抗SSEA4抗体使用1：50稀释，鼠抗TRA-1-60抗体使用1：50稀释)，于4℃孵育过夜；第二天使用PBST洗涤细胞三次，每次五分钟；再加入荧光二抗室温避光孵育一小时，随后使用PBST洗涤三次，每次五分钟；最后使用DAPI染料进行核染色，封片，使用Nikon C2进行拍摄。
实验结果如图1-3所示。由图1A可知，诱导10天以上的prEpiSC呈现突起的小克隆，与呈扁平状的人类胚胎干细胞具有明显不同的形态；由图2A和2B可知，prEpiSC表达多个多能性相关基因；由图2C可知，传代80次后的prEpiSC仍保持正常核型；由图2D和2E可知，prEpiSC具有向外、中、内三胚层分化的潜能；由图3A和3B可知，prEpiSC的转录组图谱与人类植入前上胚层高度相似。
实施例2体外诱导人类植入前上胚层干细胞为人类全能样干细胞(ci8CLC)
1、本实施例提供一种人类全能样干细胞(ci8CLC)诱导培养基，所述培养基的配方如表2所示。
表2
Figure BDA0003705457210000101
Figure BDA0003705457210000111
2、本实施例采用上述人类全能样干细胞(ci8CLC)诱导培养基体外诱导人类植入前上胚层干细胞(prEpiSC)为人类全能样干细胞(ci8CLC)的方法，具体包括以下步骤：
S1：将prEpiSC接种在由基质胶和饲养层细胞包被的培养板中，使用人类植入前上胚层干细胞(prEpiSC)维持培养基培养24-48小时；
S2：弃去步骤S1的培养基，更换为人类全能样干细胞培养基，隔天换液，每四天传代一次，得所述的人类全能样干细胞。
3、人类全能样干细胞(ci8CLC)的细胞身份鉴定
(1)对采用上述方法诱导得到的人类全能样干细胞(ci8CLC)的基因表达水平进行检测，具体实验步骤如下：
S1：消化并收集采用上述方法制备的人类全能样干细胞(ci8CLC)。
S2：利用商业化的RNA抽提试剂盒，从步骤S1的细胞中抽提RNA。
S3：利用步骤S2的RNA进行RT-qPCR，分析人类八细胞胚胎特异性基因在ci8CLC中的表达水平；
RT-qPCR的步骤参照RNA提取和逆转录试剂盒的制造商说明书指示完成。
S4：利用步骤S2中的RNA进行RNA-seq文库制备，使用Illumina Hiseq平台进行测序，最后分析ci8CLC的转录组特征。
S5：将步骤S1消化收集的细胞进行蛋白水平验证，首先按照RIPA：蛋白酶抑制剂：PMSF＝98：1：1的方式配置蛋白裂解液；使用上述裂解液进行细胞裂解，冰上放置30分钟后15000g，4℃离心30分钟；取上清，根据BCA蛋白定量法进行蛋白定量并取合适体积的蛋白样品进行加热变性；然后使用SDS-PAGE胶进行电泳并转膜；使用5％脱脂奶粉对膜进行室温封闭一小时；将一抗与封闭后的膜进行孵育(LEUTX和β-actin抗体均按照1：1000稀释)，4℃过夜；第二天使用TBST洗涤膜三次，每次十分钟；加入二抗，室温孵育膜一小时；使用TBST洗涤膜三次，每次十分钟；最后进行条带曝光。
实验结果如图4和5所示。由图4C可知，ci8CLC高表达众多人类八细胞胚胎特异性基因；由图4D可知，ci8CLC表达人类八细胞胚胎特异性转录因子LEUTX；由图5A-D可知，其转录组图谱与人类八细胞胚胎高度相似。
(2)对采用上述方法诱导得到的人类全能样干细胞(ci8CLC)的功能进行验证，具体实验步骤如下：
S1：将20-25个ci8CLC注射入小鼠空的透明带中；
S2：使用类囊胚诱导培养基培养步骤S1的细胞，培养五天；
S3：使用免疫荧光的方式对步骤S2的细胞集落和类囊胚进行染色，首先使用4％多聚甲醛固定类囊胚约15分钟，PBS清洗三次，每次五分钟；
S4：使用0.1％Triton X-100室温破膜30分钟，用PBS清洗三次，每次五分钟；
S5：使用3％山羊血清和0.1％Triton X-100进行室温封闭一小时；
S6：加入一抗(兔抗GATA3抗体使用1：200稀释；鼠抗OCT4抗体使用1：100稀释)，于4℃孵育过夜；
S7：使用PBST洗涤三次，每次五分钟；
S8：加入荧光二抗室温避光孵育一小时；
S9：使用PBST洗涤三次，每次五分钟；
S10：使用DAPI染料进行核染色，随后封片，使用Nikon C2进行拍摄。
实验结果如图6所示。由图6A-D可知，ci8CLC具有自行发育而形成囊胚样结构的潜能，比较忠实地反映了人类植入前胚胎发育过程；且由图6E-K可知，由ci8CLC形成的类囊胚可在体外建系成为胚胎干细胞和滋养层干细胞，这些干细胞可继续分化形成各个胚层细胞类型。综上所述，ci8CLC是一种全能样干细胞。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种人类植入前上胚层干细胞制备培养基，其特征在于，所述培养基包括人类胚胎干细胞维持培养基、人类植入前上胚层干细胞诱导培养基和人类植入前上胚层干细胞维持培养基；
所述人类胚胎干细胞维持培养基为Essential 8培养基；
所述人类植入前上胚层干细胞诱导培养基包括基础培养基和以下浓度的组分：5~10ng/ml BMP4，0.01~5 μM EZH2抑制剂，0.05~0.50 μM GSK1120212，0.1~1.0 μM A419259，1~5 μM XAV-939和0.05~2.00 μM Go6983；
所述人类植入前上胚层干细胞维持培养基包括基础培养基和以下浓度的组分：0~5ng/ml BMP4，0.05~0.50 μM GSK1120212，1~5 μM XAV-939和0.05~2.00 μM Go6983；
所述基础培养基包括体积比为1：1的DMEM/F12和Neurobasal培养基；还包括以下浓度的组分：2 mM L-谷氨酰胺、1X 非必需氨基酸、1% N-2添加物、2% B-27添加物、50~100 μg/ml L-抗坏血酸、50 ng/ml Bovine Albumin Fraction V、10~20 ng/ml IL-6、10~20 ng/mlsIL-6R α、0.1 mM β-巯基乙醇和0.1 mg/ml抗生素。
2.一种体外制备人类植入前上胚层干细胞的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的人类植入前上胚层干细胞制备培养基对人类胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞进行培养。
3.根据权利要求2所述的体外制备人类植入前上胚层干细胞的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1：将人类胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞消化为单细胞，并接种于由基质胶和饲养层细胞包被的培养板中，采用权利要求1所述的人类胚胎干细胞维持培养基培养1~2天，使细胞形成100~200 μm直径大小的克隆；
S2：弃去步骤S1的培养基，更换为权利要求1所述的人类植入前上胚层干细胞诱导培养基，隔天换液，培养细胞五天；
S3：将步骤S2的细胞进行传代，并更换为权利要求1所述的人类植入前上胚层干细胞维持培养基培养细胞，隔天换液；
S4：步骤S3的细胞培养5~10天后呈现较大的突起克隆，将这些克隆消化为单细胞，并接种于由基质胶和饲养层细胞包被的培养板中，继续采用人类植入前上胚层干细胞维持培养基培养细胞，隔天换液，每四天传代一次，得所述人类植入前上胚层干细胞。
4.一种人类全能样干细胞诱导培养基，其特征在于，所述培养基包括权利要求1所述的人类植入前上胚层干细胞维持培养基和人类全能样干细胞培养基；
所述人类全能样干细胞培养基包括基础培养基和以下浓度的组分：0.1~0.5 μMGSK1120212, 1~5 μM XAV-939, 0.05~2.00 μM Go6983, 0.01~5.00 μM EZH2抑制剂, 0~200 μM组蛋白去乙酰化酶抑制剂, 0.1~1.0 μM CBL0137, 0.5~2.0 μM AG14361, 0.5~5.0μM GSK’872和0.1~2.0 μM Ac-DEVD-CHO；所述基础培养基包括体积比为1：1的DMEM/F12和Neurobasal培养基；还包括以下浓度的组分：2 mM L-谷氨酰胺、1X 非必需氨基酸、1% N-2添加物、2% B-27添加物、50~100 μg/ml L-抗坏血酸、50 ng/ml Bovine Albumin FractionV、10~20 ng/ml IL-6、10~20 ng/ml sIL-6R α、0.1 mM β-巯基乙醇和0.1 mg/ml抗生素。
5.一种体外诱导人类植入前上胚层干细胞为人类全能样干细胞的方法，其特征在于，采用权利要求4所述的人类全能样干细胞诱导培养基对人类植入前上胚层干细胞进行培养。
6.根据权利要求5所述的体外诱导人类植入前上胚层干细胞为人类全能样干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将人类植入前上胚层干细胞接种于由基质胶和饲养层细胞包被的培养板中，使用权利要求1所述的人类植入前上胚层干细胞维持培养基培养24~48小时；
S2：弃去步骤S1的培养基，更换为权利要求4所述的人类全能样干细胞培养基，隔天换液，细胞每四天传代一次，得所述人类全能样干细胞。
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