CN114591915B

CN114591915B - 一种大黄鱼体外诱导多能性干细胞的方法

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Publication number: CN114591915B
Application number: CN202210192217.1A
Authority: CN
Inventors: 姜永华; 钟照威; 王艺磊; 张子平; 黄文树; 冯燕
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2022-02-28
Filing date: 2022-02-28
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2042-02-28
Also published as: CN114591915A

Abstract

本发明公开了一种大黄鱼体外诱导多能性干细胞的方法。包括分别构建含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28a的重组质粒，将所得重组质粒转染分离的大黄鱼体细胞培养得到大黄鱼多能性干细胞。转染效率高，诱导形成的多能性干细胞(iPSCs)高效稳定。

Description

一种大黄鱼体外诱导多能性干细胞的方法

技术领域

本发明涉及大黄鱼基因编程领域，尤其涉及一种大黄鱼体外诱导多能性干细胞的方法。

背景技术

大黄鱼(Larimichthys crocea)素有中国“国鱼”之称，肉质鲜美，营养丰富，经济价值高，是我国近海特有和养殖产量最高的海水经济鱼类，为中国传统“四大海产”(大黄鱼、小黄鱼、带鱼、乌贼)之一，也是我国八大优势出口养殖水产品之一。我国大黄鱼养殖主产区为福建、浙江和广东。大黄鱼的分布：南起南海，北至东海中部以南，主要在温暖的南方海域。2019年全国大黄鱼总产量225945吨，其中福建产量186514吨，占比82.7％；浙江产量23932吨，占比10.6％；广东产量15103吨，占比6.7％。然而，现阶段伴随工业化发展，近海养殖环境进一步恶化；大黄鱼病害频发；大黄鱼亲鱼资源枯竭，种质退化等因素极大的限制了大黄鱼养殖的进一步发展，因此对大黄鱼病害防治、良种选育、遗传背景的研究极为迫切。

干细胞(stem cell)是具有自我复制能力的多潜能性细胞，是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种细胞的潜在功能。干细胞根据所处的发育阶段可以分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和成体干细胞(somatic stem cell)，干细胞根据其发育潜能可分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多能干细胞(pluripotent stemcell，PSC)和专能干细胞(unipotent stem cell)。

诱导性多能性干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)是通过基因转染技术(gene transfection)将某些转录因子导入体细胞，使体细胞重新编程直接重构成为类似于胚胎干细胞样的多潜能细胞。与ESCs相比，iPSCs具有与ESCs相似的分化能力，但具有涉及的伦理问题少、来源广泛、不受繁殖习性限制、免疫排斥弱、并可结合基因修饰技术更正遗传缺陷等优势，具有更广阔的应用前景。

2006年，Yamanaka团队预测并筛选出24种在维持胚胎干细胞的状态与活性有重要作用的转录因子，利用逆转录病毒介导的转染体系重编程小鼠成纤维细胞，首次获得小鼠IPSCs。同时将它们排列组合导入小鼠体细胞中，最终确定仅利用4种转录因子组合(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，OSKM)便可将成纤维细胞重编程为iPSCs，因此这四种因子被称为“Yamanaka”因子。2007年11月Yamanaka团队利用OSKM四种转录因子成功诱导人的体皮肤成纤维细胞重编程为iPSCs，2007年12月Thomson团队利用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28(OSNL)四种转录因子成功诱导人体细胞重编程为iPSCs，该四种因子被称为“Thomson”因子。这为iPSCs的研究奠定了坚实的基础，且越来越多的研究者们参与到iPSCs的探索当中。

细胞重编程和iPSCs的建立能够作为分析细胞分析调控的有效手段之一，为细胞命运控制的分子机制提供一个更加高效的模型。iPSCs技术的发展能够促进细胞的改造，如分析分化细胞的表观基因组，转录组和代谢组等。iPSCs的技术方法不仅能够促进了干细胞的发展和再生医学的研究，也为药物的筛选与研发提供了更加可靠的生物模型。特定的iPSCs在生物医学研究中有着广阔的应用前景，充分利用这些细胞可以更加有效地用于研究许多疾病治疗的分子机制。建立鱼类iPSCs诱导技术能为鱼类病毒分离、抗病毒机制、疫苗研发、转基因技术、嵌合体组织工程等研究提供极大的便捷，且设施人力等资源要求相对活体实验低，重复性好，研究周期短。iPSCs为开展鱼类毒理、病理、遗传分析等研究提供了一个重要的体外模型，在一定程度上克服上述问题。

目前，基因转染技术是转基因技术的关键步骤，对转基因能否成功起到重要的决定作用，已在大量转基因动物包括鱼类中广泛应用(杨学明等，2006)。其中，转染方法常用脂质体转染法(周雪艳等，2004；叶寒青，2006)，报告基因常用水母绿色荧光蛋白基因(GFP)(窦立萍等，2008)。而脂质体转染在鱼类细胞系的转染效率低，例如在长江鲟的鳍条细胞系(YSCF)的转染效率仅有10-15％(Liu et al.,2020)；中华鲟的鳍条细胞系(CSTF)的转染效率仅有2％(Zhu et al.,2013)，团头鲂的鳍条细胞系(MAF)的转染效率仅有5％(Zhou etal.,2008)，有关报道称一个新建立的斑马鱼胚胎细胞系的脂质体转染效率也可达到40％(Jin et al.,2017)，而转染效率低也是制约鱼类诱导多能性干细胞的主要发展因素。关于iPSCs诱导技术在哺乳动物已经较为成熟(Nakagawa,et al.,2008；Saric and Hescheler,2008；Takahashi,et al.,2007；Takahashi and Yamanaka,2006；Yu,et al.,2007；Zeng,etal.,2018)，关于鱼类iPSCs研究，至今仅在斑马鱼中有成功案例，是通过慢病毒传递系统将成体斑马鱼的成纤维细胞诱导重编程为iPSCs(Peng,et al.,2019)。但关于大黄鱼iPSCs体外诱导的技术体系方法未见报道，严重制约了大黄鱼诱导多能性干细胞的研究及应用。因此构建大黄鱼iPSCs体外诱导的技术体系方法是大黄鱼发育生物学研究以及建立大黄鱼育种新技术的迫切需求。

发明内容

本发明的目的在于克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种大黄鱼体外诱导多能性干细胞(iPSCs)的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种大黄鱼体外诱导多能性干细胞的方法，所述方法包括：

分别构建含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28a的重组质粒，将所得重组质粒转染分离的大黄鱼体细胞培养得到大黄鱼多能性干细胞。

进一步，所述大黄鱼体细胞为大黄鱼肌肉细胞。

进一步，所述含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28a的重组质粒中的载体骨架为pEGFP-N1质粒。

进一步，所述转染是将体细胞的细胞培养基更换成不含双抗的细胞培养基继续培养过夜收集细胞后，用无血清培养基重悬收集的细胞，再加入含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28a的重组质粒；充分混匀后静置3min，进行电转；电转程序的击穿电压为150V，重复2次。

进一步，所述含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28a的重组质粒等体积混合后再转染。

本发明构建多种多能性因子过表达质粒，采用电转染方法对大黄鱼肌肉组织细胞系(LYCMs)进行重编程来获得iPSCs。

具体流程图如图1。本发明将采用电转染法将多种多能性因子的不同组合导入大黄鱼的肌肉细胞(LYCMs)然后进行重编程，获得其iPSCs，并进行连续继代培养，最终建立稳定的大黄鱼iPSCs，为解析大黄鱼生殖细胞分化机制、性别控制及遗传育种等研究提供新的策略模式和研究模型。

本发明的构建方法所使用的重编程培养基：以L-15培养液为基础培养液，胎牛血清、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人碱性成纤维生长因子(Human FGF-basic)、人上皮细胞生长因子(Human EGF)、人肝细胞生长因子(Human HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、白血病抑制因子(LIF)、青霉素、链霉素、大黄鱼鱼血清与大黄鱼胚胎提取物(LYC-EE)。L-15培养液和胎牛血清FBS为细胞生长提供了充足的营养；β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人FGF-basic、人EGF、人HGF和IGF的加入可以刺激细胞活性、加速细胞分裂增殖，同时为细胞体外培养提供了良好的缓冲环境，能够使细胞在长期培养时维持稳定的pH；鱼血清与鱼胚提取物有助于提高鱼细胞培养中细胞的有丝分裂活性，可能是目前培养基中的关键添加剂之一；LIF的加入能有效抑制iPSCs的分化，促进细胞增殖。

本发明所构建的6种多能性因子的过表达质粒可以进行转染LYCMs并稳定表达。

本发明使用电转染法进行大黄鱼体细胞(LYCMs)重编程实验，转染效率高，更高效稳定形成诱导多能性干细胞(iPSCs)。

本发明的大黄鱼诱导多能性干细胞(iPSCs)的构建方法重复性强、所培养的iPSCs稳定性好。

本发明的大黄鱼iPSCs的细胞性状优良。碱性磷酸酶(AP)活性强，分裂旺盛，传代时间短；染色体核型分析稳定，免疫荧光染色法及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)能够检测到多种干细胞标记基因(Nanog、Oct4、Sox2)。

本发明的大黄鱼iPSCs经过转录组测序分析，获得了相关差异基因的表达谱，及相关信号通路，为解析大黄鱼iPSCs的体外诱导奠定基础，为大黄鱼生殖细胞分化机制、性别控制及遗传育种等研究提供新的策略模式和研究模型。

附图说明

图1是本发明技术方案的具体流程图。

图2是通过转录组测序分析大黄鱼诱导多能性干细胞与大黄鱼体细胞(LYCMs)差异基因的表达谱分析具体分析流程图。

图3是重组产物PCR鉴定图。其中1-1～1-3、2-1～2-3、3-1～3-3、4-1～4-3、5-1～5-3、6-1～6-3分别为Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Lin28、Nanog过表达质粒的PCR鉴定结果，M#：Marker#2501(条带分别为2000，1000,750,500,250,100bp)。

图4是多能性因子的过表达质粒图谱。

图5是不同电转程序下绿色荧光蛋白的表达情况图。其中A～D分别为LYCMs在电转程序4、3、2、1细胞状态；a～d分别为LYCMs在电转程序4、3、2、1绿色荧光蛋白的表达情况。

图6是LYCMs细胞电转了OSKM后，细胞形态、数量及相关基因的表达量变化图。其中A、B分别为LYCMs过表达Egfp、OSKM后的细胞状态；a、b分别为LYCMs过表达Egfp、OSKM后绿色荧光蛋白的表达情况；C为LYCMs过表达OSKM后细胞的生长曲线；D为LYCMs过表达OSKM后相关基因的表达量变化。

图7是LYCMs细胞电转了OSNL后，细胞形态、数量及相关基因的表达量变化图。其中A、B分别为LYCMs过表达Egfp、OSKM后的细胞状态；a、b分别为LYCMs过表达Egfp、OSNL后绿色荧光蛋白的表达情况；C为LYCMs过表达OSNL后细胞的生长曲线；D为LYCMs过表达OSNL后相关基因的表达量变化。

图8是LYCMs细胞电转了OSKMNL后，细胞形态、数量及相关基因的表达量变化图。其中A、B分别为LYCMs过表达Egfp、OSKMNL后的细胞状态；a、b分别为LYCMs过表达Egfp、OSKMNL后绿色荧光蛋白的表达情况；C为LYCMs过表达OSKMNL后细胞的生长曲线；D为LYCMs过表达OSKMNL后相关基因的表达量变化。

图9是大黄鱼iPSCs的形成过程图。其中A～C分别为LYCMs电转染OSNL后第5天、第7天、第10天细胞克隆的形成过程及形态。

图10是不同培养基下大黄鱼iPSCs的生长曲线图。其中A～C分别为Lc-iPSCs在重编程培养液Ⅰ、重编程培养液Ⅲ、重编程培养液Ⅱ培养下细胞生长曲线。其中左纵坐标轴为相同条件下正常细胞的数量，右纵坐标轴为Lc-iPSCs的数量。

图11是大黄鱼iPSCs碱性磷酸酶染色图。其中A为形成中的iPSCs碱性磷酸酶染色图，B为已经形成的iPSCs碱性磷酸酶染色图。

图12是大黄鱼iPSCs染色体核型分析图。其中A、B均为iPSCs染色体分裂相图片，C为iPSCs染色体核型数目分布情况统计图(表)。

图13是大黄鱼iPSCs传代培养图。其中A-B分别为机械法传代培养第2天、第5天细胞克隆形态及扩增情况；C-D分别为酶消化法传代培养第2天、第5天细胞克隆形态及扩增情况。

图14是免疫荧光染色检测图。其中A，A-1，A-2分别为Lc-iPSCs细胞克隆DAPI染色结果、Nanog蛋白表达情况、DAPI阳性信号及Nanog蛋白阳性信号叠加效果；B，B-1，B-2分别为Lc-iPSCs细胞克隆DAPI染色结果、Oct4蛋白表达情况、DAPI阳性信号及Oct4蛋白阳性信号叠加效果；C，C-1，C-2分别为Lc-iPSCs细胞克隆DAPI染色结果、Sox2蛋白表达情况、DAPI阳性信号及Sox2蛋白阳性信号叠加效果。

图15是细胞荧光原位杂交检测图。其中A，A-1，A-2分别为Lc-iPSCs细胞克隆DAPI染色结果、Oct4转录本表达情况、DAPI阳性信号及Oct4阳性信号叠加效果；B，B-1，B-2分别为Lc-iPSCs细胞克隆DAPI染色结果、Sox2转录本表达情况、DAPI阳性信号及Sox2阳性信号叠加效果。

图16是各个样本的基因表达量的整体的分布情况及主成分分析图。其中A为各个样本的基因表达量的整体的分布情况，B为各个样本的基因表达量的主成分分析图。

图17是各组间差异基因的分布情况及数量图。其中A为OSNL-iPSCs与LYCMs的差异基因分布情况图，B为OSKMNL-iPSCs与LYCMs的差异基因分布情况图，C为OSKMNL-iPSCs与OSNL-iPSCs的差异基因分布情况图，D为三组间差异基因的数量图。

图18是OSNL-iPSCs与LYCMs的显著差异表达基因的GO词条注释图。

图19是为OSKMNL-iPSCs与LYCMs的显著差异表达基因的GO词条注释图。

图20是OSKMNL-iPSCs与OSNL-iPSCs的显著差异表达基因的GO词条注释图。

图21是KEGG通路富集分析dot-plot气泡图。其中A为OSNL-iPSCs与LYCMs的KEGG通路富集分析dot-plot气泡图，B为OSKMNL-iPSCs与LYCMs的KEGG通路富集分析dot-plot气泡图，C为OSKMNL-iPSCs与OSNL-iPSCs的KEGG通路富集分析dot-plot气泡图。

图22是RNA-Seq结果与qRT-PCR验证结果比较图。其中横坐标为有效基因，纵坐标为OSNL-iPSCs vs LYCMs(A)，OSKMNL-iPSCs vs LYCMs(B)，OSKMNL-iPSCs vs OSNL-iPSCs(C)的log2比值；D：qRT-PCR检测，相关基因在每组间的各个样本的相对表达量分组聚类热图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例中的培养基为：

完全培养液：以L-15培养液为基础培养液，胎牛血清、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人碱性成纤维生长因子(Human FGF-basic)、人上皮细胞生长因子(Human EGF)、人肝细胞生长因子(Human HGF)、青霉素、链霉素、大黄鱼鱼血清与大黄鱼胚胎提取物(TEE)的添加量分别为15vol％～20vol％、0.5vol‰、50μg/mL、50μg/mL、10μg/L、5μg/L、1μg/L、100IU/mL、100μg/mL、1vol％和1vol％。

重编程培养基：以L-15培养液为基础培养液，胎牛血清、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人碱性成纤维生长因子(Human FGF-basic)、人上皮细胞生长因子(Human EGF)、人肝细胞生长因子(Human HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、白血病抑制因子(LIF)、青霉素、链霉素、大黄鱼鱼血清与大黄鱼胚胎提取物(TEE)的添加量分别为15vol％、0.5vol‰、50μg/mL、50μg/mL、10μg/L、5μg/L、1μg/L、10μg/mL、50μg/mL、100IU/mL、100μg/mL、1vol％和1vol％。

鱼血清的制备方法：用15％(w/v)EDTA浸润10mL注射器，从双斑东方鲀成鱼的尾静脉取血到15mL的置于冰上的离心管中。3,500g离心15min，转移上清液到50mL离心管中，4℃孵育过夜，3,500g再离心30min，上清液用0.2μm过滤器过滤除菌，每10mL一管分装储存于15mL离心管中，-20℃储存。

鱼胚提取物(LYC-EE)的制备方法：至少收集2000个发育至第7天(30hpf或受精后孵化前)的健康大黄鱼胚胎，用1×PBS清洗3次，-20℃保存备用。取500个胚胎，在玻璃匀浆器中用冷的1×PBS在冰上匀浆，将匀浆液转移到15mL离心管中。在液氮—37℃水浴反复冻结—融解3次后，将匀浆液进行4℃、3,500g离心30min。转移上清液至新的1.5mL离心管中，18,000g、4℃离心至少30min以保证匀浆液分为3层：最上层是脂质层，最底层是碎片，中间层是大黄鱼胚胎提取物(LYC-EE)，清晰且呈绿色。收集TEE到15mL离心管中，尽可能减少脂质污染。如果分层不清晰，重复离心分层步骤以获取最佳的分层效果和LYC-EE产量。LYC-EE用0.2μm过滤器过滤除菌，并用1×PBS调整体积到1mL含400个胚胎(即2.5μL/胚胎)。然后每1mL分装到一个1.5mL离心管中，-20℃储存。

OptI MEM I无血清培养基(Gibco，LOT：2276989，美国)。

以下实施例可以结合图1和图2的流程图来理解。

实施例1：大黄鱼6种多能性因子重组表达载体的构建与鉴定

合成表1中的各引物序列。插入片段分别为Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog和Lin28a六个转录因子去除了终止密码子的片段。Oct4、Sox2、Klf4、cMYc、Nanog及Lin28a基因全长cDNA序列GenBank数据库的登录号分别为：KJ588781、KJ588783.1、KJ588781、KJ588782.1、XM_010741618、XM_019267953。具体设计方式如下：

插入片段正向扩增引物设计方式为：

5’--上游载体末端同源序列+酶切位点(Kpnl)序列+基因特异正向扩增引物序列--3’

5’--下游载体末端同源序列+酶切位点(BamHI)序列+基因特异反向扩增引物序列--3’。

表1用于质粒构建的引物列表(5'→3')

注：加框碱基为酶切位点，下划线为保护碱基。

2)插入片段PCR扩增

使用KOD One^TM PCR Master Mix-Blue-(Code No.KMM-201S,KMM-201)高保真酶进行PCR扩增，以确保扩增片段无突变。每个片段的扩增均用以下体系和程序。具体体系如表2：

表2扩增体系表

PCR扩增条件如表3：表3PCR扩增条件表

3)线性化载体制备：

将购买的pEGFP-N1质粒使用KpnⅠ和BamHI两种限制性内切酶进行双酶切，于0.2mLPCR中，加入如下组分配置50μL体系，见下表4:表4双酶切体系表

pEGFP-N1质粒(0.2μg/μL)	5μL
		KpnⅠ	1μL
BamHI	1μL
		NEB buffer2.1	5μL
ddH₂O	Up to 50μL

上述酶切体系于37℃酶切3h后进行琼脂凝胶电泳检测，分离酶切后的片段，割胶回收并纯化目的片段，得到线性化载体；使用微量紫外分光光度计检测浓度，-20℃保存；

4)重组反应

ClonExpressⅡ重组反应体系最适载体使用量为0.03pmol，最适插入片段使用量为0.06pmol(载体与插入片段摩尔比为1：2)。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

最适克隆载体使用量＝[0.02*克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)；

最适插入片段使用量＝[0.04*插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)。

根据公式计算重组反应所需DNA量，为了确保加样的准确性，在配制重组反应体系前可将线性化载体与插入片段做适当稀释，各组分加样量不低于1μL。

于冰上配制以下表5的反应体系：表5：反应体系表

组分	体积
		线性化载体	XμL
插入片段	YμL
		5×CEⅡBuffer	4μL
ExnaseⅡ	2μL
		ddH2O	to 20μL

注:六个片段分别进行。

使用移液器轻轻吸打均匀(请勿振荡混匀)，短暂离心将反应将反应液收集管底。于PCR仪中37℃反应30min，立即置于冰上冷却。

5)重组产物转化

在冰上解冻克隆感受态细胞(DH5αCompetent Cell，Vazyme#C502)；取10μL上述所得重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀(勿振荡混匀)，冰上静置30min；42℃金属浴热激45S后，立即置于冰上冷却2-3；加入900μLSOC培养基，37℃摇菌1h(200-250rpm)；将含卡那霉素(Kana+)的LB固体培养基平板在37℃培养箱预热；3,000rpm离心5min，弃900μL上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在固体培养板上轻轻涂匀；37℃培养箱中倒置培养12-16h。

6)重组产物鉴定

过夜培养后，重组反应转化平板上形成数百个单克隆。挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定，扩增引物至少使用一条载体上的通用测序引物。如克隆准确，应有长度略大于插入片段大小的条带出现。菌落PCR鉴定为阳性的菌落，可将剩余菌液接种至含有Kana+的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒进行一代测序(上海生工)。结果如图3所示，重组产物PCR鉴定，表明所构建的质粒正确。

7)重组表达载体质粒DNA的大量抽提与浓缩

过表达载体质粒DNA的大量抽提使用无内毒素质粒大量提取试剂盒(Omega，D6926-03)。

①将测序正确的四个转录因子重组质粒相应的菌液分别扩大培养，将1mL菌液加入10mL含Kana+的LB培养基中37℃培养1h后，将10mL菌液转移至250mL一次性细菌摇瓶中，并加入190mL培养基，37℃过夜培养，一般不超过16h；

②将200mL上述培养物分装至6个50mL离心管中，室温下4,000g离心10min收集菌体，轻轻倒出培养基，用纸巾吸走多余培养基；加入10mL solutionⅠ(含RNase A)，涡旋使其充分混匀；加入10mLsolutionⅡ倒置并轻轻摇匀8-10次，室温放置2-3min(避免剧烈振荡混匀)；

③加入提前预冷的N3溶液，轻轻颠倒10次，至白色絮状沉淀出现，室温放置2min(使混合物呈现无粘性，无褐色且不结块状态)；取出柱塞，准备一个裂解液注射器，将注射桶放在离心管架子上与50mL离心管相连；立即将上述裂解液转移至注射桶中(取下盖子，放入50mL离心管上)，并一次性将裂解液排出至50mL离心管中(不要强迫剩余裂解液通过，若有混浊则影响提取质粒的质量)；

④测量过滤后体积，并加入1:10(体积比)的ETR solution，轻轻倒转10次，冰上放置10min，期间可倒转几次；42℃放置5min(出现混浊)；25℃，4,000g离心5min，ETR在管底呈蓝色(一般需静置3-5min可有明显颜色分层，上清液为乳白色液体)；吸出上清液至新的50mL无菌离心管内，加入1/2无水乙醇，倒转6-7次，室温放置2min；

⑤柱平衡：加入3mL GPS buffer到过滤柱中，放置4min，4,000g离心3min，弃废液，用于后续收集；将上述混合液中20mL加入柱子中，4,000g离心3min，弃废液，重复直至所有的上述液体都完成转移；

⑥加入10mL HBC buffer，4,000g离心3min，弃废液(HBC buffer必须提前使用异丙醇稀释)；加入15mLDNA洗涤液，4,000g离心3min，弃废液；加入10mLDNA洗涤液，4,000g离心3min，弃废液；

⑦将柱子空转10min(干燥)；将柱子转移至新的50mL无菌离心管中，加入1-3mL洗脱液，室温放置5min，4,000g离心5min；使用第一次洗脱液进行二次洗脱；测浓度，-20℃(分装)保存。

8)过表达质粒浓缩：采用经典的乙醇沉淀法。

①估算含有质粒溶液的体积V，加入V/9体积的3mol/L的NaAC溶液(一般可先调整质粒溶液体积为270μL左右，则之后加入30μL NaAC溶液)，使NaAC浓度为0.3mol/L；

②加入2倍体积提前预冷好的无水乙醇，-20℃孵育30min；

③最大速度离心10min；

④用75％乙醇洗涤沉淀2次(每次700μL即可)；

⑤室温晾干，使乙醇挥发完全；

⑥加入适当体积的水或TE buffer充分溶解沉淀；

⑦测浓度，-20℃保存。

质粒图谱如图4所示。其中A为重组载体pEGFP-F1+Lc-Oct4-1428的载体图谱；B为重组载体pEGFP-F1+Lc-Sox2-968的载体图谱；C为重组载体pEGFP-F1+Lc-Klf4-1358的载体图谱；D为重组载体pEGFP-F1+Lc-cMyc-1322的载体图谱；E为重组载体pEGFP-F1+Lc-Nanog-1265的载体图谱；F为重组载体pEGFP-F1+Lc-Lin28a-552的载体图谱。

实施例2：大黄鱼肌肉细胞的培养

1)大黄鱼肌肉细胞的复苏

①将两个恒温水浴箱的温度分别调节至42℃和27℃；

②从液氮中取出大黄鱼肌肉细胞系LYCMS冻存管，立即投入42℃温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解，在解冻过程中可以缓慢轻轻摇动冻存管；

大黄鱼肌肉细胞系LYCMS的保藏信息为：

名称：大黄鱼肌肉细胞系LYCMS，

保藏日期：2013年10月31日，

保藏单位：中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中心CCTCC，

保藏编号：CCTCC N0:C2013158。

③将细胞冻存管立即放入27℃温水中进行温度调节；

④将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5mL培养液，轻轻吹打混匀；

⑤将细胞悬液经800～1,000r/min离心5min，弃上清夜；

⑥向细胞沉淀内加入1mL完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足完全培养液进行培养。

2)大黄鱼肌肉细胞的传代培养

①将长满细胞的培养瓶中原培养液弃去。

②加入3mL D-Hanks进行清洗，弃废液；(采取用1mL的枪头吸出)。

③再加入0.5-1mL 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。

④瓶口盖好，来回摇动2～3min后，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10mL培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。

⑤用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，培养瓶口和瓶盖分别在酒精灯火焰上方烤一会，盖好瓶盖，置27℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

实施例3：基于大黄鱼肌肉细胞优化电转染体系

1)电转染实验使用BEX TM CUY21 EDITⅡ电转仪进行转染实验，操作步骤如下：

①在电转前一天晚上，更换细胞培养基，此次换液不含双抗；

②超净台灭菌30min-1h；

③用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液于15mL离心管中；

④离心收集细胞，控制转速在800-1,000转左右，离心5min，弃上清；加入2mLOptIMEM I培养基充分重悬细胞，再次离心收集细胞，弃上清；

⑤重复上述步骤(加入1mL OptI MEM I培养基(Gibco)后，重悬细胞，吸出10μL细胞悬液与等体积0.4％的台盼蓝溶液混合，使用细胞特征分析仪进行计数)；

⑥根据计算得到的细胞数量，加入适当OptI MEM I培养基进行稀释细胞沉淀，使细胞浓度达到1×10⁶/20μL；充分重悬细胞，分别加入等体积量的pEGFP-N1质粒(浓度均为2.5μg/μL)；充分混匀细胞和质粒，静置3min，分装至电击杯中，每个电击杯26μL；

⑦设置电转程序：不同电转染程序如表6：

表6不同电转染程序表

⑧电转结束后，吸出电击杯中的细胞，加入提前预热好的完全培养液(含有15％FBS，EGF，FGF等生长因子)；

⑨小心吹打混匀细胞，将电转后的细胞培养瓶放入27℃恒温培养箱进行培养，48h后观察细胞状态；

设置不同电转程序，对大黄鱼肌肉细胞进行电转，如图5所示，在48h后电转了pEGFP-N1后，细胞使用电转程序4进行转染后绿色荧光最多且最明显(图5的A，a)，其后是电转程序3(图5的B，b)，电转程序2(图5的C，c)，电转程序1(图5的D，d)。说明提高电转程序的击穿电压对提高外源基因的导入效率有明显促进作用；增加电击重复次数也相对有利于其外源基因的导入。后续都采用电转程序4进行电转染实验。

实施例4：大黄鱼电转染多种转录因子组合的比较

本实施例共探索了三组转录因子组合以比较三组多能性因子组合对大黄鱼体细胞重编程中的促进作用。三组转录因子组合分别是OSKM，OSNL和OSKMNL。调整6种多能性因子浓度至2.5μg/uL(以下比例均为体积比)，其中OSKM(O:S:K:M＝1:1:1:1)，OSNL(O:S:N:L＝1:1:1:1)和OSKMNL(O:S:K:M:N:L＝1:1:1:1:1:1)。其中O表示Oct4基因，S表示Sox2基因，K表示Klf4基因，M表示c-Myc基因，N表示Nanog基因，L表示Lin28基因。

其中OSKM是将实施例1所得的重组载体pEGFP-F1+Lc-Oct4-1428，重组载体pEGFP-F1+Lc-Sox2-968，重组载体pEGFP-F1+Lc-Klf4-1358和重组载体pEGFP-F1+Lc-cMyc-1322的质粒调成2.5μg/uL后，四种重组质粒等体积混合所得。

OSNL是将实施例1所得的重组载体pEGFP-F1+Lc-Oct4-1428，重组载体pEGFP-F1+Lc-Sox2-968，重组载体pEGFP-F1+Lc-Nanog-1265和重组载体pEGFP-F1+Lc-Lin28a-552的质粒调成2.5μg/uL后，四种重组质粒等体积混合所得。

OSKMNL是将实施例1所得的重组载体pEGFP-F1+Lc-Oct4-1428，重组载体pEGFP-F1+Lc-Sox2-968，重组载体pEGFP-F1+Lc-Klf4-1358，重组载体pEGFP-F1+Lc-cMyc-1322，重组载体pEGFP-F1+Lc-Nanog-1265和重组载体pEGFP-F1+Lc-Lin28a-552的质粒调成2.5μg/uL后，四种重组质粒等体积混合所得。

分别将实施例1中大量抽提与浓缩的OSKM，OSNL和OSKMNL上述三组多能性因子组合的无内毒素过表达质粒提前混合好，并室温孵育15min，然后分别电转染至大黄鱼肌肉细胞，电转染方法同实施例3。

每个实验组有6个平行。24h后更换为完全培养基，48h后观察细胞状态。

完全培养基为：以Leibovitz's L-15medium培养基为基础，添加终浓度分别为15％无内毒素胎牛血清(zeta-life，澳大利亚)，0.5‰β-巯基乙醇、50μg/mL N-乙酰葡糖糖胺、50μg/mL羧甲基纤维素钠、10μg/L FGF-b、5μg/L EGF、1μg/L HGF、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1％大黄鱼血清及1％大黄鱼胚胎提取物。

大黄鱼肌肉细胞电转了OSKM，从细胞形态学角度分析，细胞与对照组(图6的A)相比更加纤长，细胞形态更加饱满，排列紧密，呈现螺旋状分布(图6的B)，细胞增殖明显加快。对照组和电转了OSKM的细胞都能够观察到明显的绿色荧光(图6的a，b)，表明目的基因成功导入至细胞中，并可以稳定表达，且细胞的生长速度明显加快，细胞在1-2天增长迅速，达到指数增长期，细胞数量增加了5倍，之后细胞的增长渐渐变缓(图6的C)。在之后14天内，并没有观察到细胞克隆的形成。LYCMs过表达了OSKM后，cMyc的表达量极显著上升(约13.79倍)，还激活了Klf4、Oct4和Sox2的表达，分别上升9.26倍、7.46倍和6.92倍；Nanog的表达量也有显著上升，上升3.89倍，而Lin28a的表达量变化不明显，为1.24倍(图6的D)。

LYCMs细胞电转了OSNL，从细胞形态学角度分析，细胞与对照组(图7的A)相比更加纤长，细胞形态更加饱满，排列紧密，呈现辐射状分布(图7的B)，细胞增殖明显加快。对照组和电转了OSNL的细胞都能够观察到明显的绿色荧光(图7的a，b)，表明目的基因成功导入至细胞中，并可以稳定表达，且细胞的生长速度明显加快，细胞在1-2天增长迅速，达到指数增长期，细胞数量增加了7倍，之后细胞的增长渐渐变缓(图7的C)。在第5天观察到有细胞克隆的开始形成。LYCMs过表达OSNL后，Nanog的表达量极显著上升(约359.02倍)，还激活了Oct4、Sox2和Lin28a的表达，分别上升10.70倍、6.92倍和7.54倍；Klf4和cMyc的表达量也有显著上升，分别上升4.22倍和1.78倍(图7的D)。

LYCMs细胞电转了OSKMNL，从细胞形态学角度分析，细胞与对照组(图8的A)相比变得纤长，细胞排列紧密，密度大(图8的B)，细胞增殖明显加快。对照组和电转了OSKMNL的细胞都能够观察到明显的绿色荧光(图8的a，b)，表明目的基因成功导入至细胞中，并可以稳定表达，且细胞的生长速度明显加快，细胞在1-2天增长迅速，达到指数增长期，细胞数量增加了10倍，之后细胞的增长渐渐变缓(图8的C)。在第14天观察到有细胞克隆的开始形成，LYCMs过表达OSKMNL后，Nanog的表达量极显著上升(约7.27倍)，还激活了Klf4和Sox2的表达，分别上升6.05倍和5.14倍；cMyc、Lin28a和Oct4的表达量也有显著上升，分别上升3.04倍、2.65倍和2.27倍(图8的D)。

LYCMs分别电转染了三组转录因子组合，细胞都能明显观察到绿色荧光，细胞的增长速度加快，而OSKMNL组的细胞生长速度最快，细胞分裂增殖能力最强，说明6种转录因子在调控细胞周期上有明显的促进作用。三组转染组都能够明显激活内源性因子的表达，而OSKM组从转染到培养后期都没有观察到细胞克隆的产生，OSNL组在3天就能观察到有多数细胞克隆开始形成，且在较短时间就能扩增，OSKMNL组在转染后第7天有观察到少许细胞克隆形成，表明四因子OSNL比六因子OSKMNL更能促进LYCMs细胞的重编程。

后续的iPSCs的获得都是基于LYCMs电转OSNL。

实施例5 大黄鱼诱导多能性干细胞(iPSCs)的获得与检测

1)大黄鱼iPSCs的形成过程与形态学检测

电转多能性因子组合后，24h后更换培养基，此后每隔24h拍照观察细胞变化情况，记录iPSCs的形成过程，从形态学角度分析大黄鱼iPSCs的形成与变化。

2)大黄鱼iPSCs的培养基的优化及生长曲线的绘制

配制重编程培养基Ⅰ和重编程培养基Ⅱ，相应的配比如表7，选取形态良好、增殖旺盛的大黄鱼iPSCs细胞，消化传代，以1:2进行传代至25cm²细胞培养瓶(即向培养瓶接种5×10⁵个细胞，6个平行)，而后分别用完全培养液Ⅲ、重编程培养液Ⅰ、Ⅱ将各瓶溶液总量补齐至5mL，每组6个平行。从传代24h起，更换相应的培养液。从传代起每隔24h采用5点计数法统计细胞克隆数量并消化每组各一瓶细胞，使用细胞特征分析仪对每组细胞分别进行计数，并作图分析。

如图9的A所示，LYCMs细胞电转了OSNL在第5天观察到有细胞克隆的开始形成，第7天能够明显观察到iPSCs完整的形态(图9的B)。随后细胞克隆数量逐渐增多(图9的C)，伴有形成中iPSCs以及完整形成的iPSCs。

如图10的A所示，使用重编程培养液Ⅰ培养的大黄鱼iPSCs细胞，分裂增殖速度明显，细胞数量在24h内达到指数增长期，克隆数量增加2倍，72小时内细胞仍处在增长期，细胞克隆数量达到最大值。使用重编程培养液Ⅱ培养的大黄鱼iPSCs细胞，克隆数量在24h仅有贴壁，但随后细胞整体状态不好，克隆开始变少(图10的B)。而使用完全培养液Ⅲ培养大黄鱼iPSCs细胞，细胞克隆在24h内有少许增加，能够分裂增殖细胞，但是之后克隆数量没有增加(图10的C)。后续都采用重编程培养液Ⅰ进行iPSCs的培养。

表7不同培养基配方表

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实施例6 实施例5中的大黄鱼iPSCs的碱性磷酸酶检测

碱性磷酸酶实验采用碱性磷酸酶染色试剂盒(干细胞专用)(懋康生物，MP7503-50T)，步骤如下：

接种细胞：小心细胞克隆于12孔板上，并加入2mL重编程培养液Ⅰ，吹打均匀；

实验前的准备：准备一瓶无菌的PBS缓冲液(索莱宝)，并配置PBST缓冲液(取25μLTween 20到50mL1×PBS中使Tween 20浓度为0.05％，充分混匀)；

染色工作液的配置：[溶液A：溶液B：溶液C＝1:1:1]，配置适量染色工作液。取0.3mL溶液A和0.3mL溶液B于1.5mL避光离心管中混匀，室温孵育2min，然后加入0.3mL溶液C混匀即可。每孔使用0.9mL染色工作液，根据需要配置。为了保证最佳的染色效果，一般需要在配制30min内用完染色工作液。

染色步骤：

a)：小心吸去细胞培养液，使用1×PBS清洗一次，再使用PBST洗两次，用1mL固定液室温固定2-5min(注意固定不要超过5min，过度固定会导致ALP失活)；

b)吸出固定液，PBST洗2次；不要让孔干燥；

c)吸出PBST，加入0.9mL染色工作液覆盖细胞，室温避光放置15min(注意染色过程需要密切关注颜色变化，当颜色很明亮即可终止反应，否则会引起非特异性染色)；

d)吸出工作液，用PBS清洗2次，最后滴入PBS或封片剂并盖上盖玻片防止干燥，显微镜下观察染色结果；

e)结果判定：未分化细胞(ALP表达)染色呈红色或紫色，分化细胞(ALP未表达)染色呈无色；

将平板保存在4℃。

结果如图11所示，碱性磷酸酶染色结果为大黄鱼iPSCs被染成红色，表明构建的iPSCs为未分化的多能干细胞，表达ALP。

实施例7 实施例5中的大黄鱼iPSCs的染色体核型分析

1)实验前的准备：配置秋水仙素(40微克/毫升)、低渗液(0.075M氯化钾溶液)、卡诺氏固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1体积比，现用现配)、吉姆萨染液(母液使用1xPBS稀释10倍，现配现用)等；

2)准备冰载玻片：将盖玻片立排于卧式染缸(一般需排二行，中间以载玻片隔开)，松紧度以玻片可轻松转动为宜，用1％盐酸酒精浸泡2h，然后用流水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗数次，用95％酒精浸泡2～3h；用无水酒精浸泡放入冰箱过夜，待滴片前取出使用。

3)待传代细胞27℃继续培养3天，其间，细胞一般生长1-3代。每天需将培养瓶轻轻摇动1-2次。

4)在收集细胞制备染色体标本前4.0小时前(根据培养液的量用微量加样枪无菌操作往培养瓶或培养皿里加秋水仙素液，使其终浓度为10微克/毫升。

5)小心倾去培养液，加入2-3毫升胰蛋白酶溶液作用1到数分钟，在倒置显微镜下视贴在瓶壁上的细胞开始收缩变圆时，小心倾去酶液，加入PBS溶液，用吸管吹打，使细胞从瓶壁上完全脱离下来，将细胞悬液倒进15ml离心管，再吸取2毫升PBS适当吹洗在培养瓶壁上的细胞，倒进离心管。

6)将上述收集好的细胞离心。离心速度为1500转/分钟，时间5分钟。离心完成后，轻轻吸出上清液弃去，再用PBS溶液清洗一次细胞沉淀，1000g离心5min，收集细胞，弃上清液。

7)在15mL离心管中加入10mL提前预热的0.075M的KCl溶液，混匀细胞，置于37℃恒温箱中低渗处理20-40min；

8)在低渗结束前2min沿管壁加入1mL卡诺固定液对细胞进行预固定，1000g离心5min，收集细胞，弃上清液。

9)在预固定的细胞沉淀中加入8mL预冷的固定液，混匀细胞，置于37℃恒温箱固定20-40min，1000g离心5min弃上清液；

10)重复步骤9两次；

11)加入1mL预冷的固定液500uL，混匀细胞，用滴管吸取细胞悬液，在50-100cm处滴在经无水乙醇处理的洁净载玻片上，70℃烘烤1h，室温冷却；

12)染色：用磷酸盐缓冲液将Giemsa染色母液按9:1稀释，配成工作染色液(用时配)。然后放置两根平行的破璃棒于搪瓷盘中，把染色体玻片标本平放在玻璃捧上，细胞面朝上。滴1-2毫升工作染液，使完全盖住细胞并去掉气泡。染色10分钟。最后用自来水简单冲洗，随水倾去染液，待玻片干燥后即可观察。

结果如图12所示，95％的大黄鱼iPSCs染色体数目为2n＝48条，染色体核型稳定。

实施例8 实施例5中的大黄鱼iPSCs的传代培养、冻存与复苏

1)机械法传代细胞

a)在体式显微镜下用细的200uL超细点样枪头，从细胞克隆边缘完整挑取细胞，尽量避免刮起周围已分化细胞；

b)向细胞中添加500uL胰蛋白酶并吸入15mL离心管中；

c)小心摇晃消化2-5min；

d)用移液枪轻轻吹吸细胞后(不需要完全打成单细胞)；

e)向管中加入5mL重编程培养基并重悬细胞；

f)将细胞悬液分装至6孔细胞培养板中，每5mL细胞悬液可分装2孔；

g)继续添加1mL重编程培养基继续培养；

h)此后每隔2-3天，按1:2比例或1:3进行传代培养。

2)酶传消化细胞

a)用1mL加长枪头小心吸走旧培养基，沿着壁孔小心加入2mLPBS轻晃培养板并小心吸走PBS，清洗2次即可；

b)向其中加入1mL胰蛋白酶消化2-5min，在显微镜下观察细胞大部分脱离，加入5mL终止液(含10％FBS)进行终止消化；

c)将细胞悬液收集到15mL离心管中，1000rpm离心3min，小心弃掉上清液；

d)加入5mL重编程培养基，重悬细胞沉淀，并分装至6孔细胞培养板中，每5mL可分装两孔；

e)此后每隔2-3天，按1:2比例或1:3进行传代培养。

3)iPSCs的冻存与复苏

①iPSCs细胞冻存

a)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备细胞悬液；

b)将细胞悬液以1000rpm离心5min，去上清夜；

c)向细胞沉淀中加入冻存液，轻轻吹打混匀；

d)按每管1mL分装于冻存管内，拧紧管盖；

e)做好标记，包括细胞代号及冻存日期。

f)先将冻存管放入4℃冰箱，约40min；

g)接着将冻存管于冰箱-20℃冷冻室，约30min；

h)然后将冻存管转移到超低温冰箱，过夜；

i)最后将冻存管投入液氮保存。

j)记录做好冻存记录。

②iPSCs细胞复苏

a)将两个恒温水浴箱的温度分别调节至42℃和27℃；

b)从液氮中取出冻存管，立即投入42℃温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解，在解冻过程中可以缓慢轻轻摇动冻存管；

c)将细胞冻存管立即放入27℃温水中进行温度调节；

d)将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5mL培养液，轻轻吹打混匀；

e)将细胞悬液经1000rpm离心5min，弃上清夜；

f)向细胞沉淀内加入1mL完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足重编程培养液进行培养。

如图13的A-B所示，机械法传代细胞，能够将细胞克隆单独挑取至细胞培养瓶中，待后期细胞贴壁后能分裂出细胞，伴随着这些细胞的增多，会逐渐形成新的克隆。如图13的C-D所示，酶传法传代细胞，细胞增殖速度快，但是克隆能够较快的形成，但是由于细胞数量过多会影响克隆的生长，导致细胞培养基营养消耗过快，iPSCs更趋于分化。后续，我们都采用机械法进行传代培养。

实施例9 实施例5中的大黄鱼iPSCs的免疫荧光染色

1)将传代的iPSCs细胞接种于6孔板中，24h后进行细胞免疫荧光检测；

2)吸去培养基，细胞用1xPBS漂洗3次，每次5min；

3)4％PFA固定30min后，1xPBS漂洗3次，每次5min；

4)加入1％Triton-100通透处理15min后，1xPBS漂洗3次，每次5min；

5)加入5％山羊血清(PBS稀释)，室温条件下封闭1-2h；

6)用TBP(1％Tritonx-100+1％BSA-PBS)清洗三遍，每次5min；

7)1:500稀释一抗，孵育细胞，4℃过夜；

8)次日，室温条件下，放置20min，用TBP洗3次，每次5min；

9)避光条件下，加入稀释好的二抗溶液，孵育1h；

10)TBP溶液洗3次，加入DAPI溶液(10ng/mL)核染15min；

11)PBS洗3次，共聚焦显微镜拍照观察。

结果如图14所示，通过免疫荧光染色检测了多能性干细胞标记基因Oct4、Sox2和Nanog蛋白的表达情况。Oct4、Sox2和Nanog蛋白阳性信号在大黄鱼iPSCs中都能检测到。

实施例10 实施例5中的大黄鱼iPSCs的细胞荧光原位杂交

1)探针的制备

以Pr-F、Pr-R(引物序列如表8)为引物，所提稀释10倍的大黄鱼卵巢组织cDNA作为模板，扩增所需探针模板DNA，其反应体系25μL为：2×Taq Mix 12.5μL；Pr-F 1μL；Pr-R 1μL；ddH2O 9.5μL；cDNA 1μL；PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，52～58℃30s，72℃90s，35个循环；72℃15min；16℃5min。反应结束后用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照，分别割取目的片段，使用Omega胶纯化。

试剂盒回收目的片段，并将纯化得到的DNA按照连接至PGEM-T载体上反应体系：PGEM-T Vector 0.5μL；T4 DNA 0.5μL；10×buffer 1μL；DNA模板3.5μL；4℃孵育过夜。按照实施例1中的5)和6)中的方法进行转化并涂布平板，分别挑取单克隆菌落进行正、反向检测，将阳性克隆送测；阳性克隆菌液加入1mL含AMP的LB液体培养基，37℃摇床培养6h，4℃保存。

测序分别得到Oct4和Sox2的正向、反向单克隆菌液，使用T7-F与Pr-F/Pr-R(引物序列如表8)分别扩增得到正向探针模板、反向探针模板(扩增的模板是分别为Oct4和Sox2正向单克隆菌液和反向单克隆菌液)。反应体系与条件同上。扩增产物使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测拍照后，割胶并纯化，然后将纯化后的DNA作为体外转录合成探针的模板(T7-F与Pr-F扩增得到的作为正义探针模板，T7-F与Pr-R扩增得到的作为反义探针模板)。

表8荧光原位杂交探针引物表

体外转录法合成探针步骤如下：

a)混合均匀后于PCR仪中37℃孵育2h(可在1h后再加入1μL T7 RNA polymerase提高效果)；

b)加入1μL DNase I，37℃孵育15min以消化DNA模板；

c)加入1μL 50mM EDTA，以终止DNase消化；

d)加入2.5μL 4M LiCl和100μL无水乙醇以沉淀RNA探针；-80℃孵育3h；

e)离心收集RNA沉淀，低温高速离心机12000g，4℃离心10min；

f)加入70％的乙醇500μL洗涤沉淀(轻轻摇晃)12000g，4℃离心5min，重复步骤一次；

g)小心移去乙醇(勿完全干燥)，然后加入50μL无菌水重悬沉淀，充分溶解；取1μLRNA探针进行电泳检测，0.5μL RNA探针检测浓度；

h)超低温冰箱(-80℃)保存，尽量将RNA探针分装，避免反复冻融。

2)样品准备

a)根据待测细胞培养条件培养细胞，观察细胞状态，当细胞密度达到80％以上进行传代，待细胞长满后调整细胞浓度为5×104cells/mL,将细胞接种于盖玻片，每个盖玻片100μL，37℃恒温培养24h。

b)固定：细胞爬片用4％PFA固定20min后，PBS洗2遍；

c)蛋白酶K处理：10-20μg/mL蛋白酶K溶液37℃处理30min；4％PFA室温固定5min；PBS洗5次，5min/次；

d)预杂交：预杂交液Hybe-(无肝素和探针)中60℃预杂交1h；

e)杂交：杂交液Hybe+(含肝素和探针，探针浓度为0.5-2ng/μL杂交液)，60℃杂交过夜；

f)60℃下梯度溶液洗涤：预杂交液→75％预杂交液/2×SSC→50％预杂交液/2×SSC→25％预杂交液/2×SSC→2×SSC，各洗1次，8min/次→0.2×SSC洗涤2次，20min/次；室温下梯度洗涤：75％0.2×SSC+25％PBS→50％0.2×SSC+50％PBS→25％0.2×SSC+75％PBS→PBS，5min/次；

g)RNA封闭：室温下封闭液封闭1h；抗体孵育：移除封闭液，加入1:500稀释的Anti-DIG-AP抗体，4℃过夜；洗涤：室温下1×PBS洗涤5次，15min/次；

注意：以下所有操作步骤都需要严格避光。

h)将Alexa Fluor 647荧光二抗在封闭液(封闭液中1×PBST替换为×PBS/0.5％Triton X-100)中按1:1000的比例稀释，小心移去样品中的洗涤液，加入二抗容液，室温摇动孵育2h；

i)小心移除二抗溶液，用1×PBS/0.5％Triton X-100溶液洗涤细胞3次，每次10min；

j)小心将胚胎转移至观察培养皿，用干净的滤纸吸除胚胎周围的洗涤液后，滴加DAPI染色1min；

k)用干净的滤纸吸除DAPI后，滴加抗淬灭剂至完全覆盖胚胎；

l)封片后，用Leica TCS SP8激光扫描共聚焦倒置显微镜观察样品。

如图15所示，在形成中的大黄鱼iPSCs中检测到了Oct4基因的mRNA转录本阳性信号。

实施例11 实施例5中的大黄鱼iPSCs的转录组测序分析差异基因的表达谱分析

1)RNA提取与检测

①琼脂糖凝胶电泳：分析样品RNA完整性及是否存在DNA污染；

②NanoPhotometer spectrophotometer：检测RNA纯度(OD260/280及OD260/230比值)；

③Agilent 2100 bioanalyzer：精确检测RNA完整性。

2)文库构建与质检

建库起始RNA为total RNA，总量>＝1ug。建库中使用的建库试剂盒为Illumina的UltraTM RNA Library Prep Kit。通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA，随后在NEB Fragmentation Buffer中用二价阳离子将得到的mRNA随机打断。以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复，经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选250～300bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。

文库构建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/ul，随后使用Agilent 2100 bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insertsize符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2nM)，以保证文库质量。

3)上机测序

库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序，并产生150bp配对末端读数。测序的基本原理是边合成边测序(Sequencingby Synthesis)。在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

4)差异表达分析

使用DESeq2软件(1.16.1)进行两个比较组合之间的差异表达分析(每个组两个生物学重复)。DESeq2提供了统计程序，用于使用基于负二项式分布的模型来确定数字基因表达数据中的差异表达。使用Benjamini和Hochberg的方法来调整所得P值以控制错误发现率。通过DESeq2发现调整的P值<0.05的基因被分配为差异表达的。(对于没有生物学重复的采用edgeR)在进行差异基因表达分析之前，对于每个测序文库，通过一个比例归一化因子通过edgeR程序包调整读取计数。两个条件的差异表达分析使用edgeR软件包(3.18.1)进行。使用Benjamini&Hochberg方法调整P值。校正后的P值以及|log2foldchange|作为显著差异表达的阈值。“火山图”是转录组分析的标志性作图，在图中既能反映差异分析的统计学显著性大小(padj)，又能展示表达量在两个小组中的倍数关系(log2FC)。我们对本groupplan分组方案中的每任意两个group构成的groups_comparison都做了火山图。

5)差异基因富集分析

通过clusterProfiler(3.4.4)软件实现差异表达基因的GO富集分析，其中修正了基因长度偏差。考虑具有小于0.05的校正的P值的GO term通过差异表达基因显著富集。KEGG是一个数据库资源，用于从分子水平的信息，特别是基因组测序产生的大规模分子数据集和其他高通量数据库中了解生物系统的高级功能和效用，如细胞，生物体和生态系统等。我们使用clusterProfiler(3.4.4)软件分析KEGG通路中差异表达基因的统计富集。

如图16所示，各个样本的基因表达量的整体的分布情况及主成分分析，可以看得出OSNL-iPSCs、OSKMNL-iPSCs与LYCM细胞均有明显区别且OSNL-iPSCs与OSKMNL-iPSCs间也有较大差异。

如图17所示，OSNL-iPSCs与LYCM相比，有676个基因上调，460个基因下调；OSKMNL-iPSCs与LYCM相比，有654个基因上调，901个基因下调；OSNL-iPSCs与OSKMNL-iPSCs相比，有13个基因上调，201个基因下调。

如图18-20所示，差异表达基因通过GO富集分析主要分布在生物过程、细胞组成、分子功能。生物过程的差异基因主要分布在蛋白磷酸化、调节转录、信号转导等，细胞组成主要为膜的整体成分、核、胞外区等，分子功能主要包括蛋白结合、ATP结合、锌离子结合、DNA结合、蛋白激酶活性等。

如图21所示，差异表达基因通过KEGG通路富集分析，主要的通路有细胞周期(Cellcycle)、细胞因子与细胞因子受体的相互作用(Cytokine-cytokine receptorinteraction)、细胞衰老(Cellular senescence)、细胞粘附分子(Cell adhesionmolecules)、DNA复制(DNA replication)等，其中细胞周期、细胞因子与细胞因子受体的相互作用与细胞衰老是调节干细胞的多能性信号通路(signaling pathways regulatingthe pluripotency of stem cells)的主要组成部分。综上所述，OSNL四种多能性因子能够维持LYCM细胞的选择性多能状态，本发明所构建的大黄鱼iPSCs为OSNL-iPSCs具有多能性，自我更新能力强。

如图22所示，从大黄鱼LYCMs的对照组与实验组转录组中筛选出12个与多能性干细胞相关的差异表达基因进行qRT-PCR验证。如图22的A所示，在OSNL-iPSCs vs LYCMs中，Mapk1、Hox-a3、Stat3、Ctnb1、Tcf3、Wnt5、Wnt6及Inhbb等8个基因表达水平升高，LifR、Tbx3、Wnt1及Inhba等4个基因表达水平下降；如图22的B所示，在OSKMNL-iPSCs vs LYCMs中，Mapk1、Tbx3、Hox-a3、Stat3、Ctnb1、Tcf3、Wnt5、Wnt6及Inhbb等9个基因表达水平升高，LifR、Wnt1及Inhba等3个基因表达水平下降；如图22的C所示，在OSKMNL-iPSCs vs OSNL-iPSCs中，LifR、Tbx3、Wnt1、Wnt5及Wnt6等5个基因表达水平升高，Mapk1、Hox-a3、Stat3、Ctnb1、Tcf3、Inhba及Inhbb等7个基因表达水平下降；qRT-PCR结果与RNA-Seq结果的趋势基本一致。通过qRT-PCR检测，这些基因在每组间的各个样本的相对表达量分组聚类热图如下(图22的D)。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 集美大学

<120> 一种大黄鱼体外诱导多能性干细胞的方法

<130> JMDXL-21065-CNI

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aattctgcag tcgacggtac catgtctgaa agaccgcaga gtcc 44

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggtggcga ccggtggatc ccgatgtctg aaagaccgca gagtcc 46

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aattctgcag tcgacggtac catgtataac atgatggaga ctgaactaaa g 51

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggtggcga ccggtggatc ccgttacatg tgtgttaacg gcagcg 46

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aattctgcag tcgacggtac catgaggcag cctccaaatg a 41

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggtggcga ccggtggatc ccgtcataag tgtctcttca tatggagagc 50

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aattctgcag tcgacggtac catgccggtg agtgcgagtt 40

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggtggcga ccggtggatc ccgttaagcg cgtgagacgt gc 42

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aattctgcag tcgacggtac catggcagac tggaagtcgc aggg 44

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggtggcga ccggtggatc ccgctggctg tggttatgca ctatgg 46

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aattctgcag tcgacggtac catgaccagc ggaggctgtg c 41

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atggtggcga ccggtggatc ccgctcaaag ttttgctcct cttc 44

Claims

1.一种使用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28a四种转录因子体外诱导大黄鱼多能性干细胞的方法，所述方法包括：

分别构建含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28a的重组质粒，将所得重组质粒电转染分离的大黄鱼体细胞培养得到大黄鱼多能性干细胞；

所述大黄鱼体细胞为大黄鱼肌肉细胞；

所述含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28a的重组质粒中的载体骨架为pEGFP-N1质粒；

所述含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28a的重组质粒等体积混合后再转染。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述转染是将体细胞的细胞培养基更换成不含双抗的细胞培养基继续培养过夜收集细胞后，用无血清培养基重悬收集的细胞，再加入含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28a的重组质粒；充分混匀后静置3 min，进行电转；电转程序的击穿电压为150V，重复2次。