CN110079526B

CN110079526B - sgRNA序列及利用CRISPR-Cas9技术制备RH阴性红细胞的方法

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Publication number: CN110079526B
Application number: CN201910242620.9A
Authority: CN
Inventors: 裴雪涛; 谢小燕; 曲洺逸; 房芳; 徐蕾; 曾泉; 岳�文
Original assignee: South China Institute Of Biomedicine; Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: South China Institute Of Biomedicine; Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2039-03-28
Also published as: CN110079526A

Abstract

本发明涉及基因编辑领域，具体涉及一种sgRNA序列及利用CRISPR‑Cas9技术制备RH阴性红细胞的方法。本发明提供了一种可分离的核酸序列，包括sgRNA靶向序列和/或其互补序列；所述sgRNA靶向序列为SEQ ID NO:1所示核酸序列。所提供的sgRNA序列能够靶向到该可分离的核酸序列。利用本发明提供的核酸序列，构建表达载体，可以实现RH阳性血向RH阴性血的转变，从而满足输血的需求。

Description

sgRNA序列及利用CRISPR-Cas9技术制备RH阴性红细胞的方法

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，涉及sgRNA序列及利用CRISPR-Cas9技术制备RH阴性红细胞的方法，具体涉及一种可分离的核酸序列、sgRNA序列、表达载体、重组细胞，RH阴性干细胞的制备方法以及RH阴性红细胞的制备方法。

背景技术

输血治疗意义重大，血液输注除了补给血量、维持血容量，提高血压以抗休克和防止出血性休克外，还可供给具有携氧能力的红细胞以纠正因红细胞减少或其携氧能力降低所导致的急性缺氧症。

输血过程对血型匹配的要求很高。血型由红细胞膜上特异性抗原类型决定，对输血安全发挥关键作用。除常见的ABO血型外，RH血型于1940年被发现，由于与恒河猴(Rhesusmonkey)红细胞的抗原物质相同，因而被命名为RH血型。通常把红细胞上含有D抗原的称为RH阳性，而不含有D抗原的称为RH阴性。

RH阴性的个体在亚洲汉族人当中很稀有，比率为0.3％左右，在欧美等白种人中比例较高，为15％左右。RH血型不合的输血,有可能产生危及生命的溶血性输血反应，母子RH血型不合的妊娠则有可能发生新生儿溶血病，严重者可导致新生儿死亡，或是使胎儿死于子宫内。此外，正常RH阴性者，血浆中不含抗-D抗体，所以当RH阴性的人第一次输入RHD阳性血液时，不会发生凝集反应，但此时RH阴性者却会由于各种免疫而产生抗D抗体，当再次输入RHD阳性的血液时，就发生严重的输血反应甚至造成死亡。目前RH血型的检查已被列为血型的常规检查之一。而由于RH阴性人群的稀少，为满足这部分人的输血需求，各血站也常年在数以万计的供血人群中筛选RHD(-)的供者。

如何获得RH阴性的红细胞，对于输血治疗至关重要。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种编码sgRNA的核酸序列、sgRNA序列、表达载体、重组细胞，RH阴性干细胞的制备方法以及RH阴性红细胞的制备方法。

本发明的发明人在研究过程中发现：干细胞多向分化的特性为血液供应提供了新的来源，由多能干细胞或造血干/祖细胞起始，经定向诱导分化与扩增，可以获得临床所需的功能性红细胞。我们的前期研究已实现干细胞向红细胞的有效诱导。而血型由基因决定，早在受精卵形成时血型即已确定，在干细胞向红系细胞分化时开始在细胞膜上表达血型糖蛋白，从而实质性表现出血型。通过在干细胞阶段对基因进行修改，可实现其所有子代细胞的血型改变。以此为基础，我们选择RHD基因上的特定位点，通过CRISPR/CAS9技术对基因组进行定点修改，提前终止RHD基因的表达，从而实现RH血型阳性向阴性的转变。利用该技术对商品化胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、造血干/祖细胞(HSPC)的基因组做定点修饰，调整基因型为RHD阴性，继续诱导这些干细胞向红细胞分化，获得RH阴性红细胞，可满足临床输血的需要。由于红细胞没有细胞核，不保留遗传物质，因此可以忽略基因修饰对输注的影响。

本发明确定有效的RHD基因靶位点，进而建立sgRNA(小向导RNA)序列和CRISPR载体，通过CRISPR/Cas9技术实现高效、特异的RHD基因敲除，从而建立RH阴性转基因干细胞和RH阴性人工诱导红细胞。

本发明针对软件推测的多个RHD基因修饰位点构建CRISPR/Cas9载体，转染红白血病细胞系K562，进一步诱导K562细胞红系分化，通过比较RHD基因的敲除效率，以及脱靶敲除RHD的高保守性基因RHCE基因的可能性，最终筛选确定最佳的RHD基因敲除DNA序列和载体，构建RHD基因敲除干细胞系，获得RH阴性人工红细胞。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种可分离的核酸序列，所述核酸序列包括sgRNA靶向序列和/或其互补序列；所述sgRNA靶向序列选自下列中的至少一种：SEQ IDNO:1所示核酸序列；SEQ ID NO:2所示核酸序列；SEQ ID NO:6所示核酸序列。这些sgRNA靶向序列能够特异性靶向到RHD基因上，抑制RHD基因的表达。利用这些序列构建表达载体，对干细胞进行基因改造，终止RHD基因的表达，可以实现RH血型阳性向阴性的转变，降低输血反应的发生，满足临床输血的需要。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种sgRNA序列，所述sgRNA序列能够靶向到本发明第一方面所述的可分离的核酸序列上。

在本发明的一些实施例中，所述sgRNA序列选自下列中的至少一种：SEQ ID NO:19所示的核酸序列；SEQ ID NO:20所示的核酸序列；SEQ ID NO:24所示的核酸序列。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第一方面所述的可分离的核酸序列。

根据本发明的实施例，以上所述表达载体可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述表达载体能够编码sgRNA序列，所述sgRNA序列为本发明第二方面所述的sgRNA序列。

在本发明的一些实施例中，所述表达载体进一步含有CRISPR-CAS9载体。利用CRISPR-Cas9载体和sgRNA序列构建获得CRISPR-CAS9 sgRNA载体，利用sgRNA引导核酸酶(Cas9)到达DNA靶点，然后利用CRISPR技术实现基因的准确敲除，从而可以利用CRISPR-CAS9 sgRNA载体获得RH阴性干细胞。借鉴成熟的干细胞向红细胞的诱导分化和脱核培养的技术，将获得的RH阴性干细胞进行诱导分化培养以及脱核培养，获得RH阴性红细胞，应用于输血领域，可以有效减少输血反应的发生。所用到的CRISPR-Cas9载体可以自己制备获得，也可以直接商购获得。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有本发明第三方面所述的表达载体。

在本发明的一些实施例中，所述重组细胞为RH阴性干细胞。

在本发明的一些实施例中，所述重组细胞为K562细胞。K562细胞为人类慢性髓系白血病细胞。该细胞具有多向分化潜能，能够分化成红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞。K562细胞可以作为受体细胞，能够被诱导并表达出RHD抗原，且K562细胞已经成系，相较于干细胞，培养起来更加方便，尤其适合于在前期进行多套表达载体的筛选。重组K562细胞中含有本发明第三方面所述的表达载体，能够特异性分化成为RH阴性红细胞。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种RH阴性干细胞的制备方法，包括：将表达载体导入到干细胞中，筛选单细胞克隆，扩大培养获得RH阴性干细胞，所述表达载体为本发明第三方面所述的表达载体。通过将表达载体导入到干细胞中，可以预先在表达载体中加入筛选标记，或者利用表达载体本身所含有的筛选标记，将表达载体导入到干细胞中后，先利用筛选标记进行筛选，获得RHD表达阴性的干细胞，然后挑选单细胞克隆进行扩大培养，获得RH阴性干细胞，可以用作RH阴性红细胞的制备，从而获得RHD表达阴性的RH阴性血，用作输血，降低输血反应。

在本发明的一些实施例中，所述干细胞选自商品化胚胎干细胞、诱导多能干细胞或者造血干/祖细胞中的至少一种。这些细胞均可以用来制备RH阴性干细胞。从发育阶段来说，胚胎干细胞更为原始，可由胚胎干细胞发育成造血干/祖细胞，再从造血干/祖细胞进一步发育分化为红细胞。由于商品化胚胎干细胞更容易建立起细胞系，在至少一些优选实施例中，所述干细胞为商品化胚胎干细胞。

根据本发明的第六方面，本发明提供了一种RH阴性红细胞的制备方法，包括：获得RH阴性干细胞，所述RH阴性干细胞含有本发明第三方面所述的表达载体；利用RH阴性干细胞进行诱导分化，获得经诱导分化的RH阴性红细胞；对所述经诱导分化的RH阴性红细胞进行脱核培养，获得成熟的RH阴性红细胞。

在本发明的一些实施例中，所述RH阴性干细胞通过本发明第五方面所述的制备方法获得。

在本发明的一些实施例中，利用分化培养基对所述RH阴性干细胞进行所述诱导分化，所述分化培养基包括StemSpan无血清培养基、人促红细胞生成素(EPO)、干细胞生长因子(SCF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、转铁蛋白、地塞米松(Dex)和L-谷氨酰胺。利用该分化培养基可以有效实现对于RH阴性干细胞的诱导分化。在至少一些实施例中，所述RH阴性干细胞为将表达载体导入到造血干/祖细胞中，筛选单细胞克隆，扩大培养获得的RH阴性干细胞。

在本发明的一些实施例中，利用脱核培养基对所述经诱导分化的RH阴性红细胞进行脱核培养，所述脱核培养基包括RPMI1640无血清培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素，肝素、血浆和血清。利用该脱核培养基脱去RH阴性红细胞的细胞核，获得成熟的RH阴性红细胞。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的经过G418筛选后各转基因K562细胞株中RHD及RHCE表达的检测结果。

图2是根据本发明的实施例提供的经过单细胞分选后各转基因K562细胞株中RHD及RHCE表达的检测结果。

图3是根据本发明的实施例提供的RHD表达的western blot检测结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

同时，为了方便本领域技术人员理解，对本文中出现的某些术语进行解释和说明，本领域技术人员应该理解的是，这些解释和说明仅用来方便对于本发明技术方案的理解，而不应当作为对本发明保护范围的限制。

本文中，“正义链”指的是：RHD基因的编码链。

本文中，“反义链”指的是：RHD基因编码链互补配对的另一条DNA链。

本文中“RHD基因”是指编码RH血型D抗原的基因，RHD基因表达的红细胞即通常意义上的RH阳性血。RHD基因不表达的红细胞即通常意义上的RH阴性血，也称为“RH阴性红细胞”。

本文中“RH阴性干细胞”是指：染色体中RHD编码基因缺失或RHD基因因突变、基因重排、杂化基因等原因而无法在红细胞上表达，具备这样的染色体特征的干细胞称为RH阴性干细胞。

RH基因位于染色体1p34.3-36.1，主要由RHD基因和RHCE基因两个基因组成，这两个基因的3’端相对，相隔约有3万bp。RHD和RHCE基因各由10个外显子组成，二者有43个碱基有差异，其中第1、2、8外显子序列基本一致，所以绝大多数RHD基因测定中，引物选择扩增RHD基因的3-7以及9-10外显子。在RHD基因两侧各有一段约9000bp的侧翼序列片段，称为RH盒子(Rhesus box)序列，5’端为上游R盒子(Upstream Rhesus box)，长9142bp，3’端为下游R盒子(Downstream Rhesus box)，长为9145bp，上下游盒子方向相同，与RHD基因一致。通常只有D抗原阳性个体拥有一或二条RHD基因，而D阴性个体则缺失RHD基因，RHD阴性个体的RHD基因缺失发生在上下游盒子之间，并形成一个融合(Hybrid Rhesus box)。

本发明的技术关键点在于针对RHD基因的靶序列，对该序列设计sgRNA，建立的CRISPR载体能实现RHD基因的有效性、特异性敲除。Cas9是化脓性链球菌特异的核酸内切酶，也是唯一参与沉默外源DNA的核酸酶。CRISPR系统可识别特定的DNA，通过三个主要的组件设计模块化组装：1)切割DNA的核酸酶；2)特异的决定RNA链，称为CRISPR RNA(crRNA)，又称小向导RNA(sgRNA)；和3)反式激活crRNA(tracrRNA)。与ZFN和TALEN通过复杂的蛋白相互作用识别DNA的方式不同，CRISPR-Cas9系统通过RNA寡核苷酸与DNA互补配对的方式结合到DNA上。crRNA上的20个核苷酸能特异结合到靶DNA的20个核苷酸上，随后招募Cas9内切酶，实现定点切割。在利用CRISPR-Cas9载体进行基因编辑的过程中，容易出现脱靶结合的问题，即基因编辑系统可能会靶向计划以外的位点，对其他基因或DNA序列展开切割修饰，从而出现无法预期的负面影响。需因此筛选出基因修饰效率最高、同时脱靶效率最低的序列位点很重要。

为此，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种sgRNA序列，所述sgRNA序列选自下列中的至少一种：SEQ ID NO:19所示的核酸序列；SEQ ID NO:20所示的核酸序列；SEQ IDNO:24所示的核酸序列。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种RH阴性红细胞的制备方法，包括：获得RH阴性干细胞，所述RH阴性干细胞含有表达载体，所述表达载体含有编码sgRNA的核酸序列；利用RH阴性干细胞进行诱导分化，获得经诱导分化的RH阴性红细胞；对所述经诱导分化的RH阴性红细胞进行脱核培养，获得成熟的RH阴性红细胞。

在至少一些实施方式中，利用分化培养基对所述RH阴性干细胞进行诱导分化，所述分化培养基以StemSpan无血清培养基为基础培养基，添加人促红细胞生成素(EPO)5U/mL、干细胞生长因子(SCF)100ng/mL、胰岛素样生长因子(IGF-1)40ng/mL、转铁蛋白(holo-Transferrin)100μg/mL、地塞米松(Dex)1μM、L-谷氨酰胺2mM。

在至少一些实施方式中，利用脱核培养基所述经诱导分化的RH阴性红细胞进行脱核培养，所述脱核培养基以RPMI1640无血清培养基，添加有300μg/ml转铁蛋白，10μg/ml重组人胰岛素，3U/ml肝素，2％血浆和3％血清。实验过程中，发明人首先利用含有sgRNA核酸序列的表达载体，将其导入到造血干/祖细胞中，获得RH阴性造血干细胞；然后利用上述提供的分化培养基对该RH阴性造血干细胞进行诱导分化培养，然后利用上述提供的脱核培养基对经过诱导分化的RH阴性造血干细胞进行脱核培养，获得成熟的RH阴性红细胞。所制备得到的成熟的RH阴性红细胞用于输血，经验证不会有输血反应的发生。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、载体构建

1)根据RHD基因的编码特点，比对确定特异性较高的外显子exon2、exon5和exon7，将靶序列限制于这3个外显子中。在(http://crispr.mit.edu/)网站分析确定6个sgRNA序列靶向的RHD序列，分别命名为2-1，5-1，5-2，7-1，7-2，7-3。对应设计6对引物，分别退火后形成两端带有BsmB I内切酶酶切残基，编码向导RNA的双链DNA片段。其中这些sgRNA序列靶向的RHD序列如下表1所示：

表1 sgRNA序列靶向的RHD序列

所设计的合成引物如下表2所示：

表2引物序列

编号	核酸序列
		2-1F(SEQ ID NO:7)	CACCGGCTGTGTCTCCGGAAACTCG
2-1R(SEQ ID NO:8)	AAACCGAGTTTCCGGAGACACAGCC
		5-1F(SEQ ID NO:9)	CACCGACGGCATTCTTCCTTTCGAT
5-1R(SEQ ID NO:10)	AAACATCGAAAGGAAGAATGCCGTC
		5-2F(SEQ ID NO:11)	CACCGGCTGACTGCTACAGCATAGT
5-2R(SEQ ID NO:12)	AAACACTATGCTGTAGCAGTCAGCC
		7-1F(SEQ ID NO:13)	CACCGGGGCTACAACTTCAGCTTGC
7-1R(SEQ ID NO:14)	AAACGCAAGCTGAAGTTGTAGCCCC
		7-2F(SEQ ID NO:15)	CACCGGCTGAAGTTGTAGCCCATGA
7-2R(SEQ ID NO:16)	AAACTCATGGGCTACAACTTCAGCC
		7-3F(SEQ ID NO:17)	CACCGGATACCGTCGGAGCCGGCAA
7-3R(SEQ ID NO:18)	AAACTTGCCGGCTCCGACGGTATCC

其中，表2中给出的编号，相同数字分别对应同一目的片段的上游引物和下游引物。例如2-1F和2-1R分别代表扩增表1中序列2-1的上游引物和下游引物；其他编号相似。示出的引物中，上游引物中“CACC”代表能与酶切后的载体互补的上游粘性末端，下游引物中“AAAC”代表能与酶切后的载体互补的下游粘性末端。其中，每对引物退火后在两端会产生粘性末端，可以和酶切之后的载体直接退火连接。

其中能够靶向表1中各RHD序列的sgRNA序列如下表3所示，其中表3中各编号分别对应表1中各编号：

表3 sgRNA序列

2)CRISPR-CAS9整合载体LentiCRISPR v2购自ADDGENE，利用BsmB I内切酶切割，琼脂糖凝胶电泳，胶回收载体片段。

3)连接sgRNA编码片段和LentiCRISPR v2载体，随后转化，挑菌和质粒提取，并对获得的单克隆质粒(LentiCRISPR v2-2-1、LentiCRISPR v2-5-1、LentiCRISPR v2-5-2、LentiCRISPR v2-7-1、LentiCRISPR v2-7-2、LentiCRISPR v2-7-3)进行酶切鉴定和测序，选择正确的构建载体用于后续细胞转染，载体简称为2-1、5-1、5-2、7-1、7-2和7-3。

2、细胞转染和筛选

1)细胞系的培养：K562细胞以RPMI-1640培养基加10％胎牛血清培养。

2)参照Invitrogen公司说明书，以脂质体Lipofectamine2000将CRISPR载体转染入K562细胞。

3)6-8小时后，将细胞取出，更换为含有胎牛血清的日常培养基。

4)常规培养上述细胞4天左右，若细胞生长状态良好，即向日常培养基中添加G418(G418是一种氨基糖苷类抗生物，可以作为稳定转染常用的抗性筛选试剂)，2-3天换液，持续3-4周，筛选出具有neomycin抗性的细胞，即获得稳定转染CRISPR-CAS9载体的K562细胞。

5)流式细胞术分选筛选获得的各转染细胞株，由单细胞培养成克隆，确保DNA成分

3、红系诱导

1)收集K562细胞，计数后离心。

2)配制第一阶段红系诱导培养基，在K562细胞完全培养基中加入hemin和ara-C至终浓度分别达40uM和0.1ug/ml。

3)用诱导培养基重悬细胞，至1×10⁵/ml。

4)置37℃孵箱培养4天。

5)收集细胞，重新计数并离心。

6)配制第二阶段红系诱导培养基，在K562细胞完全培养基中加入DMSO(210mM)。

7)用诱导培养基重悬细胞，至3×10⁵/ml。

8)继续培养3天。

9)收集细胞用于检测诱导情况。

4、实时定量PCR(RT-PCR)检测RHD的表达

(1)RNA的提取

1)收集适量细胞至1.5ml EP管中，PBS洗涤1次，每管细胞加入1ml Trizol，吹打研磨,使细胞完全均浆。

2)加入0.2ml的三氯甲烷，上下震荡15秒充分混匀，室温静置10min后4℃离心，12000rpm离心15min。

3)将EP管小心取出，液体从上至下分为三层，依次为清澈水相层、浑浊蛋白层、粉色的酚/氯仿层。吸取上层水相转移至新的1.5ml离心管中。

4)加入0.5ml预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀，室温静置10min后4℃离心，12000rpm离心15min。

5)小心弃上清，保留管底白色絮状沉淀，加入75％乙醇(75％的无水乙醇+25％DEPC水)1ml，轻柔混匀，4℃离心，12000rpm离心15min，洗涤RNA。

6)小心弃上清，将离心管置于通风橱中放置5-10min，至白色絮状沉淀变透明。

7)向离心管中加入10-30μl DEPC水，溶解RNA沉淀。用紫外分光光度计进行RNA浓度和吸光度测定，当OD260/OD280，在1.8-2.0之间时，说明RNA纯度良好，可以进行下游的反转录实验。

8)提取的RNA有被RNA酶降解的风险，可置于-70℃保存，并在半年之内使用。

(2)cDNA反转录

1)取RNA模板800ng，补加入Nuclease-free Water至16μl，在65℃条件下热变性5min，于冰上急冷。

2)在冰上，加入ReverTra Ace qRCR RT Master Mix 4μl，将反应液轻轻混匀，并离心。

3)按如下程序进行

顶盖温度：LID＝104℃，

逆转录反应：37℃15min,50℃5min,

酶失活反应：98℃5min,

冷却至4℃。

4)反应完成后，得到的cDNA溶液于-20℃保存，并可直接或稀释后用于PCR扩增反应。

(3)RT-PCR反应

在PCR专用管中配置如下体系，充分离心、混匀

PCR反应体系如下(总体积为20.0μl)：

将样品置于实时定量PCR仪中，并按如下程序进行，

顶盖温度:LID＝104℃，

预变性：95℃30s

扩增循环：95℃30s，58℃30s，68℃30s根据引物效率，重复25-40个循环

酶失活反应：68℃5min

冷却至4℃。

(4)检测结果

如图1所示，图1代表经过G418筛选后各转基因K562细胞株中RHD以及RHCE的表达水平的检测结果。以管家基因GAPDH为内参，通过实时定量PCR检测RHD基因的表达水平。将GAPDH的表达量设为1，同时通过与空载体转染组细胞内RHD基因5号外显子、7号外显子、10号外显子以及RHCE基因的表达量进行比较得出各转基因细胞株中RHD和RHCE基因的相对表达量；即各转基因细胞株中RHD和RHCE基因的相对表达量通过同时与GAPDH和空载体转染组内各基因表达量相比较(相除)得出。由于设计的sgRNA分别靶向RHD不同的外显子，通常靶点之前的基因编码序列表达不受影响，所以分别选择5、7、10号外显子编码区段的序列做实时定量PCR检测，获得5号外显子、7号外显子、10号外显子以及RHCE基因的表达水平，来确定不同转基因K562细胞株中RHD基因的表达情况。其中图1中横坐标代表不同的转基因K562细胞株，纵坐标代表各转基因K562细胞株的相对表达水平。从图1的结果可以看出，转基因K562细胞株2-1、5-1以及7-3可以较好的抑制RHD的表达，同时不对RHCE的表达产生影响。

如图2所示，图2为经过单细胞分选后各转基因K562细胞株中RHD及RHCE的表达水平的检测结果。将GAPDH的表达量设为1，RHD和RHCE基因的相对表达量通过与GAPDH比较(相除)得出。其中图2中横坐标代表所检测的RHD基因外显子区段或RHCE基因，纵坐标代表与GAPDH相比的相对表达量。对照为对空载体转染和筛选后检测细胞内RHD基因5号外显子、7号外显子、10号外显子及RHCE基因的相对表达水平。从图2的结果可以看出，转基因K562细胞株2-1-3、5-1-1、7-3-1(最后一位数字代表克隆编号，与设计的靶向位置编号无关)可以较好的抑制RHD的表达，同时不对RHCE的表达产生影响。

5、western blot检测RHD的表达

按照如下方法验证经过载体转染后细胞中蛋白质的表达量。

(1)蛋白提取

1)按照常规的消化步骤消化细胞，之后将细胞转移至EP管中使用1×PBS洗涤一次。

2)弃上清，使用含有1％蛋白酶抑制剂的RIPA重悬细胞，之后将EP管置于旋转混合仪上，4℃条件下裂解过夜。

3)收蛋白：将裂解后的细胞在4℃，13000rpm,条件下离心20min，之后收集上清。

4)使用紫外分光光度计进行浓度的测量。

5)根据测量浓度进行蛋白分装后，-80℃保存。

(2)配置SDS-PAGE凝胶

1)配置分离胶

不同浓度分离胶的配置成分如下表所示：

表4分离胶组分

在实验过程中使用的是12％的分离胶，配置完成后充分混匀，之后应尽快将配置好的分离胶注入1.5mm玻璃胶板的间隙中，并为浓缩胶留出空间。之后轻柔在分离胶上注满双蒸水。约20min后，待胶与水之间出现一条折光性很强的线时说明分离胶已经凝固，可以去除双蒸水，并使用吸水纸吸干水分。

2)配置积层胶

积层胶的配置常用的2ml和3ml所需的成分如下：

表5积层胶组分

配置完成后，充分混匀，并将胶灌注于分离胶之上，之后插入1.5mm的梳子，注意该过程尽量避免气泡的产生，灌胶时也要使胶沿着玻璃板流下，以免胶中产生气泡。等待大约20min后，待积层胶凝固后可进行下游实验。开始下游实验前应将梳子取出，取梳子是应用双手捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出，拔梳子的过程中要避免左右晃动，防止加样孔变形。

(3)样品制备及上样

根据蛋白样品的量，加入相应5×上样缓冲液。上样总体积为20～40μl，尽量保持上样体积一致。上样前应将样品置于沸水中煮沸5min，使蛋白变性。

上样时，应使用微量进样器吸取样品后贴壁加入加样孔中，尽量避免产生气泡。加样时速度不可过快，以防样品溢出加样孔，造成加样量不准确及样品间的交叉污染。

(4)电泳

当样品在积层胶时电压为80V，待样品进入分离胶后可将电压调整至180V，可根据Marker调整电泳结束的时间。

(5)转膜

1)切胶：将玻璃板撬开后可以进行切胶，可根据Marker来确定目的蛋白的位置，并小心将目的位置切下，置于电转液中浸泡。

2)准备硝酸纤维素膜和滤纸：根据切下的胶的大小来裁剪相应的硝酸纤维素膜和滤纸，裁剪的要求是滤纸要和胶一样大小，硝酸纤维素膜大小略大于胶。硝酸纤维素膜应先在甲醇中浸泡30秒，之后将硝酸纤维素膜和滤纸一起置于电转液中浸泡15min。

3)电转：浸泡时间到了以后，先将一张滤纸置于电转装置中，轻轻擀去气泡，之后将硝酸纤维素膜置于滤纸上，注意对齐。然后将胶置于硝酸纤维素膜上，轻轻擀去气泡，最后将滤纸置于胶上，擀去气泡后可进行电转。电转的电压和电流可根据蛋白的大小进行调整，一般使用25V，电转30～50min。

(6)免疫反应

1)封闭：电转完成后，将硝酸纤维素膜取出，置于封闭液中室温下于摇床中摇动封闭1h。

2)添加一抗：将myc和β-actin一抗分别使用封闭液按照1:500和1:1000比例稀释后与硝酸纤维素膜4℃共孵育过夜。

3)洗涤抗体：孵育过夜后，使用TBST洗涤硝酸纤维素膜，并洗涤3次，每次15min。

4)添加二抗：使用HRP标记的小鼠IgG(对应的一抗为myc)和兔IgG(对应的一抗为β-actin)按照1:2000稀释后，室温下孵育1h。

5)洗涤抗体：使用TBST洗涤硝酸纤维素膜，洗涤3次，每次15min。之后可进行化学发光反应。

(7)化学发光反应及显影定影

1)将化学发光试剂中的A和B两种试剂等体积混匀后，与硝酸纤维素膜充分接触1min，此过程应将硝酸纤维素膜正反两面均与混匀后的发光试剂充分接触。之后将膜转移至另一张干净的保鲜膜上，包好后置于X光片夹中。

2)进入暗室前应提前准备好显影液、定影液和水。进入暗室后，将胶片裁剪值合适大小并将光片置于膜上，关闭X光片夹，之后根据蛋白的量及发光信号的强度决定压片的时间。待时间到后可取出X光片，迅速浸入显影液中进行显影，待出现明显条带后，立刻终止显影，将X光片置于水中浸泡数秒后，置于定影液中进行定影。之后使用清水冲洗干净、室温下阴干。

(8)凝胶图像分析

将光片进行扫描或者拍照后，使用凝胶图像处理系统分析目标条带的光密度值。

(9)检测结果

所获得的westrern blot的检测结果如图3所示，图3中仅示出了携带sgRNA 2-1的CRISPR载体转染后蛋白质的表达水平，对照组为空载体转染组。从图3可以看出，携带sgRNA2-1的CRISPR载体转染可以有效降低RHD的表达水平。利用上述实验验证，携带sgRNA 5-1以及携带sg RNA 7-3的CRISPR载体转染也可以有效降低RHD的表达水平。

实施例2

分别利用上述sgRNA序列靶向的RHD序列(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:6)，构建sgRNA-CRISPR-Cas9载体，即上述载体2-1、5-1和7-3，然后分别将这些载体导入到已建系的商品化人胚胎干细胞中，经过单细胞克隆之后，进行扩大培养，经检测获得RH阴性干细胞。

同时参照文献1(Lu SJ,Feng Q,Park JS,Vida L,Lee BS,Strausbauch M,Wettstein PJ,Honig GR,Lanza R.Biologic properties and enucleation of redblood cells from human embryonic stem cells.Blood.2008Dec 1；112(12):4475-84.)和参考文献2(Ma F,Ebihara Y,Umeda K,Sakai H,Hanada S,Zhang H,Zaike Y,TsuchidaE,Nakahata T,Nakauchi H,Tsuji K.Generation of functional erythrocytes fromhuman embryonic stem cell-derived definitive hematopoiesis.Proc Natl Acad SciU S A.2008Sep 2；105(35):13087-92.)中记载的内容，对所获得的RH阴性胚胎干细胞进行分阶段定向诱导分化，得到RH阴性红细胞，所获得的RH阴性红细胞能够用于输血，且不会发生输血反应。

从以上实施例可以看出，本发明的完成能实现高效、特异的RHD基因敲除，在此基础上可以建立多种RHD阴性的干细胞系，进而制备出RHD阴性红细胞及血小板，克服RH阴性血型来源短缺，无法满足输血需求的问题，缓解临床供求矛盾。

在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院华南生物医药研究院

<120> sgRNA序列及利用CRISPR-Cas9技术制备RH阴性红细胞的方法

<130> PIDC3191193

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RHD序列

<400> 1

gctgtgtctc cggaaactcg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RHD序列

<400> 2

acggcattct tcctttcgat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RHD序列

<400> 3

gctgactgct acagcatagt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RHD序列

<400> 4

gggctacaac ttcagcttgc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RHD序列

<400> 5

gctgaagttg tagcccatga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RHD序列

<400> 6

gataccgtcg gagccggcaa 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 7

caccggctgt gtctccggaa actcg 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 8

aaaccgagtt tccggagaca cagcc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 9

caccgacggc attcttcctt tcgat 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 10

aaacatcgaa aggaagaatg ccgtc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 11

caccggctga ctgctacagc atagt 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 12

aaacactatg ctgtagcagt cagcc 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 13

caccggggct acaacttcag cttgc 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 14

aaacgcaagc tgaagttgta gcccc 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 15

caccggctga agttgtagcc catga 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 16

aaactcatgg gctacaactt cagcc 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 17

caccggatac cgtcggagcc ggcaa 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 18

aaacttgccg gctccgacgg tatcc 25

<210> 19

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA序列

<400> 19

gcugugucuc cggaaacucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 20

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA序列

<400> 20

acggcauucu uccuuucgau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 21

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA序列

<400> 21

gcugacugcu acagcauagu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 22

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA序列

<400> 22

gggcuacaac uucagcuugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 23

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA序列

<400> 23

gcugaaguug uagcccauga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 24

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA序列

<400> 24

gauaccgucg gagccggcaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

Claims

1.一种RH阴性干细胞的制备方法，其特征在于，包括：

将表达载体导入到干细胞中，筛选单细胞克隆，扩大培养获得RH阴性干细胞，所述表达载体含有SEQ ID NO:1所示核酸序列，所述表达载体能够编码sgRNA序列，所述sgRNA序列为SEQ ID NO:19所示的核酸序列，

所述干细胞选自商品化胚胎干细胞、诱导多能干细胞或者造血干/祖细胞中的至少一种。

2.一种RH阴性红细胞的制备方法，其特征在于，包括：

获得RH阴性干细胞；

利用RH阴性干细胞进行诱导分化，获得经诱导分化的RH阴性红细胞；

对所述经诱导分化的RH阴性红细胞进行脱核培养，获得成熟的RH阴性红细胞，

其中，所述RH阴性干细胞通过权利要求1所述的制备方法获得。

3.根据权利要求2所述的RH阴性红细胞的制备方法，其特征在于，利用分化培养基对所述RH阴性干细胞进行所述诱导分化，所述分化培养基包括StemSpan无血清培养基、人促红细胞生成素(EPO)、干细胞生长因子(SCF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转铁蛋白、地塞米松(Dex)和L-谷氨酰胺。

4.根据权利要求2所述的RH阴性红细胞的制备方法，其特征在于，利用脱核培养基对所述经诱导分化的RH阴性红细胞进行脱核培养，所述脱核培养基包括RPMI1640无血清培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素，肝素、血浆和血清。