CN111254110A - 一种将间充质干细胞转分化为精子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的一种将间充质干细胞转分化为精子的方法，其具体的步骤为：将转录因子FOXO1通过转染的方式导入间充质干细胞，培养得到稳转株后，将培养基换成诱导培养基继续进行诱导培养得到精子。该方法将转录因子FOXO1导入间充质干细胞，并使用诱导培养基诱导其往精子方向发展，会使男性生殖细胞不同阶段的基因表达量提高。因此，该方法不仅有助于了解干细胞对机体生命活动的调控机制，探讨维持精原干细胞SSCs动态平衡的信号通路，而且给男性不育，尤其是男性无精症患者的治疗带来一种新的遗传自己生物学信息的方案。

Description

一种将间充质干细胞转分化为精子的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种将间充质干细胞转分化为精子的方 法。
背景技术
不孕不育症是全球性的医学和社会问题，全球约有10％-15％的育龄夫妻罹 患不孕不育症，其中男性因素又占比约50％。世界卫生组织预言不育症、癌症、 心血管疾病将成为21世纪危害人类健康最严重的三大疾病。
近年来随着药物治疗的进展及辅助生育技术(Assisted reproductivetechology， ART)的推广与成熟，很多不孕不育夫妇圆了成为父母的梦想。然而，很多不育症的男性患者并没能得到根本上的治疗，同时还有相当一部分不育症患者无法通 过传统的药物治疗或ART来解决生育问题，究其原因是这部分患者自身不能产 生具有正常功能的生殖细胞或健全的单倍体精子细胞。
因此，研究精子发生发展过程中相关分子的调控机制，寻找患者自身来源的 间充质干细胞使其发育成有功能性的生殖细胞用于男性不育症的精准治疗，是目 前男性不育治疗的研究热点。
现有的研究结果已证明：间充质干细胞具有分化为男性生殖细胞的能力，目 前多种不同的培养条件或者诱导方案可促使间充质干细胞往SSCs方向转分化。
间充质干细胞经视黄酸诱导、与睾丸支持细胞共培养或移植到不育小鼠曲细 精管内均能表达男性生殖细胞早期标记，但无法启动减数分裂。间充质干细胞重 编程成为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSCs)，经BMP4诱 导后能表达减数分裂的相关标记，但细胞分化效率低下，无法检测到下游的基因 表达，尚未获得成熟的精子。含有维甲酸和睾酮的睾丸细胞条件培养基中培养的 间充质干细胞发生了形态学改变，并表达了Oct-4、α6整合素、Stella、C-kit和 VASA等生殖细胞标志物。人脐带间充质干细胞、人羊膜上皮细胞和绒毛膜板胎 盘细胞共同培养，并添加骨形态发生蛋白4(BMP4)及视黄酸(RA)加以诱导 培养得到蝌蚪样形状的精原细胞样细胞。在间充质干细胞与Sertili细胞体外共培 养的实验中，我们得到了类似精原干细胞样的圆形细胞团，并且表达少数的生殖细胞标记。用BMP4将间充质干细胞诱导成拟胚体(EB)，再从EB培养出增 殖减慢的圆形的细胞，表达SSEA-1和PRDM1等PGC的特异性标记，再筛选出 SSEA-1+的细胞，铺于小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上与BMP4诱导培养，细胞 形态改变成精子样，且表达雄性生殖细胞标记物PLZF、GFRa1、DMRT1等， 免疫荧光显示顶体素Acrosin阳性。
综上所述，在目前已存在的多种不同的可促使间充质干细胞往SSCs方向转 分化的培养条件或者诱导方案中，所能检测到的标记仅限于男性生殖细胞的早期 标记，尚未检测到细胞进入减数分裂阶段的标记，也未能获得发育成熟的具有功 能的男性生殖细胞。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种将间充质干细胞转分化为精子的方 法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的一种将间充质干细胞转分化为精子的方法，其包括如下步骤：
步骤一，将转录因子FOXO1通过转染的方式导入间充质干细胞，并对转染 后的所述间充质干细胞进行培养；
步骤二，培养得到稳转株后，将培养基换成诱导培养基继续进行诱导培养得 到精子；
其中，诱导培养基的配制方法为：基础培养基为DMEM/F-12，使用前添加 15％FBS、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM 2-巯基乙醇、10ng/ml 白细胞抑制因子、10ng/ml胶质细胞源性神经营养因子、10ng/ml碱性成纤维细 胞生长因子、10ng/mL重组人干细胞因子和2μM视黄酸。
进一步地，将上述转录因子FOXO1通过慢病毒转染的方式导入所述间充质 干细胞，包括如下步骤：
步骤一，计算每孔加入携带有FOXO1基因的慢病毒的添加量，然后将所述 慢病毒加入含有间充质干细胞的培养基中，再添加促转染剂，进行转染；
步骤二，转染一段时间且细胞已较好地恢复后，去掉原培养基，换用筛选培 养基进行筛选培养一段时间，获得稳定细胞株。
进一步优选地，步骤一中的促转染剂为聚凝胺。
进一步优选地，步骤二中的筛选培养基为含有潮霉素B的培养基。
进一步地，将上述转录因子FOXO1通过电转染的方式导入间充质干细胞， 包括如下步骤：
步骤一，选取在对数生长期的间充质干细胞进行消化、冲洗、重悬计数后， 和携带FOXO1基因的质粒混合加入电转杯中；
步骤二，将电转杯置于电转杯架上，设置电转染参数进行转染。
进一步地，将所述转录因子FOXO1通过脂质体转染的方式导入间充质干细 胞，包括如下步骤：
步骤一，将含有脂质体的混合液A与含有FOXO1基因质粒的混合液B进 行充分混合，形成含有DNA-脂质体复合物的转染混合液；
步骤二，将间充质干细胞加入转染混合液中，在细胞培养箱中进行培养7-9h；
步骤三，培养后，换上含有FBS的间充质干细胞培养基，再置于细胞培养 箱继续孵育至转染完成。
进一步优选地，步骤一中混合液A还包括Opti-MEM培养基。
进一步优选地，步骤一中所述混合液B还包括Opti-MEM培养基和增强剂。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的一种将间充质干细胞转分化为精子的方法将转录因子FOXO1 导入间充质干细胞，并使用诱导培养基诱导其往精子方向发展，会使男性生殖细 胞不同阶段的基因表达量提高。因此，该方法不仅有助于了解干细胞对机体生命 活动的调控机制，探讨维持精原干细胞SSCs动态平衡的信号通路，而且给男性 不育，尤其是男性无精症患者的治疗带来一种新的遗传自己生物学信息的方案。
附图说明
图1为本发明一验证实验中过表达FOXO1的间充质干细胞的形态学结果图；
图2为本发明一验证实验中原始生殖细胞相关标记基因的表达量统计结果 图；
图3为本发明一验证实验中精原干细胞相关标记基因的表达量统计结果图；
图4为本发明一验证实验中减数分裂相关标记基因的表达量统计结果图；
图5为本发明一验证实验中精子相关标记基因的表达量统计结果图；
图6为本发明一验证实验中FISH结果图；
图7为本发明一验证实验中原始生殖细胞(PGC)特异性标记OCT4、SOX17 的RT-PCR的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种将间充质干细胞转分化为精子的方法，其包括如下步骤：
步骤一，将转录因子FOXO1通过转染的方式导入间充质干细胞，并对转染 后的所述间充质干细胞进行培养；
步骤二，培养得到稳转株后，将培养基换成诱导培养基继续进行诱导培养得 到精子；
其中，诱导培养基的配制方法为：基础培养基为DMEM/F-12，使用前添加 15％FBS、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM 2-巯基乙醇、10ng/ml 白细胞抑制因子、10ng/ml胶质细胞源性神经营养因子、10ng/ml碱性成纤维细 胞生长因子、10ng/mL重组人干细胞因子和2μM视黄酸。
在一优选的实施例中，将上述转录因子FOXO1通过慢病毒转染的方式导入 所述间充质干细胞，包括如下步骤：
步骤一，计算每孔加入携带有FOXO1基因的慢病毒的添加量，然后将所述 慢病毒加入含有间充质干细胞的培养基中，再添加聚凝胺，进行转染；
步骤二，转染一段时间且细胞已较好地恢复后，去掉原培养基，换用含有潮 霉素B的培养基进行筛选培养一段时间，获得稳定细胞株。
在一优选的实施例中，将上述转录因子FOXO1通过电转染的方式导入间充 质干细胞，包括如下步骤：
步骤一，选取在对数生长期的间充质干细胞进行消化、冲洗、重悬计数后， 和携带FOXO1基因的质粒混合加入电转杯中；
步骤二，将电转杯置于电转杯架上，设置电转染参数进行转染。
在一优选的实施例中，将所述转录因子FOXO1通过脂质体转染的方式导入 间充质干细胞，包括如下步骤：
步骤一，将含有脂质体的混合液A与含有FOXO1基因质粒的混合液B进 行充分混合，形成含有DNA-脂质体复合物的转染混合液；
步骤二，将间充质干细胞加入转染混合液中，在细胞培养箱中进行培养7-9h；
步骤三，培养后，换上含有FBS的间充质干细胞培养基，再置于细胞培养 箱继续孵育至转染完成。
在一优选的实施例中，步骤一中混合液A还包括Opti-MEM培养基；步骤 一中所述混合液B还包括Opti-MEM培养基和增强剂。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发 明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
本实施例提供转录因子FOXO1通过慢病毒转染的方式导入所述间充质干细 胞的方法，包括如下步骤：
1.慢病毒转染预实验：
选用绿色荧光对照慢病毒(rLV-ZsGreen对照慢病毒)感染HuMSCs，观察 细胞的感染效率，并寻找最适宜的感染条件。
(1)准备目的细胞
1)将T75瓶中已增殖至80％-90％的HuMSCs用0.05％胰酶消化，显微镜下 观察细胞消化收缩快至圆状时，立即添加含10％FBS的完全培养基终止消化， 收集细胞至15mL离心管中。
2)离心1000rpm，5min，去上清，加新鲜完全培养基轻轻吹散细胞，血球 计数板计数，制成3-5×104cells/mL细胞悬液，接种到培养板中继续培养保证感 染时铺板量达到30％左右。
(2)目的细胞慢病毒感染
1)根据公式计算慢病毒用量：每孔加病毒量(μl)＝MOI值×细胞数/病毒原 液滴度(TU/ml)×103。
2)确保感染前细胞状态良好，约20h后以不加慢病毒，以及MOI值分别为 20、40、60、80、100的ZsGreen对照慢病毒转染HuMSCs，每组均设置2-3个 复孔，并添加1mg/mL的polybrene促转染剂，使每孔的终浓度为5μg/mL。
3)感染24h后弃掉原培养液，加入新鲜的培养基，并于荧光显微镜下观察 转染效果。
2.FOXO1过表达HuMSCs的构建
(1)以最适宜感染条件感染目的细胞，步骤同前。
(2)细胞感染48h后，此时细胞已较好地恢复，去掉原培养液，换用含潮 霉素B的培养基筛选细胞，用DPBS洗一次，加入终浓度200ug/mL的潮霉素B 筛选培养基，进行筛选培养。
(3)每天观察细胞，对比病毒转染组和对照组细胞的生长状况，以此为根 据每2-3天更换一次筛选培养基(200ug/mL Hygromycin B)，如细胞状态受到 严重影响或有大量细胞死亡时，可以把潮霉素B的浓度减至50-100ug/mL使细 胞状态稍恢复，之后再换为增加筛选浓度进行筛选，如此反复筛选，筛选7-10d 左右。
(4)冻存稳定细胞株。
实施例2
本实施例提供转录因子FOXO1通过电转染的方式导入所述间充质干细胞的 方法，包括如下步骤：
(1)选取3-5代的HuMSCs确保其在对数生长期(因为对数生长期的细胞 分裂旺盛，表面结构致密性较差，细胞电转染后，外源DNA更容易进入处于有 丝分裂期的细胞)，用胰蛋白酶消化细胞，终止消化后收集细胞；1000g离心5 分钟，弃去上清，加入EP buffer，重悬细胞后，继续离心，并用EP buffer冲洗 2-3次，最后重悬细胞，反复冲洗是为了有效清洗细胞表面的血清，防止降低转 染效率，但冲洗过程注意轻柔，避免损伤细胞。
(2)细胞计数，取10-20μl细胞悬液，计算细胞浓度，最后一共需要细胞1 ×106/管。
(3)将上述制备的细胞与10μg携带FOXO1基因的质粒混合，动作轻柔， 避免产生气泡。
(4)根据细胞状态、质粒的浓度和质量设置电转染参数。
(5)往6孔细胞培养板加入37℃预热HuMSCs培养基，每孔2ml。
(6)向每个电转杯加入100μl细胞和质粒混合液，抽排液体注意气泡，保 证每个样品获得相同电阻值，轻轻敲击电转杯，清除混合液的气泡，然后将电转 杯置于电转杯架。
(7)测量电阻值，确保电阻值处于30-50Ω之间，开始电转染程序。
(8)取出电转杯，吸取200-300μl的6孔板中的培养基，将培养基和细胞 混合液轻轻吹打均匀，将全部混合液吸取转移至6孔板中，一次只能电转染一个 孔的细胞，一个孔的培养基对应一个电转杯。
(9)重复上述操作，进行下一个孔的电转染。
实施例3
本实施例提供转录因子FOXO1通过脂质体转染的方式导入所述间充质干细 胞的方法，包括如下步骤：
(1)将一定的HuMSCs细胞接种到6孔板中，待细胞密度为70％左右进行 转染。
(2)配制转染混合液：
混合液A：4μl-8μl Lipofectamine 3000+250μl Opti-MEM培养基；
混合液B：3μg携带FOXO1基因的质粒+6μlP3000TM+250μl Opti-MEM 培养基。
混合液C：将混合液A和混合液B充分混合，避免反复吹打，因为会破坏 DNA-脂质体复合物，降低转染效率。在室温下静置10-15分钟，形成稳定的DNA- 脂质体复合物。
(4)转染：因为饥饿细胞可以提高转染效率，向已经饥饿了1小时的细胞 加入转染混合液C，然后将细胞放于37℃细胞培养箱中继续培养8h。
(5)换液：转染8h后，换上含有FBS的HuMSCs培养基，并置于细胞培 养箱继续孵育48h，待转染完毕，可以进行下一步实验。
验证实验
将实施例1-3得到稳定表达FOXO1的细胞株进行诱导培养，利用单细胞测 序检测不同时间段细胞基因的表达水平；利用荧光杂交技术(FISH)检测是否 存在单倍体细胞；利用RT-qPCR检测精子发生不同阶段的特异性标记物的 mRNA表达水平；用Western Blot检测精子发生不同阶段的特异性标记物的蛋白 表达水平，具体的实施步骤如下：
单细胞测序
利用10x Genomics ChromiumTM系统，将带有序列标签的Gel Bead、样本 和试剂预混液、油加载到各自的进样通道，通过微流体通道网络形成的“双十字” 交叉系统，最终形成由油滴包裹的单细胞微反应体系GEMs。
(1)细胞准备
对单细胞悬液进行质检和计数，一般要求细胞存活率在80％以上，将检测合 格的细胞经洗涤、重悬制备成合适的细胞浓度700～1200cells/μl，以备进行10x GenomicsChromiumTM系统上机操作。
(2)GEM生成和标签化
根据预期获得的目的细胞数目上样，构建GEMs(Gel Bead in Emμlsion)进 行单细胞分离，GEMs正常形成后，收集GEMs在PCR仪中进行反转录实现标 签化。
(3)Post GEM-RT纯化和cDNA扩增
对GEMs破油处理，用磁珠纯化富集一链cDNA，然后进行cDNA扩增和质 检。
(4)文库构建和定量
将质检合格的cDNA进行二代测序文库构建，经片段化、连接测序接头、 样本IndexPCR等实验过程，最终对文库定量质检。
(5)上机测序
对构建完成的文库测序，使用Illumina Hiseq或NovaSeq平台，采用PE150 测序模式，建议测序量达到50k reads/cell及以上。
FISH
1、样品处理
(1)向样品中加入10ml新鲜固定液(3:1的甲醇：冰醋酸)，用移液枪或 吸管用力吹打混匀，室温静止10分钟；
(2)2000×g离心5分钟。
(3)除去上清，剩余约200μl加入0.5～1ml的新鲜固定液，吹打混匀。
(4)将离心管内悬液全部滴加到干净的载玻片上(65℃)，烤片30分钟；
2、玻片预处理
(1)玻片放入37±1℃的1×PBS中孵育5分钟；
(2)取出玻片，再将其放入37±1℃胃蛋白酶溶液中消化5分钟；
(3)取出玻片，再将其放入1×PBS室温洗涤3分钟；
(4)取出玻片，再将其放入1％多聚甲醛/PBS室温固定10分钟；
(5)取出玻片，再将其放入1×PBS室温洗涤3分钟；
(6)取出玻片，再将其放入1×PBS室温洗涤3分钟；
(7)取出玻片，再将其放入70％、85％、100％梯度乙醇脱水各3分钟；
(8)取出玻片，室温晾干玻片；
3、样品和探针同时变性，37度杂交孵育
(1)从试剂盒中取出杂交液(探针)震荡混匀，瞬时离心；
(2)加10μl的杂交液到载玻片上，迅速盖上盖玻片，后轻压盖玻片使杂交 液均匀分布，避免产生气泡(如果有气泡轻压盖玻片挤出，气泡可能导致杂交失 败)。

Claims (8)

1.一种将间充质干细胞转分化为精子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将转录因子FOXO1通过转染的方式导入间充质干细胞，并对转染后的所述间充质干细胞进行培养；
步骤二，培养得到稳转株后，将培养基换成诱导培养基继续进行诱导培养得到所述精子；
其中，所述诱导培养基的配制方法为：基础培养基为DMEM/F-12，使用前添加15％FBS、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM 2-巯基乙醇、10ng/ml白细胞抑制因子、10ng/ml胶质细胞源性神经营养因子、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10ng/mL重组人干细胞因子和2μM视黄酸。
2.根据权利要求1所述的一种将间充质干细胞转分化为精子的方法，其特征在于，将转录因子FOXO1通过慢病毒转染的方式导入所述间充质干细胞，包括如下步骤：
步骤一，计算每孔加入携带有FOXO1基因的慢病毒的添加量，然后将所述慢病毒加入含有间充质干细胞的培养基中，再添加促转染剂，进行转染；
步骤二，转染一段时间且细胞已较好地恢复后，去掉原培养基，换用筛选培养基进行筛选培养一段时间，获得稳定细胞株。
3.根据权利要求2所述的一种将间充质干细胞转分化为精子的方法，其特征在于，步骤一中所述促转染剂为聚凝胺。
4.根据权利要求2所述的一种将间充质干细胞转分化为精子的方法，其特征在于，步骤二中所述筛选培养基为含有潮霉素B的培养基。
5.根据权利要求1所述的一种将间充质干细胞转分化为精子的方法，其特征在于，将所述转录因子FOXO1通过电转染的方式导入所述间充质干细胞，包括如下步骤：
步骤一，选取在对数生长期的间充质干细胞进行消化、冲洗、重悬计数后，和携带FOXO1基因的质粒混合加入电转杯中；
步骤二，将步骤一所述的电转杯置于电转杯架上，设置电转染参数进行转染。
6.根据权利要求1所述的一种将间充质干细胞转分化为精子的方法，其特征在于，将所述转录因子FOXO1通过脂质体转染的方式导入所述间充质干细胞，包括如下步骤：
步骤一，将含有脂质体的混合液A与含有FOXO1基因质粒的混合液B进行充分混合，形成含有DNA-脂质体复合物的转染混合液；
步骤二，将所述间充质干细胞加入所述转染混合液中，在细胞培养箱中进行培养7-9h；
步骤三，培养后，换上含有FBS的间充质干细胞培养基，再置于细胞培养箱继续孵育至转染完成。
7.根据权利要求6所述的一种将间充质干细胞转分化为精子的方法，其特征在于，步骤一中所述混合液A还包括Opti-MEM培养基。
8.根据权利要求6所述的一种利用光照诱导提高液体发酵木霉菌产孢量的方法，其特征在于，步骤一中所述混合液B还包括Opti-MEM培养基和增强剂。
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