CN114854739B - 一种细胞外基质及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞外基质及其制备方法和应用。所述细胞外基质由过表达硫酸乙酰肝素糖蛋白的工程化细胞制备得到，所述工程化细胞含有基因过表达系统，所述基因过表达系统包括靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA的表达载体和CAS9蛋白的表达载体。所述细胞外基质中硫酸乙酰肝素糖蛋白和纤维连接蛋白的含量均较高，且对碱性纤维母细胞生长因子等活性因子具有富集作用，能够有效促进细胞生长、分化。
Description
技术领域
本发明属于生物材料与组织工程技术领域，涉及一种细胞外基质及其制备方法和应用。
背景技术
细胞外基质是细胞天然生长微环境，由细胞合成与分泌的胶原蛋白、非胶原蛋白以及蛋白聚糖等生物大分子沉积于细胞外并围绕在机体组织中，在细胞表面或细胞之间形成复杂的网络结构。细胞外基质不仅可以发挥结构及机械支撑的作用，同时还可以结合并调控细胞因子与生长因子信号，在细胞粘附、细胞增殖、细胞迁移、细胞周期与细胞命运决定过程中发挥重要调控作用，且能够调控组织发育、机体稳态的建立与维持，被广泛应用于细胞培养和组织工程等领域。
现有技术中常从小鼠肉瘤的基底膜中分离纯化制备细胞外基质，亦有研究采用基因修饰方法在细胞中引入表达活性因子的基因片段，以制备富含活性因子的细胞外基质，如CN112138212A公开了一种活性细胞外基质、含有活性细胞外基质的组合物、3D组织修复支架及制备方法和应用，该技术方案通过在细胞内预先导入表达活性因子的基因片段并进行体外细胞培养获得含有活性因子的细胞外基质，但目前对细胞进行基因编辑的手段主要是利用构建慢病毒载体或腺相关病毒载体，将相应病毒载体感染目的细胞，提高特定基因或蛋白的表达水平。然而，利用慢病毒或腺相关病毒过表达载体进行提高特定蛋白高表达的局限性在于病毒过表达载体均具有一定的基因容量限制，一般小于5000bp，基因表达效率低，能够过表达的活性因子的种类有限，且通常仅能针对一种活性因子。
综上所述，提供一种制备富含多种活性因子的细胞外基质的方法，对于生物材料和组织工程领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种细胞外基质及其制备方法和应用，所述细胞基质由过表达硫酸乙酰肝素糖蛋白的细胞制备得到，富含多种活性因子。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA，所述sgRNA包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
SEQ ID NO:1：
GGGCGGAACCTGGTCTTGTG。
SEQ ID NO:2：
CTCCTGAACTTGGCGCCTCG。
SEQ ID NO:3：
TGGCTAAATGTTTGGAGGTG。
本发明中，所述靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA能够结合硫酸乙酰肝素糖蛋白的基因启动子区域，引导调控因子调控硫酸乙酰肝素糖蛋白基因的表达。
第二方面，本发明提供一种基因过表达系统，所述基因过表达系统包括第一方面所述的靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA的表达载体。
所述基因过表达系统还包括CAS9蛋白的表达载体。
本发明中，所述基因过表达系统能够通过sgRNA结合硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域，并通过具有促进基因转录的突变型CAS9蛋白和多个转录促进分子，内源性提高硫酸乙酰肝素糖蛋白基因mRNA表达量。
优选地，所述靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA的表达载体包括慢病毒，所述慢病毒中含有第一方面所述sgRNA的核酸序列。
优选地，所述CAS9蛋白的表达载体包括含有CAS9蛋白的核酸序列的慢病毒。
第三方面，本发明提供一种工程化细胞，所述工程化细胞含有第二方面所述的基因过表达系统。
本发明中，所述工程化细胞含有所述基因过表达系统，能够过表达硫酸乙酰肝素糖蛋白。硫酸乙酰肝素糖蛋白是细胞外基质中主要的蛋白聚糖，由核心蛋白与硫酸乙酞肝素糖链以共价键方式连接。硫酸乙酞肝素糖链上具有一些分子功能结合域，能够结合多种活性因子，如生长因子和趋化因子等。同时，硫酸乙酰肝素糖蛋白可以作为蛋白酶的受体或蛋白酶抑制剂，调节其携带细胞因子的空间分布和活性。因此，使用所述工程化细胞制备细胞外基质，能够提高细胞外基质中活性因子的种类和含量。
优选地，所述工程化细胞的野生型细胞包括哺乳动物胚胎成纤维细胞。
优选地，所述哺乳动物胚胎成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。
第四方面，本发明提供一种细胞外基质的制备方法，所述制备方法包括：
使用第三方面所述的工程化细胞制备细胞外基质。
作为优选的技术方案，所述细胞外基质的制备方法包括以下步骤：
(1)将第二方面所述的基因过表达系统导入哺乳动物胚胎成纤维细胞，获得工程化细胞；
(2)培养所述工程化细胞，诱导其分泌细胞外基质成分至细胞外空间，随后进行去细胞处理，获得所述细胞外基质。
该细胞外基质通过硫酸乙酰肝素糖蛋白富集多种生物活性成分。
第五方面，本发明提供一种细胞外基质，所述细胞外基质由第四方面所述的细胞外基质的制备方法制备得到。
优选地，所述细胞外基质可作为活性因子的载体。
优选地，所述活性因子包括细胞因子、生长因子、化学因子或趋化因子中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述活性因子为碱性纤维母细胞生长因子。
第六方面，本发明提供如第一方面所述的靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA、第二方面所述的基因过表达系统、第三方面所述的工程化细胞或第五方面所述的细胞外基质在细胞培养或组织工程中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA能够结合硫酸乙酰肝素糖蛋白的基因启动子区域，引导调控因子调控硫酸乙酰肝素糖蛋白基因的表达；
(2)本发明的基因过表达系统能够通过sgRNA结合硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域，并通过具有促进基因转录功能的突变型CAS9蛋白和多个转录促进分子，内源性提高硫酸乙酰肝素糖蛋白基因mRNA的表达量；
(3)本发明的工程化细胞含有基因过表达系统，能够过表达硫酸乙酰肝素糖蛋白，从而使得细胞外基质中富含多种活性因子；
(4)本发明的细胞外基质含有高含量的硫酸乙酰肝素糖蛋白和纤维连接蛋白，对碱性纤维母细胞生长因子等活性因子有富集作用，能够有效促进神经干细胞生长、分化。
附图说明
图1为sgRNA-MS2-P65-HSF1慢病毒质粒图谱；
图2为dCAS9-VP64慢病毒质粒图谱；
图3为工程化细胞中硫酸乙酰肝素糖蛋白的mRNA表达结果；
图4为工程化细胞Western blotting分析结果；
图5为细胞外基质Western blotting分析结果；
图6为细胞外基质中碱性纤维母细胞生长因子浓度；
图7A为由实施例6制备的细胞外基质培养的神经干细胞图；
图7B为由阴性对照小鼠胚胎成纤维细胞制备的细胞外基质培养的神经干细胞图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例设计并合成靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA，所述sgRNA的序列(命名为sgRNA-2)如SEQ ID NO:1所示。
所述sgRNA的制备方法包括：
设计并合成sgRNA序列，在sgRNA两端加入BsmBI位点切割后产生的互补粘末端，把合成的sgRNA序列溶解于退火缓冲液中，95℃水浴15min，然后自然冷却至室温，将退火产物稀释200倍后使用。
实施例2
本实施例设计并合成靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA，所述sgRNA的序列(命名为sgRNA-3)如SEQ ID NO:2所示。
所述sgRNA的制备方法与实施例1相同。
实施例3
本实施例设计并合成靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA，所述sgRNA的序列(命名为sgRNA-4)如SEQ ID NO:3所示。
所述sgRNA的制备方法与实施例1相同。
实施例4
本实施例制备靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA的表达载体。
所述表达载体的制备方法为将实施例1-3制备的sgRNA分别构建到sgRNA-MS2-P65-HSF1慢病毒质粒(图谱如图1所示)中，具体包括以下步骤：
(1)酶切反应体系如表1所示，酶切条件为37℃酶切3h；
表1
连接反应体系如表2所示，连接条件为16℃酶切3h。
表2
| 试剂 | 用量 |
| 线性化的载体DNA(50ng/μL) | 2μL |
| 实施例1/实施例2/实施例3退火产物 | 0.5μL |
| 10×T4 Buffer | 1μL |
| pEG4000 | 1μL |
| T4 DNA Ligase | 1μL |
| ddH2O | 补至10μL |
(2)取TOP10感受态(100μL)置于冰上，待其融化完全后加入10μL上述连接反应体系，轻弹管壁以混匀，在冰中静置30min，42℃水浴热激90s，快速将感受态转移到冰上，冰浴2～5min，随后每管加入500μL LB培养基(可先用水浴将培养基加热至37℃)，然后将感受态转移到37℃摇床中，恒温培养1h。
5000rpm离心1min，去除500μL上清液后吹打混匀，均匀涂布在Amp抗性的LB固体培养基上，倒置平皿，于37℃恒温培养箱中培养过夜，次日，进行菌落PCR鉴定，连入sgRNA片段的阳性克隆可得到大小为343bp的条带，选取阳性克隆测序。
实施例5
本实施例提供一种工程化细胞，所述工程化细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)将实施例4中的阳性菌落加入20mL LB液体培养基中，加入20μL 100mg/mL氨苄西林，37℃恒温摇床180rpm孵育12～16h，根据质粒提取说明书提取质粒，并检测其质量与浓度，获得sgRNA-2-MS2-P65-HSF1慢病毒质粒、sgRNA-3-MS2-P65-HSF1慢病毒质粒和sgRNA-4-MS2-P65-HSF1慢病毒质粒；
(2)体外培养293T细胞，待细胞融合度达到80％左右进行质粒转染，转染前20min，更换无血清培养基；将质粒与转染试剂加入1.5mL EP管中吹打混匀；将混合物滴加到293T细胞表面，8h更换正常培养基；转染48h后培养基呈清亮的黄色，收集上清毒液，1000rpm离心5min，取上清，得到sgRNA-2-MS2-P65-HSF1慢病毒、sgRNA-3-MS2-P65-HSF1慢病毒和sgRNA-4-MS2-P65-HSF1慢病毒，-80℃保存或直接使用；
(3)取E13.5C57BL/6小鼠，无菌条件下打开腹腔，取出子宫并用眼科剪去除子宫系膜和结缔组织，剥离子宫，将子宫放入含有PBS的一次性无菌培养皿中，漂2～3次除去淤血，用眼科剪和镊子去除胎盘、羊膜等胚胎外组织，去除胚胎放入另一平皿中，用PBS清洗至没有血迹为止，去除胚胎的头部、四肢及内脏，保留躯干部，将躯干部放入平皿中，用PBS清洗1次，将胚胎躯干部剪碎成糊状，加入PBS混匀，移入离心管中，自然沉降3min后将上清液轻轻吸除；
加入0.05％胰蛋白酶轻轻吹打，室温消化3min；自然沉降后将上清液轻轻吸出丢弃，加入0.125％胰蛋白酶轻轻吹打，室温消化5min，将上部的单细胞悬液轻轻吸出移至另一离心管中，加等量完全培养基终止消化，细胞悬液过44μm筛网，1000rpm离心5min，弃上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞，计数后按5×106细胞接种至25cm2细胞培养瓶中，得到小鼠胚胎成纤维细胞；
(4)用完全培养基稀释制备密度为4×104个/mL的小鼠胚胎成纤维细胞悬液，接种到6孔细胞培养板中，培养16～24h，至细胞融合度为20～30％；
更换培养基并加入相应的转染增强液，根据细胞MOI及病毒滴度，加入dCAS9-VP64慢病毒(dCAS9-VP64慢病毒质粒图谱如图2所示)，病毒量计算公式：病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度，继续培养12～16h，更换为常规培养基，继续培养；
感染约72h后，加入含2μg/mL Puromycin的培养基，继续培养，根据死细胞数量，更换含Puromycin的培养基，继续培养，获得dCAS9-VP64转染小鼠胚胎成纤维细胞；
(5)用完全培养基稀释制备密度为4×104个/mL的dCAS9-VP64转染小鼠胚胎成纤维细胞悬液，接种到6孔细胞培养板中，培养16～24h，至细胞融合度为20～30％；
更换培养基并加入相应的转染增强液，根据细胞MOI及病毒滴度，分别加入sgRNA-2-MS2-P65-HSF1慢病毒、sgRNA-3-MS2-P65-HSF1慢病毒和sgRNA-4-MS2-P65-HSF1慢病毒，病毒量计算公式：病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度，继续培养12～16h，更换为常规培养基，继续培养；
感染约72h后，加入含200μg/mL G418的培养基，继续培养，根据死细胞数量，更换含G418的培养基，继续培养，获得所述工程化细胞。
实施例6
本实施例提供一种细胞外基质，所述细胞外基质的制备方法包括以下步骤：
(1)将0.3％明胶加入细胞培养皿中，37℃孵育过夜，回收明胶溶液，将培养皿置于超净工作台，紫外通风吹干，使用前使用PBS清洗2次，备用；
(2)将实施例5制备的工程化细胞(含有sgRNA-2)接种至明胶预包被的细胞培养皿中，置于37℃、5％CO2培养；
(3)待细胞融合度达到100％后，将培养基置换为细胞外基质诱导培养基：15％胎牛血清+100μg/mL抗环血酸钠+50μg/mL抗环血酸+1％青霉素，每隔1天更换细胞外基质诱导培养基1次，连续培养12天；
(4)移除细胞外基质诱导培养基，使用无菌水清洗2次，再加入无菌水，于37℃处理20min，随后置换为去细胞液：50nM NH4OH、1％Triton X-100和10％脱氧胆酸钠，37℃处理60min，使用无菌水清洗2次，得到所述细胞外基质。
试验例1
本试验例鉴定实施例5制备的3种工程化细胞(分别含有sgRNA-2、sgRNA-3和sgRNA-4)中硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG2)的表达。
提取上述工程化细胞的总RNA与总蛋白，使用real-time PCR技术检测硫酸乙酰肝素糖蛋白的mRNA表达水平，为排除假阳性结果，分别使用三组不同引物进行分析；使用Western blotting技术检测硫酸乙酰肝素糖蛋白表达水平；以空载的sgRNA-MS2-P65-HSF1慢病毒转染的小鼠胚胎成纤维细胞作为阴性对照(NC)。
real-time PCR结果如图3所示，转染sgRNA-2、sgRNA-3和sgRNA-4表达载体的工程化细胞均能高表达硫酸乙酰肝素糖蛋白mRNA，即能高表达硫酸乙酰肝素糖蛋白，不同引物测试结果相近，表明结果准确性高，此外，转染sgRNA-2表达载体的工程化细胞的硫酸乙酰肝素糖蛋白表达量最高。
Western blotting检测结果如图4所示，转染sgRNA-2、sgRNA-3和sgRNA-4表达载体的工程化细胞的蛋白条带均较粗且颜色较深，说明蛋白浓度较高，表明本发明成功构建了高表达硫酸乙酰肝素糖蛋白的工程化细胞。
试验例2细胞外基质鉴定
通过Western blotting技术、免疫荧光标记技术分析实施例6制备的细胞外基质(由过表达HSPG-2工程化细胞获得的细胞外基质，ECMHSPG-2)，分析硫酸乙酰肝素糖蛋白浓度，利用Elisa技术，以碱性纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)为例，分析细胞外基质对活性因子的富集效果，以由阴性对照小鼠胚胎成纤维细胞获得的细胞外基质为对照(ECMNC)。
细胞外基质中硫酸乙酰肝素糖蛋白浓度结果如图5所示，可知，本发明制备的细胞外基质不仅含有高含量的硫酸乙酰肝素糖蛋白，纤维连接蛋白(Fibronectin)的含量也较高。
由图6可知，本发明制备的细胞外基质能够富集碱性纤维母细胞生长因子。
试验例3
使用实施例6制备的细胞外基质培养神经干细胞，取孕14天Bclb/c小鼠一只，处死后取其子宫至洁净培养皿中，将胚胎从子宫中取出，取胚胎头部至另一洁净培养皿，剪开头部皮肤及颅骨，取大脑至另一洁净培养皿中，于体式显微镜下除去其脑膜组织与脑髓，取其皮层与海马组织移至15mL离心管中，加入1mL Accutase，37℃孵育消化5min，移液器轻轻吹打至明显组织块消失，过44μm筛网至另一洁净15mL离心管中，1000rpm离心3min，移除上清液，加入5mL含有实施例6制备的细胞外基质的新鲜增殖培养基，轻轻重悬细胞至25cm2培养瓶中，轻轻混匀后，显微镜观察，置于培养箱中培养。以由阴性对照小鼠胚胎成纤维细胞获得的细胞外基质为对照，培养7天后观察神经干细胞形态，结果如图7A和7B所示。
由图7A和7B可知，由实施例6制备的细胞外基质培养的神经干细胞形态上更趋向于神经元，表明本发明的细胞外基质富含活性因子，能够有效促进细胞生长、分化。
综上所述，本发明通过高表达硫酸乙酰肝素糖蛋白的工程化细胞制备细胞外基质，所述细胞外基质中硫酸乙酰肝素糖蛋白和纤维连接蛋白的含量均较高，且对碱性纤维母细胞生长因子等活性因子具有富集作用，能够有效促进细胞生长、分化。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 一种细胞外基质及其制备方法和应用
<130> 20210201
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gggcggaacc tggtcttgtg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ctcctgaact tggcgcctcg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tggctaaatg tttggaggtg 20
Claims (10)
1.一种工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞含有基因过表达系统；
所述基因过表达系统包括靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA的表达载体；
所述基因过表达系统还包括CAS9蛋白的表达载体；
所述sgRNA包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核酸序列；
所述工程化细胞的野生型细胞为哺乳动物胚胎成纤维细胞。
2.根据权利要求1所述的工程化细胞，其特征在于，所述靶向硫酸乙酰肝素糖蛋白基因启动子区域的sgRNA的表达载体包括慢病毒，所述慢病毒中含有权利要求1中所述sgRNA的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的工程化细胞，其特征在于，所述CAS9蛋白的表达载体包括含有CAS9蛋白的核酸序列的慢病毒。
4.根据权利要求1所述的工程化细胞，其特征在于，所述哺乳动物胚胎成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。
5.一种细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
使用权利要求1-4任一项所述的工程化细胞制备细胞外基质。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将权利要求1-4任一项中所述的基因过表达系统导入哺乳动物胚胎成纤维细胞，获得工程化细胞；
(2)培养所述工程化细胞，诱导其分泌细胞外基质成分至细胞外空间，随后进行去细胞处理，获得所述细胞外基质。
7.一种细胞外基质，其特征在于，所述细胞外基质由权利要求5或6所述的细胞外基质的制备方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的细胞外基质，其特征在于，所述细胞外基质作为活性因子的载体。
9.根据权利要求8所述的细胞外基质，其特征在于，所述活性因子包括细胞因子、生长因子、化学因子或趋化因子中的任意一种或至少两种的组合。
10.如权利要求1-4任一项所述的工程化细胞或权利要求7-9任一项所述的细胞外基质在细胞培养或组织工程中的应用。
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