CN115786237A - 一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，该方法通过树鼩大脑皮层的分离、树鼩脑微血管段的富集、树鼩脑微血管段的消化分离、树鼩脑微血管内皮细胞的培养、树鼩脑微血管内皮细胞的初步纯化培养、树鼩脑微血管内皮细胞的嘌呤霉素纯化培养、可连续传代树鼩脑微血管内皮细胞的筛选等步骤获得可连续传代120代以上的树鼩脑微血管内皮细胞，且细胞保持稳定的细胞活力和均一的细胞形态，本发明方法没有端粒酶或者SV40等外源基因的引入，避免了转化细胞引起特性改变或者恶化的风险，为体外研究脑微血管内皮细胞相关疾病提供了理想的实验材料。

Description

一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法

技术领域

本发明涉及一种自发永生化的树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，属于生物技术/细胞分离培养技术领域。

背景技术

脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell, BMECs)是构成血脑屏障(Brain blood barrier, BBB)的主要成分，控制着血液和大脑之间的物质交换，在维持中枢神经系统内环境的稳定方面发挥重要作用。

BMECs同时也是强大的内分泌器官和代谢器官，有很强的合成、分泌和降解生物活性物质的功能，其异常反应与充血、出血、水肿、炎症等多种病理过程有关。

越来越多的研究证实，BMECs与脑血管疾病的发生发展、脑肿瘤的侵袭扩散、病毒感染造成的神经损伤以及神经退行性疾病等一系列病理过程密切相关。BMECs也因此被广泛应用于分子生物学、病理生理学和药理学相关研究。

树鼩是一种新型实验动物，基因组分析发现其进化关系比啮齿类更接近于人类，树鼩免疫系统的分子信号通路与人类的同源性也非常高，目前已经广泛应用于病毒感染模型、肿瘤模型、呼吸系统疾病模型和神经系统疾病模型的创建和致病机制的研究。树鼩脑微血管内皮细胞在上述疾病模型致病机制的体外研究中必不可少，但目前存在分离培养程序复杂和难以连续传代等问题，常见的细胞永生化方法也存在引入外源基因而易导致细胞转化或恶化等风险，限制了树鼩在诸多疾病致病机制研究中的深入应用。

发明内容

为了解决当前树鼩脑微血管内皮细胞分离培养复杂、难以多次传代、传代后细胞状态差异大等问题，本发明提供了一种自发永生化的树鼩脑微血管内皮细胞系的构建方法，该方法建立的细胞可连续传代120次以上，细胞活力稳定，形态均一，且无外源基因的引入，避免了细胞转化或恶化的风险，为脑血管等相关疾病的研究提供了优质可靠的实验材料。

本发明目的通过以下技术方案实现：

1、树鼩大脑皮层的分离

取新生树鼩，迅速脱颈处死，在75%酒精中浸泡消毒2-3min；在超净工作台中，用4℃预冷的含1%双抗的PBS浸洗3次；转入无菌培养皿中，无菌操作剪开头皮和颅骨，撕开大脑包膜，剪取大脑皮层，转入新的无菌培养皿中；尽量去除脑膜和肉眼可见的大血管，用4℃预冷的含1%双抗的D-Hanks液反复冲洗3-5次，剪碎，转入离心管中；

2、树鼩脑微血管段的富集

在粉碎的大脑皮层中加入消化液，37℃孵育消化40-60min，每隔20min颠倒混匀一次；消化产物经200目细胞网筛过滤，收集滤网上组织碎块，用含1%双抗的D-Hanks液重悬，离心弃上清；沉淀用含20-25%BSA的DMEM/F-12培养液重悬，4℃下离心，弃上清，得到富集的微血管段；

所述消化液为含60U/mL DNaseⅠ、2mg/mLⅡ型胶原酶、不含EDTA的0.05%胰酶的PBS溶液；

3、树鼩脑微血管段的消化分离

在富集的微血管段中加入混合消化液进行二次消化，于37℃中消化25-35min，每隔10min颠倒混匀一次，离心后弃上清液，沉淀用含10-20% FBS的DMEM/F-12培养液重悬，离心弃上清，重复此步骤一次；

所述混合消化液是2mg/mL的Ⅱ型胶原酶、2mg/mL的分散酶、60U/mL 的DNaseⅠ按体积比1:1:1的比例混合制得；

4、树鼩脑微血管内皮细胞的培养

将步骤3中微血管段消化后所得组织细胞沉淀，用完全培养基重悬混匀，接种在T25细胞培养瓶中，培养24h后弃旧液，用含1%双抗的PBS冲洗以去除未贴壁细胞和组织碎块，补充新鲜的完全培养基，之后每3天换液一次，连续培养6-9天；倒置显微镜下，观察细胞生长情况，待细胞贴壁面积达60-80%，使用0.25%胰酶（含EDTA）进行首次消化传代；

所述完全培养基为含10%胎牛血清、1%双抗、1%内皮细胞生长因子的DMEM/F-12培养基；

5、树鼩脑微血管内皮细胞的初步纯化培养

树鼩脑原代微血管内皮经过2次传代后，开始进行“差速消化+差速贴壁”纯化培养，即加入0.25%胰酶（含EDTA）消化1-2 min（可见微血管内皮细胞明显收缩变圆，而星型胶质细胞等杂细胞尚未明显变化），即刻加入完全培养基终止消化，并按照1:2传代；细胞贴壁0.5-1h后，吸去培养液以去除未贴壁细胞，补充新鲜的完全培养基，继续培养2-3d至细胞贴满瓶底80%以上；重复“差速消化+差速贴壁”纯化培养一次，即得到初步纯化的树鼩脑微血管内皮细胞；

所述完全培养基为含10%胎牛血清、1%双抗、1%内皮细胞生长因子的DMEM/F-12培养基；

6、树鼩脑微血管内皮细胞的嘌呤霉素纯化培养

对初步纯化的树鼩脑微血管内皮细胞进行消化传代，当细胞铺满瓶底70-80%时，用含嘌呤霉素（5ng/mL）的完全培养基作用10-12h，之后去除培养液，使用PBS漂洗两次；补充完全培养基继续培养2-3天，至细胞铺满瓶底70-80%时，按照1:2进行消化传代，重复嘌呤霉素纯化培养1次，即可得到更高纯度的树鼩脑微血管内皮细胞；

7、可连续传代树鼩脑微血管内皮细胞的筛选培养

将步骤6所得纯化的树鼩脑微血管内皮细胞按照1:5进行消化传代，使用不含内皮细胞生长因子的完全培养基持续培养6-8天，每3天换液一次；至细胞铺满瓶底60%-80%，进行消化并按照1:2进行传代，使用不含内皮细胞生长因子的完全培养基，即得到可连续传代的树鼩脑微血管内皮细胞；

所述不含内皮细胞生长因子的完全培养基是含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F-12培养基；

8、自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞的传代培养与生物学特性鉴定

按照常规程序，经过多次连续传代培养，建立自发永生化的树鼩脑微血管内皮细胞系；通过CD31、vWF以及紧密连接相关蛋白（CLDN1、CLDN5、JAM-A）、囊泡转运调控蛋白（MFSD2A）的免疫荧光实验进行细胞特征鉴定；通过透射电镜观察细胞紧密连接结构；利用CCK-8测定细胞活力，绘制细胞生长曲线；通过核型分析实验，观察不同代次细胞染色体的稳定性；通过RT-qPCR检测不同代次细胞的端粒酶相对表达量，分析自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞端粒酶活性的变化。

上述方法中1%双抗是指1%的青霉素-链霉素。

本发明经过大量实验优化与技术联合，先后采用“物理过滤+酶消化”的分离方法，“差速消化/贴壁+嘌呤霉素选择”的纯化方法，“无添加细胞生长因子适应培养”的优选策略，成功建立适用于自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞的纯化方法，获得的细胞可以连续传代120代以上，并保持稳定的细胞活力和均一的细胞形态，解决了此前脑微血管内皮细胞难以分离培养和连续传代的问题，而本发明中所使用的消化酶价廉易得，操作技术成熟简便；本发明建立的自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系，保留与体内细胞高度一致的生长活力和生理特性，可以最大程度模拟体内细胞的功能，没有端粒酶或者SV40等外源基因的引入，避免了转化细胞引起特性改变或者恶化的风险，为体外研究脑微血管内皮细胞相关疾病提供了更为理想的实验材料。

附图说明

图1是树鼩脑微血管内皮细胞原代培养和传代纯化培养显微镜观察结果，其中图A是原代培养1d；图B是原代培养9d；C是第二代（P2）；图D是嘌呤霉素纯化培养（P5）；图E是无添加内皮细胞生长因子适应培养（P6）；图F是纯化后传代培养（P8）；

图2是无添加内皮细胞生长因子连续传代培养结果；其中图A是P10；图B是P20；图C是P44；图D是P64；图E是P90；图F是P125；

图3是树鼩脑微血管内皮细胞标志分子vWF和CD31的免疫荧光观察结果；其中图A-C是vWF；图D-F是 CD31；

图4是树鼩脑微血管内皮细胞特异蛋白的免疫荧光观察结果；其中图A-C是CLDN1；图D-F是CLDN5；图G-H是JAM-A；图J-L是MFSD2A；

图5是不同放大倍数下树鼩脑微血管内皮细胞紧密连接的透射电镜观察结果；

图6是树鼩脑微血管内皮细胞不同代次（P10、P30、P70、P120）的细胞生长曲线；

图7是树鼩脑微血管内皮细胞的染色体核型，其中图A是P20；B是P120；

图8是树鼩脑微血管内皮细胞、树鼩脑组织和SV40永生化树鼩皮肤成纤维细胞的端粒酶相对表达量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品，本发明中的各种试剂耗材均为常规市售产品；

实施例1：自发永生化的树鼩脑微血管内皮细胞系的构建

1、树鼩原代脑微血管内皮细胞的分离培养

1.1、取新生树鼩，迅速脱颈处死，在75%酒精中浸泡消毒2min；在超净工作台中，用4℃预冷的含1%青霉素-链霉素的PBS中浸洗3次；转入无菌培养皿中，无菌操作剪开头皮和颅骨，撕开大脑包膜，剪取大脑皮层，转入新的无菌培养皿中；尽量去除脑膜和肉眼可见的大血管，用4℃预冷的含1%青霉素-链霉素的D-Hanks液反复冲洗4次，剪碎至1mm³大小，转入15mL离心管中；

1.2、在粉碎的大脑皮层中加入消化液（含60U/mL DNaseⅠ、2mg/mLⅡ型胶原酶、0.05%胰酶（不含EDTA）的PBS溶液），37℃孵育消化50min，每隔20min颠倒混匀一次；消化产物经200目细胞网筛过滤，此处注意收集滤网上组织碎块，用含1%青霉素-链霉素的D-Hanks液重悬，1000rpm离心8min后弃上清；沉淀用含20% BSA的DMEM/F-12培养液重悬，4℃下1000g离心20min，弃上清，得到富集的微血管段；

1.3、在富集的微血管段中加入混合消化液（2mg/mL的Ⅱ型胶原酶2 mL、2mg/mL的分散酶2 mL、60U/mL 的DNaseⅠ2 mL混合制得）进行二次消化，于37℃中消化30min，每隔10min颠倒混匀一次，1000rpm离心8 min后弃上清液；沉淀用含10%FBS的DMEM/F-12培养液重悬，于1000rpm离心8min，弃上清，重复此步骤一次；

1.4、配制完全培养基：DMEM/F-12 +10%胎牛血清（FBS）+1%青霉素-链霉素+1%内皮细胞生长因子（ECGS）；将步骤3中微血管段消化后所得组织细胞沉淀，用完全培养基重悬混匀，接种在T25细胞培养瓶中，培养24h后弃旧液，用含1%青霉素-链霉素的PBS冲洗以去除未贴壁细胞和组织碎块，补充新鲜的完全培养基，之后每3天换液一次，连续培养9天；倒置显微镜下，观察细胞生长情况，如图1A为刚开始培养的微血管内皮细胞，可见大量微血管段分布；培养9天如图1B所示，细胞呈“铺路石”状贴壁生长，逐渐铺满培养瓶底部；待细胞贴壁面积达70%，即使用0.25%胰酶（含EDTA）进行首次消化传代，传代培养细胞形态如图1C，呈现为多角状或短梭形，紧密贴壁生长。

2、树鼩脑微血管内皮细胞的纯化培养

2.1、初步纯化培养：树鼩脑原代微血管内皮经过2次传代后，开始进行“差速消化+差速贴壁”纯化培养，即加入0.25%胰酶（含EDTA）消化1min，可见微血管内皮细胞明显收缩变圆，而星型胶质细胞等杂细胞尚未明显变化，即刻加入完全培养基终止消化，并按照1:2传代；细胞贴壁1h后，吸去培养液以去除未贴壁细胞，补充新鲜的完全培液，继续培养3d至细胞贴满瓶底80%以上；重复“差速消化+差速贴壁”纯化培养一次，即得到初步纯化的树鼩脑微血管内皮细胞；

2.2、嘌呤霉素纯化培养：对初步纯化的树鼩脑微血管内皮细胞进行消化传代，当细胞铺满瓶底80%左右时，用含有嘌呤霉素（5ng/mL）的完全培养基培养11小时，可见杂细胞死亡漂浮（图1D），之后去除培养液，使用PBS漂洗两次；补充完全培养基继续培养2天，至细胞贴满瓶底70%，按照1:2进行消化传代，重复嘌呤霉素纯化培养1次，即可得到更高纯度的树鼩脑微血管内皮细胞。

3、可连续传代的树鼩脑微血管内皮细胞的选择培养

将步骤2.2所得纯化的树鼩脑微血管内皮细胞按照1:5进行消化传代，使用不含内皮细胞生长因子的适应培养基（DMEM/F-12 +10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素）持续培养7天，每3天换液一次，至细胞逐渐连片（图1E），至细胞铺满瓶底70%，即进行消化并按照1:2进行传代，使用适应培养基连续传代培养，即得到自发永生化的树鼩脑微血管内皮细胞（图1F）；细胞连续培养至120代以上，不同代次细胞形态如图2所示，细胞形态均一稳定，未见明显形态变化。

实施例2：自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞的生物学特性检测

1、免疫荧光实验检测细胞标志蛋白

CD31、vWF是微血管内皮细胞的特异细胞标记，紧密连接相关蛋白（CLDN1、CLDN5、JAM-A）、囊泡转运调控蛋白（MFSD2A）也是微血管内皮细胞特异表达的结构蛋白，采用免疫荧光实验通用方法进行相关标志蛋白的检测：选择生长状态好的细胞，消化传代接种在12孔培养板，待细胞长满培养孔底80%左右即可；吸弃培养基，用PBS冲洗1次，加入 4%的多聚甲醛固定20min，PBS漂洗孔板3次，每次3min；加入0.5%Triton X-100进行细胞穿孔20min，PBS清洗3次，每次3 min；使用2%的BSA封闭30min，PBS漂洗3次，每次3min；加入稀释好的一抗，放置于4℃孵育过夜；PBS漂洗3次，每次3 min；避光操作，在培养孔中加入相对应的二抗，37℃孵育60min，PBS漂洗次，每次3 min；在培养孔中加入稀释好的DAPI染色液，避光孵育2min，PBS清洗3次，每次3min；在荧光显微镜下观察并拍照。免疫荧光鉴定结果见图3和图4，该细胞CD31和vWF普遍阳性，主要紧密连接相关蛋白和囊泡转运调控蛋白也普遍阳性表达，表明本发明方法获得的树鼩脑微血管内皮细胞，保持着与体内细胞一致的生物学特性。

2、透射电镜观察细胞紧密连接结构

细胞单层培养至铺满瓶底80%以上，去培养基并用PBS冲洗三次，细胞刮刀刮取细胞，加入电镜固定液4℃重悬混匀固定2h，4℃固定保存及运输；细胞悬液离心机离心，弃上清加入0.1mol/L磷酸缓冲液PB（pH7.4），混匀漂洗3min后再离心，重复洗涤3次，提前加热溶解制备1%琼脂糖溶液，稍冷却后加入EP管内，在琼脂糖凝固之前将细胞沉淀用镊子挑起悬浮包裹于琼脂糖内；用0.1mol/L磷酸缓冲液PB（pH7.4）配制的1%锇酸避光室温固定2h，0.1mol/L磷酸缓冲液PB（pH7.4）漂洗3次，每次15min；依次加入30%、50%、70%、80%、95%、100%酒精上行脱水每次20min，100%丙酮两次，每次15min；渗透包埋：丙酮︰812包埋剂=1︰1于37℃下处理3h， 丙酮︰812包埋剂=1︰2 于37℃下渗透过夜，纯812包埋剂于37℃处理6h；将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37℃烤箱过夜；包埋板放于60℃烤箱聚合48h，取出树脂块备用；树脂块于超薄切片机60-80nm超薄切片，150目方华膜铜网捞片；铜网于2%醋酸铀饱和酒精溶液避光染色8min；70%酒精清洗3次；超纯水清洗3次；2.6%枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8min；超纯水清洗3次，滤纸稍吸干；铜网切片放入铜网盒内室温干燥过夜；透射电子显微镜下观察，采集图像分析；观察结果如图5所示，红色箭头区域指示树鼩脑微血管内皮细胞的紧密连接结构。

3、不同代次细胞活力的检测

选择96孔培养板，将单细胞悬液接种在96孔培养板中，接种浓度为5×10⁴ 个细胞/mL，每孔100μL，同时设置实验组和空白组，每组3个复孔，共设置1-8天共8组，置于37℃、5%CO₂温箱中培养，分别在1-8d后的同一时间点取出培养板，吸除培养液并用PBS清洗2次后，每孔加入100μL含CCK-8试剂的混合液(90μL培养液、10μL CCK-8试剂)，继续培养30min；选择波长450nm，在酶标仪上测定各孔吸光度(A值)，根据各个时间点吸光度值绘制细胞生长曲线；不同代次细胞生长曲线如图6所示，各代细胞均在培养3d-5d进入对数生长期，P120细胞仍保持与P10接近的生长活力。

4、不同代次细胞核型分析

在细胞培养液中按1∶200加入20μg/mL秋水仙素至终浓度为0.1μg/mL，细胞正常培养条件下处理3h，取出培养瓶，加入0.25%胰蛋白酶将细胞消化成单细胞悬液；

将细胞悬液转移至15mL离心管，1000 r/min室温离心10min，弃上清，细胞沉淀中加入4mL事先预热至37℃的0.1mil/L KCl低渗液，用滴管吹打成单细胞悬液，37℃低渗处理20 min；

加4 mL新鲜预冷的核型固定液(甲醇:冰乙酸=3:1)，静置5min后轻轻吹打成单细胞悬液，再静置固定25 min；4℃下1000 r/min离心10 min；重复上述固定操作1次，弃上清，加入2mL左右核型固定液重悬细胞；

取一洁净载玻片，用滴管吸取细胞悬液，于载玻片垂直上方50 cm以上处滴片，将载玻片倾斜放置，自然晾干（1 h以上）；

将载玻片倒扣（染色体面向下）于染色盒内，于载玻片和盒内壁之间加入Giemsa染液，室温染色1 h；

将载玻片取出，自来水冲洗30s，再用蒸馏水冲洗5s，自然晾干，显微镜下观察拍照、计数；结果见表1，分析100个P20细胞，染色体数2 n =62的细胞数有90个，染色单体和染色体断裂与结构异常0 个，亚二倍体细胞8个，超二倍体细胞数2个；分析100个P120细胞，染色体数2 n =62的细胞数有86个，染色单体和染色体断裂与结构异常0 个，亚二倍体细胞10个，超二倍体细胞数4 个，染色体核型分析结果显示，本发明获得的树鼩脑微血管内皮细胞，多次传代后细胞染色体结构完整，无明显的缺失和突变。

表1 不同代次细胞染色体核型分析

。

5、不同代次细胞端粒酶活性检测

通过RT-qPCR检测不同代次细胞的端粒酶相对表达量，分析自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞端粒酶活性的变化；

胰酶消化并收获细胞（总数10⁶以上），Trizol法提取总RNA：即细胞沉淀加入1mLTrizol，移液枪反复吹打约30次，室温静置8min；4℃下12000rpm离心10min取上清，加入0.2mL氯仿，振荡25s，静置10min；4℃下12000rpm离心10min，将约400 μL上清转移到一新的离心管中，加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA（或不可见），吸除液体，加入75%乙醇1mL洗涤沉淀；4℃下8000rpm离心5min，将液体吸除干净；将离心管置于超净台上吹3min，加入50μL DEPC水溶解RNA，用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度。

根据树鼩端粒酶TERT基因序列设计引物，以GAPDH为内参，引物序列如下：

TERT-F：5’CACAAGGAAGGAGCGACCAT-3’

TERT-R：5’CCTCCGAAGACGTAGCTTCC-3’

GAPDH-F：5’-GTCAGCAATGCCTCCTGCAC-3’

GAPDH-R：5’-GGGCCGTCCACAGTCTTCTG-3’

按照Takara One Step SYBR ® PrimeScript ® PLUS RT-PCR Kit (DRR096A)说明进行RT-qPCR，采用2-△△ct的方法计算目的基因的相对表达量，用以分析端粒酶活性；结果如图8所示，本发明获得的自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞， P60、P120代细胞与P10代细胞以及树鼩脑组织（TS-Brain）的端粒酶活性存在显著差异，其端粒酶活性随着传代次数增加增强，表明该细胞系的永生化特性，但由于是自发永生化，其端粒酶活性远低于SV40诱导的永生化树鼩皮肤成纤维细胞（TS-SFs-P50）。

Claims (5)

1.一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，其特征在于，步骤如下：

（1）从新生树鼩脑部分离获得大脑皮层，用4℃含1%双抗的D-Hanks液反复冲洗3-5次后剪碎，在粉碎的大脑皮层中加入消化液，37℃孵育消化40-60min，每隔20min颠倒混匀一次；消化产物经200目细胞网筛过滤，收集滤网上组织碎块，用含1%双抗的D-Hanks液重悬，离心弃上清；沉淀用含20-25%BSA的DMEM/F-12培养液重悬，4℃下离心，弃上清，得到富集的微血管段；

（2）在富集的微血管段中加入混合消化液进行二次消化，于37℃中消化25-35min，每隔10min颠倒混匀一次，离心后弃上清液，沉淀用含10-20% FBS的DMEM/F-12培养液重悬，离心弃上清，重复此步骤一次；

（3）将步骤（2）中微血管段消化后所得的组织细胞沉淀，用完全培养基重悬混匀，接种在细胞培养瓶中，培养24h后弃旧液，用含1%双抗的PBS冲洗以去除未贴壁细胞和组织碎块，补充新鲜的完全培养基，之后每3天换液一次，连续培养6-9天；观察细胞生长情况，待细胞贴壁面积达60-80%，使用含EDTA 的0.25%胰酶进行首次消化传代；

（4）树鼩脑原代微血管内皮细胞经过2次传代后，开始进行“差速消化+差速贴壁”纯化培养，即加入含EDTA 的0.25%胰酶消化1-2 min，即刻加入完全培养基终止消化，并按照1:2传代；细胞贴壁0.5-1h后，吸去培养液以去除未贴壁细胞，补充新鲜的完全培养基，继续培养2-3d至细胞贴满瓶底80%以上；重复“差速消化+差速贴壁”纯化培养一次，即得到初步纯化的树鼩脑微血管内皮细胞；

（5）对初步纯化的树鼩脑微血管内皮细胞进行消化传代，当细胞铺满瓶底70-80%时，用含5ng/mL嘌呤霉素的完全培养基作用10-12h，之后去除培养液，使用PBS漂洗两次；补充完全培养基继续培养2-3天，至细胞铺满瓶底70-80%，按照1:2进行消化传代，重复嘌呤霉素纯化培养1次，即得到更高纯度的树鼩脑微血管内皮细胞；

（6）将步骤（5）所得纯化的树鼩脑微血管内皮细胞按照1:5进行消化传代，使用不含内皮细胞生长因子的完全培养基持续培养6-8天，每3天换液一次，至细胞铺满瓶底60%-80%，进行消化并按照1:2进行传代，使用不含内皮细胞生长因子的完全培养基，即得到可连续传代的树鼩脑微血管内皮细胞。

2.根据权利要求1所述的自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，其特征在于：步骤（1）中的消化液是含60U/mL DNaseⅠ、2mg/mLⅡ型胶原酶、不含EDTA的0.05%胰酶的PBS溶液；步骤（2）混合消化液是2mg/mL的Ⅱ型胶原酶、2mg/mL的分散酶、60U/mL 的DNase I按体积比1:1:1的比例混合制得。

3.根据权利要求1所述的自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，其特征在于：步骤（3）、步骤（4）中的完全培养基为含10%胎牛血清、1%双抗、1%内皮细胞生长因子的DMEM/F-12培养基。

4.根据权利要求3所述的自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，其特征在于：步骤（6）中不含内皮细胞生长因子的完全培养基是含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F-12培养基。

5.根据权利要求4所述的自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法，其特征在于：1%双抗是指1%的青霉素-链霉素溶液。

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