CN108441475B - 一种培养中鼻甲来源嗅鞘细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从中鼻甲分离制备嗅鞘细胞的方法，先将中鼻甲粘膜进行二次消化，去除血细胞及上皮层；然后将消化后的组织块进行原代培养，细胞生长至一定融合度后进行第一次传代；第一代细胞进行加压筛选，随后撤去筛选试剂，待细胞培养至一定融合度后进行鉴定。本发明的嗅鞘细胞培养方法，具有无伦理问题、组织来源易采集、安全性高等优点。最后获得的细胞为107量级，且纯度达到国际同类水平，适宜用于科研试验与临床前研究。本发明使用的试剂均为常见试剂，单位细胞量的成本较低。

Description

一种培养中鼻甲来源嗅鞘细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种从中鼻甲中分离培养嗅鞘细胞的方法，属于体外细胞培养技术领域。
背景技术
1992年由Devon和Doucete首次正式证明嗅鞘细胞（OECs）可在体外条件下培养形成髓鞘。2000年Barnet首次报道用术中切除的嗅球在体外培养扩增人类OECs取得成功，并且证明这些细胞生理功能良好，植入啮齿动物脱髓鞘区域能使髓鞘化轴突，而且无致瘤性。
国内黄红云教授首先对OECs做了报道。他将4个月以上的引产胎儿的嗅球取下，进行一系列的加工培养纯化后移植到一组临床23例晚期脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）患者，治疗实验的初步报告表明，被治疗的脊髓神经功能均有不同程度的改善，且呈继续改善趋势。随后，他们又进行了进一步临床试验，证明了胚胎嗅鞘细胞移植快速帮助晚期脊髓损伤患者部分神经功能。另有研究将脊髓后角神经元与嗅鞘细胞体外共培养发现，嗅鞘细胞可明显促进胚胎后角神经元的突起生长。这提示嗅鞘细胞移植可能会促进脊髓损伤后自脊髓后角神经元起源的上行传导路及脊髓固有束纤维受损后的再生。国内外进行了大量的临床基础研究证实OECs移植治疗SCI具有良好的应用前景。嗅鞘细胞移植用于治疗SCI有较大的优越性，主要有以下几个方面：嗅鞘细胞对神经细胞有较强的保护作用；具有较强的促进轴索生长的作用；具有引导新生轴索通过胶质疤痕和PNS-CNS边界的作用；能有效促进突触形成并且可自体取材而无损伤；有较强的成髓鞘作用；可作为基因治疗的载体细胞。陈琳等对采用嗅鞘细胞移植手术治疗脊髓损伤171例患者进行了3年随访，未发现任何新的脊髓损伤及肿瘤或新生物生长，说明嗅鞘细胞移植的安全性是有保障的。
发明内容
针对嗅鞘细胞取材困难的问题，本发明提供了一种从自体中鼻甲中分离培养嗅鞘细胞的方法，该方法双阳性嗅鞘细胞比率高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种培养中鼻甲来源嗅鞘细胞的方法，包括以下步骤：
（1）细胞消化：将中鼻甲粘膜清洗后，以蛋白酶消化；然后将中鼻甲粘膜剥去上皮层后剪碎，以胶原酶消化；
（2）原代培养：将步骤（1）获得的材料清洗后，接种于培养皿内进行原代培养，获得原代细胞；
（3）加压筛选：原代细胞传代后，一代细胞生长至50%融合度后进行加压筛选；
（4）传代培养：细胞加压筛选后，以传代培养基进行传代。
优选地，中鼻甲粘膜的面积为1-2cm2。所述蛋白酶优选为中性蛋白酶Ⅱ；消化时间优选为30min；所述胶原酶优选为胶原酶Ⅳ；消化时间优选为30-45min。所述步骤（1）中清洗液优选为每升含有Antibiotic-Antimycotic mixture（1:100）10 mL的DPBS平衡盐溶液。
所述步骤（2）中原代培养的操作优选为原代培养的前5d不对细胞做任何处理；原代培养5d后，每隔2-3d进行半量换液。所述原代培养基为每500mL含有胎牛血清50 mL，L-谷氨酰胺2 mM，Antibiotic-Antimycotic mixture（1:100）5 mL 的DMEM/ F-12培养基。
所述加压筛选的试剂为Arb-C（阿糖胞苷）；浓度为2.5-5μg/mL；筛选时间为40-64h。加压筛选的细胞浓度优选为0.5-1×106个/mL。
可选地，进行传代的细胞融合度为90-100%；传代方式为一传二。传代培养每隔2-3d半量换液一次。
所述传代培养基包含DMEM/ F-12 培养基250 mL，胎牛血清50 mL，50%内皮祖细胞条件培养基（EPC-CM）250mL，BPE 20μg/mL，Forskolin 2uM，L-谷氨酰胺 2 mM，Antibiotic-Antimycotic mixture（1:100）5 mL；其中，Antibiotic- Antimycotic mixture可替换为其他单一或组合抗生素的溶液。所述内皮祖细胞条件培养基为培养过内皮祖细胞3d后的培养基。
优选地，上述方法，包括以下步骤：
（1）消化：将中鼻甲粘膜清洗3次后，剥去表层残留的血污，中性蛋白酶Ⅱ消化中鼻甲以便剥去上皮层；再用刮刀剥去中鼻甲上皮层细胞，将剩余组织剪碎，以胶原酶Ⅳ消化组织，随后中和并离心去除消化酶，获得中鼻甲组织；
（2）原代培养：将消化后的中鼻甲组织加入原代培养基，接种于培养皿中，置于培养箱中进行培养，获得原代细胞；
（3）加压筛选：原代细胞生长至100%融合度后进行消化传代，消化2-3min后中和消化酶，吹下细胞离心去除上清液，第一代细胞生长至50%融合度后进行Arb-C加压筛选；
（4）传代培养：细胞加压筛选后，以传代培养基进行传代。
上述方法中，中和消化酶的溶液均为原代培养基。
所述步骤（1）和步骤（3）中，离心条件为800-1000 rpm离心5-10 min。
上述原代培养基和传代培养基中DMEM/ F12培养基是培养细胞的常用公知的培养基，Antibiotic- Antimycotic mixture为培养细胞的常用公知的抗生素，上述培养基与抗生素均可从商业途径购买得到。
本发明具有以下优点：
本发明采集中鼻甲上层粘膜组织分离培养嗅鞘细胞，具有无伦理问题、低风险、易采集等优点，而且可以自体应用。传统手段往往从嗅脑或上鼻甲采集样本制备嗅鞘细胞——采集嗅脑的伦理问题突出且只能异体应用，排斥风险高；采集上鼻甲对供者的嗅觉功能损伤大，且由于上鼻甲临近脑室，稍有不慎易造成脑脊液渗出，安全性低。本发明在操作过程中采用多种手段提高嗅鞘细胞比率——第一次传代采用差速消化法，将成纤维样细胞单独消化传代培养，而贴壁牢固不易消化的上皮细胞（非嗅鞘细胞）则不进行传代；随后，采用Arb-C对传代细胞进行加压筛选，增殖较快的成纤维细胞生长受到抑制，嗅鞘细胞比率得以进一步提高。培养基中添加的培养过EPC 3d的EPC-CM可有效促进嗅鞘细胞增殖，传至第一代后可获得107量级的细胞。最终收获的细胞经过标记物检测，S100β/GFAP双阳性嗅鞘细胞比率达到10%，达到国际同类水平。本发明培养的嗅鞘细胞适合用于科研试验和临床前研究。
附图说明
图1为原代培养获得的细胞；
图2为加压筛选后的传代细胞；
图3为第1代嗅鞘细胞间接免疫荧光检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
配制清洗液：每升含有Antibiotic-Antimycotic mixture（1:100）10 mL的DPBS平衡盐溶液；
配制原代培养基：含有DMEM/ F-12培养基500 mL，胎牛血清50 mL，L-谷氨酰胺2mM，Antibiotic-Antimycotic mixture（1:100）5 mL；
配制传代培养基：每250 mL包含胎牛血清50 mL，50%内皮祖细胞条件培养基（EPC-CM）250mL，BPE 20μg/mL，Forskolin 2uM，L-谷氨酰胺 2 mM，Antibiotic-Antimycoticmixture（1:100）5 mL的DMEM/ F-12 培养基。
（1）采集健康的中鼻甲粘膜，将样本放入储运瓶并贴好标签置于4-25℃运输箱内储运；样本于采集后2h内开始处理：对储运瓶外表面进行75%酒精擦拭消毒，在生物安全柜内打开储运瓶瓶盖，将中鼻甲粘膜小心地用手术镊整体取出，置于含有20mL清洗液的50mL离心管中清洗30s，并重复清洗2次；将清洗后的中鼻甲粘膜用手术镊小心移至一个无菌塑料平皿中，用镊子去除粘膜表面残存的血污，最后用DPBS冲洗1遍；
（2）将中鼻甲粘膜移入预热至37℃的中性蛋白酶Ⅱ中水域消化30min，期间不断摇动使组织均匀消化；将消化后的组织用DPBS清洗一次，用细胞刮刀轻轻剥去粘膜上皮层；将粘膜置于50mL离心管内剪碎，加入适量胶原酶Ⅳ于37℃水域中消化40min，期间不断摇动；以10mL移液管轻柔吹打组织，随后加入与胶原酶Ⅳ等体积的原代培养基中和消化酶，1400rpm离心5min后弃去全部上清；以8mL原代培养基重悬组织，将其均匀接种于2个60mm培养皿中；
（3）组织原代培养前5d不进行换液等任何处理，第5d将培养皿内液体全部吸出至50mL离心管内，以1000rpm离心5min后弃去1/2最上层清液，利用剩余上清液重悬下层沉淀后移入原皿培养，同时补加适量原代培养基，见图1；随后每隔2-3d半量换液一次，直至原代细胞生长至90%融合；每皿细胞加入1 mL 37℃预热的Accutase消化酶后置于37℃温箱内消化90 s，当成纤维样细胞皱缩而上皮细胞未皱缩时，轻柔吹下后，细胞悬液以1000 rpm离心5 min，弃去上清后，以传代培养基重悬细胞接种于2个培养皿（φ60mm）内，其中一个预先置有细胞爬片，每隔2d换液一次；
（4）培养皿内传代细胞生长至50%融合后，培养体系内加入5μg/mL Arb-C连续作用48h，细胞生长速度减慢同时有少量细胞死亡漂浮，如图2所示；以新传代培养基换掉培养皿内原有培养基，随后根据皿内细胞生长状态，每隔2-3d换液一次；
（5）上述细胞生长至融合度为90%后，以传代培养基传代，传代方式为一传二；传代培养每隔2-3d半量换液一次。
实施例2 嗅鞘细胞间接免疫荧光鉴定
将实施例1中步骤（4）加压筛选后培养皿内细胞生长至80%融合后，取出皿内细胞爬片置于六孔板内，PBS平衡盐溶液漂洗一次；以4%的多聚甲醛溶液室温固定20 min后吸除固定液；随后加入0.1%的TritonX-100溶液，室温孵育10 min后吸除全部液体，PBS平衡盐溶液漂洗爬片5次，每次5 min；以5%驴血清稀释一抗Anti-human S100β/Anti-human GFAP至1:400终浓度；将稀释好的一抗加入细胞爬片上，4℃过夜孵育；孵育后以PBS平衡盐溶液漂洗爬片3次，每次5min；细胞爬片上加入终浓度为1:200的标记有荧光基团的二抗，37℃孵育1h后PBS漂洗爬片3次，每次5 min；最后细胞爬片上滴加防荧光猝灭剂含DAPI，染核10 min后，100倍显微镜下观察荧光标记并随机选取五个视野计算标记物阳性率。经统计发现，本发明培养的嗅鞘细胞10%为S100β/GFAP双阳性，如图3所示。

Claims (4)

1.一种培养中鼻甲来源嗅鞘细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）细胞消化：将中鼻甲粘膜清洗后，以蛋白酶消化；然后将中鼻甲粘膜剥去上皮层后剪碎，以胶原酶消化；
（2）原代培养：将步骤（1）获得的材料清洗后，接种于培养皿内进行原代培养，获得原代细胞；
（3）加压筛选：原代细胞传代后，一代细胞生长至50%融合度后进行加压筛选；
（4）传代培养：细胞加压筛选后，以传代培养基进行传代；
所述蛋白酶为中性蛋白酶Ⅱ；消化时间为30min；所述胶原酶为胶原酶Ⅳ；消化时间为30-45min；
所述步骤（2）中原代培养的操作为原代培养的前5d不对细胞做任何处理；原代培养5d后，每隔2-3d进行半量换液，直至原代细胞生长至90%融合；
所述加压筛选的试剂为阿糖胞苷；阿糖胞苷的浓度为5μg/mL；筛选时间为48h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，中鼻甲粘膜的面积为1-2cm2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，传代培养基中组成为DMEM/ F-12培养基250 mL，胎牛血清50mL，50%内皮祖细胞条件培养基250mL，BPE 20μg/mL，Forskolin 2μM，L-谷氨酰胺2mM，Antibiotic-Antimycotic mixture（1:100）5mL；所述内皮祖细胞条件培养基为培养过内皮祖细胞3d后的培养基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Antibiotic- Antimycotic mixture可替换为其他单一或组合抗生素的溶液。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001030982A1 (en) * 1999-10-27 2001-05-03 Griffith University Olfactory ensheathing cells isolated from the lamina propria
CN102604893A (zh) * 2011-12-27 2012-07-25 吴卫江 新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的分组纯化方法
WO2017032224A1 (zh) * 2015-08-21 2017-03-02 黄红云 一种嗅鞘细胞的制备方法
CN107603952A (zh) * 2016-07-11 2018-01-19 江苏齐氏生物科技有限公司 一种大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001030982A1 (en) * 1999-10-27 2001-05-03 Griffith University Olfactory ensheathing cells isolated from the lamina propria
CN102604893A (zh) * 2011-12-27 2012-07-25 吴卫江 新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的分组纯化方法
WO2017032224A1 (zh) * 2015-08-21 2017-03-02 黄红云 一种嗅鞘细胞的制备方法
CN107603952A (zh) * 2016-07-11 2018-01-19 江苏齐氏生物科技有限公司 一种大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fibroblasts Isolated from Human Middle Turbinate Mucosa Cause Neural Progenitor Cells to Differentiate into Glial Lineage Cells;Xingjia Wu等;《PLOS ONE》;20130830;第8卷(第10期);"Materials and Methods" *

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