CN111088215A - 一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法 - Google Patents

一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法 Download PDF

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赵一萍
白东义
芒来
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Abstract

本发明提供了一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，包括组织解离和清洗、组织消化、细胞接种和细胞培养与维护等步骤。本发明首次采用大型哺乳动物蒙古马的整个睾丸组织进行组织分离培养以获取睾丸支持细胞，该方法程序简便、成本低廉，能有效去除酶消化过程中产生的聚集组织，从而保持细胞的活性和生物学功能；同时也能有效去除在分离培养过程中产生的杂质细胞，从而提高支持细胞分离效率，为后续生殖细胞的研究提供基础。

Description

一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法。
背景技术
支持细胞(Sertoli又称STO)，是位于曲细精管基膜上的唯一一种体细胞，其贯穿于精子发生的全部过程。相邻的两个支持细胞之间形成小瓮，生精细胞位于其中，由于生精上皮没有血管，其所需要的营养物质和代谢产生的废物都需要经过支持细胞供给和排出。精子发生所需要的能源储存于支持细胞中，当精子发育停止时，支持细胞中的能源增加，反之减少。由此可以认为支持细胞对生精细胞的各个阶级发育起着支持、保护、吞噬和营养作用。支持细胞的基底部紧密相连曲细精管基膜这是构成血睾屏障的基础，因此支持细胞参与睾丸的豁免功能。研究表明，支持细胞还可以分泌一些营养因子，例如胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、表皮生长因子(EGF)等可以维持细胞周边环境并促进干细胞生长。所以体外培养支持细胞有助于研究其各种生物学特性及功能，以便于人们能更好地控制精子发生过程，为畜牧业生产及临床医学提供方便。
现有技术中，提取睾丸支持细胞是在室温下对睾丸组织样品采集后消毒、脱囊、分离白膜鞘膜和组织剪碎处理，采用两步酶(胰酶和胶原酶)或者混合酶(胰酶胶原酶和透明质酸酶)进行消化，通过细胞筛过滤得到悬液，所得细胞经过接种培养后使用Tris-Hcl进行低渗处理以达到去除生精细胞目的。但是，将采集的样品在室温进行消毒、脱囊、分离包膜鞘膜和组织剪碎等操作的过程中，会增加细胞的代谢，易造成组织发生黏连融合，加大了对细胞的损伤，降低了细胞成活率，为后期分离培养细胞造成困难，且在操作过程中会产生红细胞等杂质细胞。同时，采用两步酶(胰酶和胶原酶)或者混合酶(胰酶胶原酶和透明质酸酶)进行组织消化时，会产生粘稠状聚集团体，不利于细胞释放和后期的细胞过滤。此外，接种培养后使用Tris-Hcl进行低渗处理去除生精细胞的同时也会去除支持细胞，必须根据不同种属细胞来确定处理时间，要求实验者要有丰富经验。
现有技术中也有报道使用流式细胞分选仪或者免疫磁珠分选仪进行小鼠支持细胞的体外分离纯化和培养。但是，一方面，流式细胞仪和免疫磁珠分选仪虽然可以高效率地纯化出支持细胞，但仪器成本昂贵并需要特殊的标记物。另一方面，目前这方面技术仅局限于对小鼠支持细胞的体外培养，种属适用范围太单一。根据本领域技术常识，对支持细胞的分离培养应该从青春期前开始，此时的细胞更适应体外培养且没有生精，支持细胞随年龄增长逐渐下降。目前对小鼠的支持细胞研究较多，也有一些关于人支持细胞原代培养的研究，然而，这些技术绝大多数是从睾丸活检中获得的，而不是整个睾丸组织。对于大型哺乳动物却鲜为报道。
发明内容
鉴于背景技术中存在的问题，本申请的目的在于提供一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法。
为了达到上述目的，本申请所提供的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，包括如下步骤：
(1)组织解离和清洗
在4℃环境中，将采集的蒙古马睾丸组织样本置于冰上，消毒、脱囊、分离白膜和鞘膜、剪碎、除去血管；清洗后收集到离心管中，反复置于冰上进行重力沉淀；对重力沉淀后的样本，用甘氨酸溶液进行迅速渗透，然后使用缓冲液清洗；对清洗后的样本进行吹打，使生精小管从组织中解离；
(2)组织消化
将生精小管置于DNase I溶液中，在室温下孵育5～10分钟；然后用培养基终止消化，弃上清，对沉淀用HBSS冲洗后置于冰上进行重力沉淀；将沉淀物用胶原酶溶液消化，在37℃下孵育20～40分钟，得到消化后的组织；
清洗消化后的组织，除去聚集体，离心并去除上清液；加入胰蛋白酶溶液和脱氧核糖核酸酶溶液，继续消化10～30分钟，使用培养基进行终止消化，在室温下离心，弃上清，使用培养基将离心所得的组织碎片和细胞进行重悬，对重悬液使用注射器针头反复吸取，使细胞解聚；
(3)细胞接种
对细胞解聚之后的样本进行细胞筛过滤，滤液重悬，接种于培养皿中，进行孵育1～2天，除去漂浮的细胞，进行纯化；
(4)细胞培养与维护
观察细胞生长状态，按时更换培养基并适时传代，即得蒙古马睾丸支持细胞。
相对于现有技术，本发明至少具有如下突出的技术效果：
(1)在组织解离和清洗步骤中，所有操作均在4℃环境中的冰上进行，降低了细胞的代谢，为支持细胞的存活率提供了保障，并且可有效防止组织发生黏连，有利于实验的进行和细胞的提取。尤其是在对组织进行剪碎之后，反复置于冰上、运用重力沉淀原理机械地去除红细胞以及部分游离间质细胞，对红细胞及游离间质细胞的去除非常充分。
(2)在组织清洗时，使用甘氨酸溶液对样本进行迅速渗透，然后使用缓冲液清洗，能有效去除生精细胞，即使在后期接种发现含有生精细胞，该生精细胞也已经被破坏，经过传代即可去除，从而避免现有技术中在接种后使用Tris-Hcl进行处理时对支持细胞产生的不良影响。
(3)在组织消化步骤中，在使用胰蛋白酶和胶原酶的基础上，还使用了脱氧核糖核酸酶(Dnase I)，Dnase I可消除大量因细胞破裂释放的DNA，防止细胞解离过程中产生的粘附现象，为清洗提供便利。
(4)本发明首次采用大型哺乳动物蒙古马的整个睾丸组织进行组织分离培养。相对于现有技术中对小鼠等小型动物支持细胞的体外分离纯化，本发明面临更多的技术困难：首先，在取材方面，由于支持细胞随着年龄的增长呈下降趋势，因此取材要求在青春期以前最好，小鼠的年龄较为容易控制和掌握。其次，大型哺乳动物的睾丸相对于小鼠的睾丸在进行脱囊和组织分离等具体操作方面的难度较大。再次，曲细精管占睾丸组织的60～80％，大型哺乳动物睾丸取材约每个睾丸取1～3g，而小鼠是整个睾丸组织，也影响细胞的产量。本发明在进行组织机械剪碎和酶消化支持前的预处理已经在很大程度上去除了杂质细胞，在后期接种之后结合差异贴壁法使细胞得到了纯化，从而避免了借助昂贵仪器的使用。差异贴壁法是根据提取的睾丸细胞悬浊液中的各种细胞贴壁时间不同进行分离纯化，将细胞悬浊液接种于预先使用明胶包被处理的培养皿中，接种5～8h，明胶具有吸附细胞的功能，可以使体细胞优先贴壁。由于体细胞优先贴壁而其他生殖细胞还处于悬浮状态或者贴壁不牢，此时用移液枪轻轻吹打，将悬浮细胞和贴壁不牢吸走去除，剩余的体细胞继续培养，该方法简便、高效、快速，且可以有效地纯化细胞。
综上，本发明提供了一种简便、高效且快速体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，该方法程序简便、成本低廉，能有效去除酶消化过程中产生的聚集组织，从而保持细胞的活性和生物学功能；同时也能有效去除在分离培养过程中产生的杂质细胞，从而提高支持细胞分离效率，为后续生殖细胞的研究提供基础。
优选地，所述组织解离和清洗的步骤中，反复置于冰上进行重力沉淀的操作为：将所述离心管摇晃后置于冰上5～10分钟，弃上清，重复3～5次。
优选地，所述胶原酶溶液为IV型胶原酶和DNase I溶解于HBSS中得到的溶液。胶原酶对于降解细胞外基质是必需的，在组织的解离中起着至关重要的作用。
优选地，所述甘氨酸溶液为：青霉素、链霉素、甘氨酸、EDTA和胰蛋白酶抑制剂溶解于HBSS中得到的溶液。本发明使用甘氨酸溶液对样本进行迅速渗透，引起的渗透压改变会破坏某些睾丸细胞类型，尤其是血液-睾丸屏障外的细胞(如精原细胞)，在酶解离过程中，也使细胞更容易从基底膜上移除。此外，EDTA是一种螯合剂，具有与钙、镁结合的能力；胰蛋白酶抑制剂可保护细胞免受蛋白质降解。
优选地，所述脱氧核糖核酸酶溶液为DNase I溶解于所述甘氨酸溶液中得到的溶液。
优选地，所述胰蛋白酶溶液为胰蛋白酶和DNase I溶解于HBSS中得到的溶液。
优选地，所述培养基为DMEM-F12培养基。
优选地，所述组织解离和清洗的步骤中，对清洗后的样本进行吹打的操作为：借助镊子、体视镜或用吸管进行吹打。
优选地，所述组织消化的步骤中，对重悬液使用针头反复吸取的操作为：通过20ml注射器的18G针头进行15～25次反复吸取。虽然在胰酶消化过程中加入了Dnase I有效避免了有大量的集合体聚集，但是仍会有残留部分的细胞外基质发生黏连，若此时进行细胞筛过滤则不能有效地将细胞过滤且此聚集组织会堵塞细胞筛，对产量造成很大影响。为此，本发明使用20ml注射器反复吸拉，让其通过18G针头，运用了水动力剪刀原理，充分解决了细胞聚集现象，使细胞均匀分布，防止了聚集体堵塞细胞筛现象，提高了细胞过滤的产量，并且，水动力剪刀不会对细胞的生物学特性和存活率有任何影响。
优选地，所述细胞培养与维护的步骤中，使用倒置光学显微镜观察细胞生长状态。这一步骤不仅是为了评估汇合点，而且也是为了检测细胞培养中的任何污染。支持细胞参与构成血睾屏障，本发明使用倒置光学显微镜观察支持细胞的特殊形态，此外也用于评价支持细胞的汇合点，如果生长过密，则其形状会发生改变，比如呈长梭形。如果有细菌真菌污染可以通过显微镜观察到，情况不严重可以使用双抗或者两性霉素B进行处理来维护支持细胞生长。
附图说明
图1是具体实施方式中得到的睾丸支持细胞的第二代细胞的200x电镜图；
图2是具体实施方式中得到的睾丸支持细胞原代培养72h的400x电镜图；
图3是具体实施方式中得到的睾丸支持细胞悬液接种的200x电镜图；
图4是具体实施方式中得到的睾丸支持细胞原代培养48h的10x电镜图；
图5是具体实施方式中得到的睾丸支持细胞的第四代细胞的20x电镜图；
图6是具体实施方式中得到的第一代睾丸支持细胞的400x电镜图；
图7是具体实施方式中得到的睾丸支持细胞的第二代细胞的200x电镜图；
图8是具体实施方式中得到的睾丸支持细胞的第二代细胞的100x电镜图；
图9是具体实施方式中荧光定量PCR分析GATA4、GDNF基因表达情况的结果图。
具体实施方式
1.样品和试剂
1.2样品
2岁蒙古马经去势所得的睾丸采用4℃保温瓶两小时之内运回实验室。
1.2细胞缓冲液的配制
(1)Hank's平衡盐溶液(HBSS)：140mM氯化钠、5mM氯化钾、0.44mM磷酸二氢钾无水、0.34mM磷酸钠、6mMD-葡萄糖和4mM碳酸氢钠。称取所有试剂放入1L量筒中，在900mL水中溶解。使用盐酸或氢氧化钠的浓溶液调节pH至7.4。将体积调节至1L。在无菌环境下，过滤除菌，并在4℃的无菌瓶中储存。
(2)磷酸盐缓冲液(PBS)：140mm氯化钠、3mm氯化钾、10mm磷酸二碱钠和1.8mm磷酸二氢钾。将所有试剂称重，溶解在900mL的水中。制备PBS的最简单方法是在1L的水中制备10×PBS原液(1.4M氯化钠、0.03M氯化钾、0.1M磷酸二氢钠和0.18M磷酸二氢钾)。为了制备PBS的工作溶液，在900mL水中加入100mL 10×PBS原液。如有必要，应使用盐酸或/和氢氧化钠浓溶液将溶液pH调至7.4。调节容积至1L。在无菌环境下，通过0.2μm混合纤维素酯膜过滤器过滤PBS，并将其储存在4℃的无菌瓶中(也可购买已准备好的无菌溶液。)
1.3相关消化酶的配制
(1)甘氨酸溶液：HBSS 100mL，青霉素50U/mL，链霉素50mg/mL，甘氨酸1M，EDTA2mM，胰蛋白酶抑制剂0.002％。用浓盐酸或/和氢氧化钠溶液将pH调到7.2，过滤消毒。
(2)DNase I溶液：在20mL甘氨酸溶液中加入1mg DNase I(250U)，过滤除菌。
(3)胶原酶溶液：3.5mg胶原酶IV型，3.5mgDNase I(250U)溶于12.5mL HBSS，过滤除菌。
(4)胰酶液：HBSS 10mL，胰酶2.5mg，DNase I 2.5mg(250U)，过滤除菌。
1.4细胞培养基的制备
(1)培养基的制备，使用DMEM-F12培养基，并按照制造商的建议将其溶解在900mL的水中。(培养基中应该包含其他营养物质，例如谷氨酰胺、β-巯基乙醇、丙酮酸钠。DMEM和F12可以以粉末或液体形式获得，如果以粉末的形式获得，请参考制造商的指示，以便知道该粉末必须溶解在哪一体积的水中。)
(2)如果使用低葡萄糖DMEM，则应添加D-葡萄糖直到达到最终浓度为18mM/L。
(4)应使用盐酸或者氢氧化钠溶液调节培养基的pH至7.4。
(4)将胎牛血清(10％)、50μg/mL庆大霉素、50U/mL青霉素、50mg/mL链霉素(均为无菌试剂)加入无菌培养基中，保存在4℃的无菌瓶中。
2.实验方法
将组织样品4℃运回实验室立即处理，对组织进行处理和酶消化要保持对支持细胞(sertoli)损伤降到最小。注：整个组织处理要在冰上4℃环境进行。
2.1组织解离与清洗
(1)在无菌实验室中将睾丸组织置于冰上，喷洒75％酒精进行表面消毒，之后使用预冷的HBSS溶液进行清洗，使用无菌的手术器械进行睾丸脱囊处理，除去附睾组织，在此使用预冷的缓冲液进行冲洗，将其转入到超净台中。此时可将培养皿放在冰上，使用手术镊和剪刀分离白膜和鞘膜。
(2)将睾丸实质转入到另一个盛有预冷缓冲液的培养皿中(仍在冰上)，进行表面漂洗，去1～3g组织进行机械剪成1mm3，并去除血管，并反复清洗。
(3)将剪碎的睾丸组织收集于15ml离心管中，用力摇晃数分钟，将离心管置于冰上，此方法重复3次，每次5min，去上清。
(4)在重力沉淀完成之后，需要用预先配置好的甘氨酸溶液进行迅速渗透数秒，之后使用缓冲液进行清洗。
(5)将睾丸组织置于培养皿中，借助镊子和体视镜或者用口径比较大的吸管进行吹打，尽可能仔细驱散生精管，时间不宜过长。
2.2组织消化
(1)将生精小管置于含20mL DNase I溶液的50mL锥形小管中，室温下孵育8min。
(2)用培养基终止消化，此过程释放的细胞是睾丸间质组织、睾丸间质细胞和肾小管细胞。吸去上清液，用HBSS冲洗3次，继续通过冰上重力沉淀松散的小管并丢弃上清液，此时可有效的去除大量杂质细胞。
(3)随后用10倍体积胶原酶溶液消化，在37℃下孵育30min，期间每3min摇晃一次，使酶与组织充分接触。
(4)用HBSS清洗消化后的组织，此时会有小量的聚集体，尽可能将其去除，清洗离心并去除上清液。
(5)向组织中加入3倍体积的胰酶和脱氧核糖核酸酶溶液(200ug/ml)，继续37℃消化20min，期间每3min摇晃1次。
(6)使用培养基进行终止消化，室温2000r/min离心3min，去除上清，使用培养基清洗3次。
(7)此时使用培养基将组织碎片和细胞重悬，对重悬液使用注射器针头反复吸取，使细胞解聚。
2.3细胞接种
(1)将解聚之后的液体进行细胞筛过滤，滤液经过2000r/min 3min重悬，并接种于明胶包被好的培养皿中，在37℃5％CO2下孵育。
(2)根据细胞悬液中的细胞大小即下沉速度不同和明胶具有吸附细胞的作用，进行差异贴壁法分离细胞，由于体细胞相对悬液中的其他细胞较大即可优先与明胶结合，而细胞悬液中的其它生殖细胞不易与明胶结合，在接种5～6h后，轻轻摇晃平皿或者用移液枪温柔吹打，将贴壁不牢和没有贴壁的细胞去除，之后加入新鲜的培养基进行继续培养，继续使用差异贴壁方法进行纯化。
(3)之后细胞在一天之内不受干扰，使用显微镜进行观察，除去漂浮的细胞进行进一步纯化。
2.4细胞培养与维护
(1)用倒置光学显微镜观察细胞。
(2)在无菌超净台中丢弃原有的培养基，适用于热的PBS温柔清洗，然后加入新鲜培养基。
3.细胞鉴定及结果
本实验采取形态学鉴定联合Hoechst33342染色以及荧光定量PCR分析法进行鉴定。
3.1形态学观察
采用Hoechst33342进行细胞核染色，在显微镜下对所提取的细胞进行观察，细胞均呈现双核，细胞轮廓呈椭圆形、三角形或不规则形状。本领域技术人员根据技术常识可知，睾丸其他体细胞为单核，细胞轮廓为长梭形。因此，形态学观察结果可以说明，利用本发明的方法分离得到的蒙古马睾丸支持细胞纯度较高，杂质细胞极少。
图1是睾丸支持细胞的第二代细胞的200x电镜图；图2是睾丸支持细胞原代培养72h的400x电镜图；图3是睾丸支持细胞悬液接种的200x电镜图；图4是睾丸支持细胞原代培养48h的10x电镜图；图5是睾丸支持细胞的第四代细胞的20x电镜图，可见细胞老化生长缓慢。
支持细胞He染色：苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。根据这一特性进行染色，进一步观察支持细胞的形态学。
(1)样品制备：对贴壁生长的支持细胞使用胰酶进行消化，调整好密度1x105/ml滴加于预先铺有玻片的24孔板中，培养适当时间取出爬片，使用DPBS进行清洗。
(2)样品固定：使用95％的乙醇固定20min，DPBS清洗2次，每次1min。
(3)核染色：使用苏木素染色3-5min，使用DPBS清洗3次，每次1min。
(4)分色：镜下观察，若细胞核染色过深，可以使用1％的盐酸酒精分散数秒，之后进行清洗。
(5)细胞质染色：浸入伊红染液1-2min，进行DPBS清洗3次，每次1min。
(6)吹干或者晾干，使用中性树胶进行封片，显微镜下观察。
图6是第1代睾丸支持细胞He染色后的400x电镜图；可见第1代睾丸支持细胞贴壁伸展的形态不均匀，胞体伸出的突起较少，细胞间连接不紧密。图7是睾丸支持细胞的第二代细胞He染色后的200x电镜图；图8是睾丸支持细胞的第二代细胞He染色后的的100x电镜图；可见第2代睾丸支持细胞贴壁形态趋于稳定并且分布较为均匀，细胞生长速度较快，细胞体积增大、胞质丰富，胞核呈卵圆形；细胞突起增多、排列紧密、相互间连接呈片状。
3.2荧光定量PCR分析
然后以支持细胞特异性基因GATA4和GDNF作为目的基因，以马的成纤维细胞作为对照组，根据基因设计引物序列(引物序列信息如下表1所示)，两组均以GAPDH作为内参基因，进行QRT-PCR扩增，利用荧光信号积累实时监测检测基因中的差异表达情况。
本实验的结果表明，支持细胞的GATA4和GDNF基因相对表达量明显高于成纤维细胞的表达量(GATA4、GDNF基因的表达情况如附图9所示)，根据单因素方差分析两细胞的表达量差异，结果为P值小于0.001，差异极其显著，证明本次实验成功的分离出了蒙古马睾丸支持细胞。
表1引物序列信息
Figure BDA0002319318500000111
根据上述说明书的揭示和教导，本领域技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本申请并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本申请的一些修改和变更也应当落入本申请的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本申请构成任何限制。

Claims (10)

1.一种体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)组织解离和清洗
在4℃环境中，将采集的蒙古马睾丸组织样本置于冰上，消毒、脱囊、分离白膜和鞘膜、剪碎、除去血管；清洗后收集到离心管中，反复置于冰上进行重力沉淀；对重力沉淀后的样本，用甘氨酸溶液进行迅速渗透，然后使用缓冲液清洗；对清洗后的样本进行吹打，使生精小管从组织中解离；
(2)组织消化
将生精小管置于DNase I溶液中，在室温下孵育5～10分钟；然后用培养基终止消化，弃上清，对沉淀用HBSS冲洗后置于冰上进行重力沉淀；将沉淀物用胶原酶溶液消化，在37℃下孵育20～40分钟，得到消化后的组织；
清洗消化后的组织，除去聚集体，离心并去除上清液；加入胰蛋白酶溶液和脱氧核糖核酸酶溶液，继续消化10～30分钟，使用培养基进行终止消化，在室温下离心，弃上清，使用培养基将离心所得的组织碎片和细胞进行重悬，对重悬液使用注射器的针头反复吸取，使细胞解聚；
(3)细胞接种
对细胞解聚之后的样本进行细胞筛过滤，滤液重悬，接种于培养皿中，进行孵育1～2天，除去漂浮的细胞，进行纯化；
(4)细胞培养与维护
观察细胞生长状态，按时更换培养基并适时传代，即得蒙古马睾丸支持细胞。
2.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，所述组织解离和清洗的步骤中，反复置于冰上进行重力沉淀的操作为：将所述离心管摇晃后置于冰上5～10分钟，弃上清，重复3～5次。
3.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，所述甘氨酸溶液为：青霉素、链霉素、甘氨酸、EDTA0和胰蛋白酶抑制剂溶解于HBSS中得到的溶液。
4.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，所述胶原酶溶液为IV型胶原酶和DNase I溶解于HBSS中得到的溶液。
5.根据权利要求3所述的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核酸酶溶液为DNase I溶解于所述甘氨酸溶液中得到的溶液。
6.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶溶液为胰蛋白酶和DNaseI溶解于HBSS中得到的溶液。
7.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，所述培养基为DMEM-F12培养基。
8.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，所述组织解离和清洗的步骤中，对清洗后的样本进行吹打的操作为：借助镊子、体视镜或用吸管进行吹打。
9.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，所述组织消化的步骤中，对重悬液使用针头反复吸取的操作为：通过20ml注射器的18G针头进行15～25次反复吸取。
10.根据权利要求1所述的体外分离培养蒙古马睾丸支持细胞的方法，其特征在于，所述细胞培养与维护的步骤中，使用倒置光学显微镜观察细胞生长状态。
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