CN110777109B - 泥蚶性腺组织生殖细胞分离与培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开泥蚶性腺组织生殖细胞分离与培养的方法，先在无菌条件下用无菌注射器吸取泥蚶性腺组织，消毒，用含0.05％胰酶和0.2％胶原酶的混合液，23℃条件下消化酶解性腺组织，收集细胞悬液，离心，去除上清，沉淀的细胞用消毒缓冲液悬浮，雄性性腺组织取精细胞时的水平离心速度为2600rpm/m，雌性性腺组织取卵细胞的水平离心速度为1600rpm/m，取细胞悬浮液，铺6孔板，在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养24h，然后正置，每孔加入1mL培养基，此后每2d更换一半培养基，恒温静置培养5‑10d，进行原代培养，本发明通过大量的基础实验选择泥蚶性腺组织的培养条件，使得性腺细胞能够在体外分离、纯化、培养并存活。

Description

泥蚶性腺组织生殖细胞分离与培养的方法

技术领域

本发明涉及贝类养殖技术领域，尤其是涉及泥蚶性腺组织生殖细胞分离与培养的方法。

背景技术

泥蚶，属软体动物门，双壳纲，列齿目，蚶科，蚶属。中国传统的养殖贝类。中国沿海各地均有分布，8～10月份产卵期为生产旺季。此外，河北、山东、浙江、福建、广东均进行人工养殖，产量颇丰。泥蚶肉味鲜美，可鲜食或酒渍，亦可制成干品，蚶肉含多量蛋白质和维生素，蚶血鲜红，肉的边沿有一金丝似的色线。

泥蚶的性腺组织易于观察和操作，是进行显微操作、开展生殖发育生物学的良好素材，性腺细胞的体外培养对于研究性腺细胞的自我更新及分化的调控机制具有重要的理论意义，而且性腺细胞能够正常表达性别相关特异功能基因，从而可广泛应用于性别相关基因的功能验证研究，对于研究泥蚶性别分化及性别决定具有重要的实际意义。然而目前关于泥蚶的性腺细胞体外培养的方法国内外未见报道，而其他贝类的性腺细胞体外培养方法并不适用于泥蚶性腺细胞体外培养上，因此研究一种泥蚶的性腺细胞体外培养方法至关重要。

发明内容

本发明的目的是针对为了提供一种细胞培养稳定的泥蚶性腺组织生殖细胞分离与培养的方法，包括以下步骤：

步骤一、在无菌条件下，打开泥蚶的性腺，用无菌注射器吸取性腺组织，

步骤二、将步骤一制备的性腺组织放入消毒缓冲液中浸泡，离心去除消毒缓冲液，

步骤三、用含0.05％胰酶和0.2％胶原酶的混合液，23℃条件下消化步骤二中离心的性腺组织，轻轻吹打，得到性腺组织块和细胞悬液，收集细胞悬液，离心，去除上清，沉淀用消毒缓冲液悬浮冲洗，再次离心后，去除上清液，沉淀的细胞用消毒缓冲液悬浮，雄性性腺组织取精细胞时的水平离心速度为2600rpm/m，雌性性腺组织取卵细胞的水平离心速度为1600rpm/m，

步骤四、将步骤三中的细胞悬浮液，铺6孔板，在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养24h，

步骤五、将步骤四中细胞干贴培养结束后的6孔板，正置，每孔加入1mL培养基，此后每2d更换一半培养基，恒温静置培养5-10d，进行传代培养。

进一步的，所述步骤二中消毒缓冲液包括缓冲液、抗生素贮备液和两性霉素B贮备液，所述缓冲液由25.5g/LNaCl、0.8g/L Na₂SO₄和2.86g/L HEPES配置而成，所述抗生素贮备液含有100U/ml氨苄青霉素钠、100μg/ml硫酸链霉素、80μg/ml硫酸庆大霉素、40μg/ml硫酸卡那霉素，所述两性霉素B贮备液为两性霉素B加入二甲基亚砜配置为终浓度2.5μg/ml。

进一步的，步骤五中的培养基为在DMEM培养基内添加下列质量百分比的物质：18.05g/L NaCl、0.29g/L KCl、5.48g/L MgCl₂.6H₂O、4.28g/L Mg₂SO₄.7H₂0、2.86g/L HEPES、1.2g/L CaCl₂.2H₂O、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、80μg/ml硫酸庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B、15％胎牛血清。

进一步的，所述步骤三中的性腺组织块收集后，通过离心去除上清液，重复步骤三进行消化，再次收集细胞，消化重复的次数为五次，其消化时间分别为10min、10min、15min、15min、15min。

本发明具有如下优点：

本发明通过大量的基础实验选择泥蚶的性腺组织的最佳处理方式，通过选择消毒缓冲液的最佳配比，在不伤害性腺细胞的前提下提高消毒灭菌性能，采用0.05％胰酶和0.2％胶原酶的配比酶解液进行消化，并筛选最优的离心速率，能够使得收集的精子或者卵子杂质少，并且消化后的组织均匀并且性腺细胞形状规则，通过选择培养基的最佳配比，使得性腺细胞稳定获得并存活。

附图说明

图1a为泥蚶卵巢组织体外培养的原代细胞(400倍)显微镜观察图,1b为泥蚶精巢组织体外培养的原代细胞(400倍)显微镜观察图,；

图2为泥蚶卵细胞和精细胞原代细胞Foxl2基因表达；

图3为17β-雌二醇诱导下的泥蚶性腺细胞Foxl2基因表达；

图4为对比例1制备的细胞悬浊液的显微镜观察图。

具体实施方式

下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。

1实验材料

泥蚶二龄健康个体，性腺周期处于成熟期。

2试剂

2.1试剂来源

青链霉素混合液：索莱宝，P1400

HEPES：Sigma，H9136

氨苄青霉素钠：Amresco，0339

硫酸链霉素：Amresco 0382

硫酸庆大霉素：Amresco，0304

硫酸卡那霉素：Amresco，0408

两性霉素B：Sigma，V900919

胎牛血清：Thermo Fisher，10099，特级胎牛血清–澳大利亚

其他药品为国药分析纯。

2.2试剂配置

(1)消毒缓冲液配置

先配置NaCl、Na₂SO₄、HEPES缓冲液，配置比例如表1，临用前添加抗生素贮备液，冰浴后备用，两性霉素B贮备液使用二甲基亚砜(DMSO)配置，配置比例如表2，其余试剂均使用重蒸馏水配制。

表1缓冲液

表2消毒液

(2)培养基配置

以DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养基为基础培养基，添加无机盐和HEPES来调整培养基渗透压，添加抗生素抑制微生物繁殖，配置比例如表3，配置方法：分别称量下列药品于DMEM培养液中搅拌溶解，再加入抗生素贮备液，抽滤，最后加入胎牛血清。

表3培养基

实施例1

(1)清洗泥蚶表面，去除泥沙、微藻等附着物，在砂滤海水中暂养1d，使用青链霉素混合液1×浸泡24h，消毒备用。

(2)泥蚶体表用70％酒精棉擦拭干净，打开壳，用消毒缓冲液冲洗泥蚶组织，置于无菌超净操作台上。用无菌眼科手术剪打开性腺，再用20ml无菌注射器(无针头)吸取性腺组织。

(3)将性腺组织分别放入包含10ml预冷消毒缓冲液的培养皿中在冰浴条件下进行消毒，20min后更换消毒缓冲液，期间缓慢摇晃培养皿，离心去除消毒缓冲液。

(4)用含0.05％胰酶和0.2％胶原酶的混合液，23℃，8min，消化性腺组织，轻轻吹打，得到性腺组织块和细胞悬液。收集细胞悬液，离心，去除上清，沉淀用消毒缓冲液悬浮冲洗，再次离心后，去除上清液，沉淀的细胞用培养基悬浮，分离性腺组织的水平离心机离心速度为精细胞为2600rpm/m,卵细胞为1600rpm/m。

(5)收集性腺组织块，离心，去除上清，重复步骤(4)，再次收集细胞，用培养基悬浮，消化重复的次数为五次，其消化时间分别为10min、10min、15min、15min、15min。

(6)显微镜下调整细胞密度后，铺6孔板，在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养24h，正置，每孔加入1mL培养基，此后每2d更换一半培养基，恒温静置培养6d后观察细胞生长状况。

对比例1

与实施例1的区别在于步骤4中采用0.2％胰酶和0.2％胶原酶的混合液，23℃，15min，进行消化酶解，并在步骤5中消化重复的次数为一次，其消化时间为15min。

对比例2

与实施例1的区别在于步骤4中采用0.3％胰酶和0.4％胶原酶的混合液，23℃，15min，进行消化酶解，并在步骤5中消化重复的次数为一次，其消化时间为15min。

实施例1-3以及对比例1培养的性腺原代细胞的特征分别为：实施例1离心沉淀后的细胞悬浊液中的精子和卵子形状规则，卵细胞呈规则卵圆形，表明其发育正常，可被受精以及用于其他生物学实验，对比例1离心沉淀后的细胞悬浊液的杂质含量较高，对比例2离心沉淀后的细胞悬浊液的卵细胞两端呈梭形，表示其为发育不完全卵子，不能受精，或者受精后发育畸形，其中实施例1培养的原代精细胞和卵细胞如图1所示，对比例1的细胞悬浊液在光学显微镜200倍下观察，如图4所示，图中圆形的是卵子，其余为卵巢组织中的间质细胞、滤泡等其他物质，可以明显看出杂质含量较高。

实施例2泥蚶性腺细胞雌激素诱导后，性腺发育相关功能基因Foxl2基因荧光表达

取26℃生化培养箱培养4d后的精细胞和卵细胞，更换已经加入7β-雌二醇的培养基继续培养48h，设置多浓度的实验组，7β-雌二醇的浓度分别为60pg/ml、300pg/ml、600pg/ml，然后用无菌巴氏吸管吹打吸取细胞，转移到15ml无菌离心管中，离心后去除培养基，提取RNA，采用实时定量PCR技术分析性腺中Foxl2基因表达水平及雌激素诱导对该基因表达的影响。结果如图2表明，Foxl2基因在卵细胞中表达量是雄性性腺表达量的13倍，表明该基因在精卵中均有表达，在卵子中的表达量高于精子。添加17β-雌二醇后，卵细胞中Foxl2基因表达在低浓度60pg/ml略微上调，在高浓度组(300和600pg/ml)显著下调，结果如图3所示。精细胞中该基因均表达下调。说明17β-雌二醇抑制了TgFoxl2基因表达，原代细胞可用于基因表达，外源物质干扰效果分析，对于性别相关功能基因和性别分化的研究具有重要意义。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.泥蚶性腺组织生殖细胞分离与培养的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、在无菌条件下，打开泥蚶的性腺，用无菌注射器吸取性腺组织；

步骤二、将步骤一制备的性腺组织放入消毒缓冲液中浸泡，离心去除消毒缓冲液，所述步骤二中消毒缓冲液包括缓冲液、抗生素贮备液和两性霉素B贮备液，所述缓冲液由25.5g/LNaCl、0.8g/L Na₂SO₄和2.86g/L HEPES配制 而成，所述抗生素贮备液含有100U/ml氨苄青霉素钠、100μg/ml硫酸链霉素、80μg/ml硫酸庆大霉素、40μg/ml硫酸卡那霉素，所述两性霉素B贮备液为两性霉素B加入二甲基亚砜配制 为终浓度2.5μg/ml；

步骤三、用含0.05％胰酶和0.2％胶原酶的混合液，23℃条件下消化步骤二中离心的性腺组织，轻轻吹打，得到性腺组织块和细胞悬液，收集细胞悬液，离心，去除上清，沉淀用消毒缓冲液悬浮冲洗，再次离心后，去除上清液，沉淀的细胞用消毒缓冲液悬浮，雄性性腺组织取精细胞时的水平离心速度为2600rpm/m，雌性性腺组织取卵细胞的水平离心速度为1600rpm/m，性腺组织块收集后，通过离心去除上清液，重复步骤三进行消化，再次收集细胞，消化重复的次数为五次，其消化时间分别为10min、10min、15min、15min、15min；

步骤四、将步骤三中的消化5次后收集的细胞悬浮液，铺6孔板，在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养24h；

步骤五、将步骤四中细胞干贴培养结束后的6孔板，正置，每孔加入1mL培养基，此后每2d更换一半培养基，恒温静置培养5-10d，进行传代培养；

步骤五中的培养基为在DMEM培养基内添加下列质量百分比的物质：18.05g/L NaCl、

0.29g/L KCl、5.48g/L MgCl₂· 6H₂O、4.28g/L Mg₂SO₄· 7H₂0、2.86g/L HEPES、1.2g/LCaCl₂· 2H₂O、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、80μg/ml硫酸庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B、15％胎牛血清。

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