CN109486680B - 一种柞蚕微孢子虫株（系）的分离、培养及保存的方法 - Google Patents

一种柞蚕微孢子虫株（系）的分离、培养及保存的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柞蚕微孢子虫株(系)分离、培养及保存的方法。利用柞蚕精巢或卵巢组织制备原代细胞，分离、培养柞蚕微孢子虫；利用柞蚕蛹期滞育可以长期储存的特点，将柞蚕原代细胞分离、培养的柞蚕微孢子虫经发芽后注射入健康柞蚕蛹体进行继代培养和长期保存；通过原代细胞分离、培养和蛹体增殖、保存的交替、循环进行，经多次传代后可分离出纯净微孢子虫株(系)。该技术体系无需依赖稳定细胞系，突破了尚未有稳定柞蚕细胞株(系)建立而柞蚕微孢子虫在其他昆虫细胞系中不增殖的瓶颈。方法简单易行，分离、保存的微孢子虫株(系)纯净、活力高。本发明为进一步探索柞蚕微孢子虫侵染、传播规律和提升柞蚕微粒子病防控效果提供了有力支持。

Description

一种柞蚕微孢子虫株（系）的分离、培养及保存的方法
技术领域
本发明属于昆虫研究领域，具体涉及可感染柞蚕的微孢子虫株(系)的分离、传代培养及保存的方法。
背景技术
柞蚕(Antheraeae pemyi)为鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属昆虫，是我国特有的昆虫资源，有着悠久的放养历史。作为我国传统的食用昆虫、泌丝昆虫及工业原料，为国家外贸的增长和人民生活水平的提高做出了重大贡献。然而，柞蚕业的发展受到柞蚕微粒子病的困扰，柞蚕微粒子病在丝茧生产上一般年份的发病率为30％～70％，有些年份可高达90％以上，给柞蚕生产带来重大的经济损失，蚕农每年损失达上亿元。因此，迫切需要探明微粒子病病原的发育特点、侵染方式和分子特征，从而建立更有效的微粒子病防控体系，减少柞蚕业损失。
柞蚕微粒子病现已证实是由微孢子虫(Microsporidium)侵染柞蚕导致，微孢子虫属微孢子门微孢子目，是专性细胞内寄生的单细胞生物，无法直接进行离体培养，只能通过细胞及活体材料等进行培养、增殖。已报道微孢子虫超过200个属、1500多种，宿主范围包括脊椎和无脊椎动物，在细胞和分子水平上分析微孢子虫种株及发育机制是开展早期检测、预防及开发治疗药物的基础。因而建立柞蚕微孢子虫有效的体外培养方法，分离感染柞蚕的不同微孢子虫株(系)，建立柞蚕微孢子虫培养、增殖和保存的技术体系十分必要，将显著加速对柞蚕微孢子虫发育特点、侵染方式及分子特征的了解，从而有效提升柞蚕微粒子病的控制，从而降低柞蚕业损失。
目前尚未见柞蚕微孢子虫株(系)分离、培养及保存技术体系的相关报道。有报道，家蚕微孢子虫株(系)的分离，采用幼虫期添食微孢子虫，染病家蚕在室内人工饲养传代，微孢子虫在家蚕体内不断增殖，经过8-10代传代培养后，继而分离出优势的微孢子虫株(系)[黄旭华等，南方农业学报，2012，43(7)：1049-1053.]。然而，柞蚕不同于家蚕，它是野外放养昆虫，生长环境复杂，室内饲养很难成活，因而无法采用这种方法分离微孢子虫的纯净株(系)，且这种方法周期长，费时费力，添食不当或环境污染等因素很容易引起其他微孢子虫株(系)的二次污染。
因而，在家蚕微孢子虫株(系)分离与培养方面，现在主要通过稳定的家蚕细胞系和可被家蚕微孢子虫侵染的其他昆虫细胞系来实现。这种方法需要先从家蚕体中获得家蚕微孢子虫，让其侵染细胞，随着细胞的传代培养，微孢子虫在细胞内不断增殖，经过多代培养后逐渐分离出家蚕微孢子虫株(系)，并随着细胞继代培养而保存下来，从而实现家蚕微孢子虫的分离、培养及保存。[1.家蚕微孢子虫在昆虫细胞中的增殖及CQ1株(系)建立的研究.西南大学硕士论文，2009；2.遗传，2009，31(11):1121-1126；3.蚕业科学，2005，31(2):151-154； 4.蚕业科学,1999,25(2):92-95；5.蚕业科学,2003,29(3):260-263；5.CN201610465548.2.]。但这些方法的首要前提是：需要稳定的细胞系且该细胞系能被微孢子虫感染、微孢子虫在侵染细胞后能在细胞中不断增殖。而且，这种方法因为要维持细胞存活、传代培养来保证微孢子虫的增殖与保存，而细胞的传代培养条件又比较繁琐，需要不断更换细胞培养液，维持环境的无菌化等，导致科研人员工作量大，资源浪费严重；同时，随着细胞培养代数的增加孢子活力不断退化。因而，近年来，公开了低温-80℃或液氮冻存复苏的方式来保存感染家蚕微孢子虫的家蚕胚胎细胞来保存微孢子虫的方法[蚕业科学,2014，40(6):1055-1061； CN201510233118.3]，但冻存后对孢子活力具有较大损害。
综上，柞蚕微孢子虫株(系)分离、培养及保存技术的建立存在相当大的难度，因为尚未有稳定的柞蚕细胞株(系)建立，虽然柞蚕精巢和卵巢细胞已被公开能被柞蚕微孢子虫侵染，但其继代培养十分困难，难以进行传代、增殖。同时，前期工作显示柞蚕微孢子虫在其他昆虫细胞系sf21、High5和BmN中不能侵染和增殖，因而通过侵染细胞、进行细胞传代培养来实现柞蚕微孢子虫株(系)的培养、增殖及保存，借鉴现有技术很难实现。
发明内容
鉴于上述柞蚕微孢子虫株(系)分离、培养及保存技术中的难点，利用柞蚕蛹期滞育可长期储存的特点，本发明现公开一种利用柞蚕卵巢和精巢原代细胞分离柞蚕微孢子虫株(系)，并在柞蚕蛹内进行柞蚕微孢子虫株(系)培养、增殖及长期保存的技术体系，该方法无需依赖稳定的细胞系进行柞蚕微孢子虫的增殖、培养，操作简单，效率高，可大量获得不同株(系) 的纯净微孢子虫，并可长期稳定保存，保存的微孢子虫活力始终较强。该技术体系的建立，对于研究柞蚕微孢子虫的侵染机制，建立遗传操作方法进行柞蚕微孢子虫功能基因组学研究，创新柞蚕微粒子病防控技术手段，降低柞蚕业经济损失具有重要意义。
本发明的首要目的是，提供一种柞蚕微孢子虫株(系)的分离方法，方法操作简易，分离的柞蚕微孢子虫株(系)纯净、活力强。
为实现上述目标，本发明公开的技术方案显著区别于现有技术，具体为包含下述关键环节：
(1)获得健康柞蚕精巢或卵巢原代细胞；
(2)从已感染柞蚕微孢子虫的柞蚕材料中获得感染柞蚕微孢子虫的柞蚕精巢或卵巢原代细胞，并通过与步骤(1)获得的柞蚕原代细胞混合，进行柞蚕微孢子虫的培养与增殖；
(3)从步骤(2)获得的混合培养物中提取柞蚕微孢子虫，进行发芽处理后注射入健康柞蚕蛹体内进行继代培养与增殖；
(4)取步骤(3)获得的柞蚕蛹作为步骤(2)的材料依次进行步骤(2)和(3)；
(5)重复步骤(4)多次，实现柞蚕微孢子虫株(系)在柞蚕精巢或卵巢原代细胞中的分离。
具体的，上述技术方案中，步骤(1)所述健康柞蚕原代细胞的制备，具体为：取出健康柞蚕卵巢或精巢组织，洗涤，剪碎后加入少量细胞培养液，吸管温和抽吸后，直接将悬液连同组织块一起接种于细胞培养板中，将小块均匀涂布于细胞孔的板底，一般而言，对于6孔板而言，每孔接种10-15个卵巢或精巢为宜，然后向细胞孔内加入适量培养基，于26-28℃静置培养，得到健康柞蚕原代细胞培养液。
具体的，上述技术方案中，步骤(2)所述感染柞蚕微孢子虫的柞蚕材料可以是由野外采集或人工饲养的，在人为添食、注射或非人为自然条件下感染柞蚕微孢子虫的感病、发病或者死亡的柞蚕幼虫、蛹、蛾或卵等。
具体的，上述技术方案中，步骤(2)所述获得感染柞蚕微孢子虫的柞蚕精巢或卵巢原代细胞，具体为将感染柞蚕微孢子虫的柞蚕材料进行表面消毒，依次用体积分数为75％的乙醇浸泡15-20分钟、无菌纯净水冲洗2-3次。无菌条件下取单个柞蚕卵巢或精巢组织，分别剪碎后200目筛网过滤，接种于培养板中，挑选出感染柞蚕微孢子虫的柞蚕原代细胞。
具体的，上述技术方案中，步骤(2)所述通过与步骤(1)获得的原代细胞混合，进行柞蚕微孢子虫的培养与增殖，具体为：向获得的感染柞蚕微孢子虫的柞蚕精巢或卵巢原代细胞中加入适量培养基制备成悬浮液，于26-28℃中培养，并每隔5-7天向1倍体积的悬浮液中加入2倍体积的由步骤(1)获得的细胞培养液，于26-28℃静置培养，实现柞蚕微孢子虫在柞蚕精巢或卵巢原代细胞中的培养与增殖。
具体的，所述培养基可以是分别均添加了20％胎牛血清和1％青链霉素的TC-100、MGM-448或Grace等能使细胞生长、增殖的液体。
具体的，上述技术方案中步骤(3)所述从步骤(2)获得的混合培养物中提取柞蚕微孢子虫，具体为：将混合培养物转移至离心管中，2000-6000rpm/min离心3-10min，去上清，得到柞蚕微孢子虫。
具体的，上述技术方案中步骤(3)所述发芽处理，具体为：在提取的柞蚕微孢子虫中加入100-1000μL 0.05-0.4M的单一或混合的KOH、NaOH、NaHCO3和Na2CO3溶液，微微震荡，悬浮微孢子虫，26-28℃下静置10-60min使柞蚕微孢子虫部分或全部发芽。作为优选的方案，孢子发芽率≥50％。
具体的，上述技术方案中，步骤(3)所述将发芽处理后的柞蚕微孢子虫注射入健康柞蚕蛹体内培养，具体为发芽后的微孢子虫离心去掉溶液，生理盐水清洗1-3次，用生理盐水调微孢子虫浓度至1×105～1×107spores/mL，蛹体表面酒精消毒，然后用一次性无菌注射器注射柞蚕健康蛹，作为优选的方案，注射腹部第一腹节，每个蛹注射50-200μL，10-35℃下放置 10-15天后转入2-6℃低温保存。
具体的，上述技术方案中，所述柞蚕健康蛹通过筛选获得，具体操作为：收集柞蚕蛹2-6℃保存备用，取柞蚕蛹表面消毒，挑取少量脂肪体组织，伤口消毒后用胶水、液体蜡等封口，挑取的组织用于提取DNA/RNA，采用分子检测技术(如PCR检测)进行样品蛹中柞蚕微孢子虫的鉴定，筛选出无微孢子虫感染的健康蚕蛹。
具体的，上述技术方案中，所述PCR检测可以是靶标柞蚕微孢子虫保守或者特异基因组 DNA或RNA的常规PCR，荧光定量PCR，重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，环介导等温扩增技术(LAMP)等。
具体的，上述技术方案中，所述的常规PCR检测方法如下：每25μL体系含如SEQ IDNO:1 和SEQ ID NO:2所示的引物(10pM)各0.5μL、模板DNA 2μL、rTaq 0.25μL，10×Buffer2.5 μL，dNTPs 2μL，去离子水17.25μL。PCR条件为95℃4min；以95℃30秒，60℃30秒,72℃ 1分钟进行40个循环，再在72℃下延伸5min，得到的PCR产物进行凝胶电泳，173bp处无特异性出峰，判定为阴性，即样品蛹未感染微孢子虫。
具体的，上述技术方案中，所述的荧光定量PCR检测方法如下：所用仪器为ABI7500 荧光定量PCR仪。每20μL体系含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物(10pM)各0.4μL、模板DNA 2μL、SYBR Premix ExTaq II 10μL，ROX Reference Dye 0.4μL，去离子水6.8μL。荧光定量PCR条件为95℃30秒；以(95℃5秒，60℃31秒)进行40个循环，熔解曲线反应条件为：95℃15s，60℃60s，95℃15s，60℃15s。作为参照，DNA模板还包含阳性参照和水。结果判定:根据Ct<35，溶解曲线和阳性参照在相同位置出峰进行阳性结果判定，反之，则为阴性，即未感染微孢子虫。
上述技术方案中，步骤(5)所述的重复步骤(4)多次，具体操作为：将步骤(2)中培养的柞蚕微孢子虫，按照步骤(3)注射到纯净的柞蚕蚕蛹中进行继代培养，得到柞蚕微孢子虫株(系)一代，按照步骤(4)将步骤(3)得到的含有柞蚕微孢子虫株(系)一代的柞蚕蛹作为原材料进行步骤(2)，然后按步骤(3)进行继代培养，得到感染柞蚕微孢子虫株(系) 二代，如此重复多次，经过约8-12个月，微孢子虫株(系)8-10次传代，从而分离出纯净的、形态均一的优势目标柞蚕微孢子虫株(系)。
本发明的另一方面在于公开了一种所述柞蚕微孢子虫及其株(系)的保存方法，具体为：将想保存的柞蚕微孢子虫或者利用上文所述柞蚕微孢子虫株(系)的分离方法所获得的柞蚕微孢子虫株(系)，用生理盐水调浓度至1×105～1×107spores/mL，取健康柞蚕蛹表面酒精消毒，然后用一次性无菌注射器注射柞蚕健康蛹，作为优选的方案，注射腹部第一腹节，每个蛹注射50-200μL，10-35℃下放置10-15天后转入0-4℃低温避光保存；不断重复上述操作可实现柞蚕微孢子虫的长期保存。
具体的，作为优选的柞蚕微孢子虫株(系)高纯净度的长期保存方案，将上述保存柞蚕微孢子虫株(系)的柞蚕蛹，按照上文所述方法获得感染柞蚕微孢子虫株(系)的柞蚕精巢或卵巢原代细胞，进行培养、增殖后，提取该株(系)柞蚕微孢子虫，按上文所述方法发芽处理后再次注射新结茧化蛹的健康蛹，作为优选的方案，注射腹部第一腹节，每个蛹注射50-200μL，于10-35℃下放置10-15天后转入0-4℃低温避光保存；如此反复可实现柞蚕微孢子虫株(系)的长期保存。
本发明的有益效果在于：
1.柞蚕微孢子虫株(系)分离至今尚未见系统技术公开，本发明提供了一种柞蚕微孢子虫株(系)分离、培养及保存的系统技术，利用该技术能逐渐分离得到柞蚕微孢子虫的不同株(系)，这将加速柞蚕微孢子虫的侵染机制、功能基因组学、流行病学等相关研究，从而创新柞蚕微粒子病防控技术手段，将显著降低柞蚕业经济损失，提升我国柞蚕业产值。
2.本发明公开了一种行之有效的柞蚕微孢子虫株(系)分离、培养及保存的方法，不仅区别于现有技术，同时具有显著优点。本发明采用柞蚕原代精巢或卵巢细胞分离、培养柞蚕微孢子虫和用柞蚕蛹继代培养、保存柞蚕微孢子虫的交替循环来进行柞蚕微孢子虫株(系) 分离、培养及保存，不用室内饲养小蚕，也无需稳定细胞系的继代培养，突破了柞蚕尚未建立稳定细胞系且常见其他昆虫细胞系不能增殖柞蚕微孢子虫的瓶颈。
3.本发明采用柞蚕精巢或卵巢原代细胞增殖柞蚕微孢子虫。柞蚕精巢或卵巢原代细胞是从柞蚕体内分离，是柞蚕微孢子虫的天然宿主细胞，因而具备柞蚕微孢子虫感染增殖的最佳条件，相较其他异源细胞更适于孢子侵染增殖。[潘国庆等，家蚕微孢子虫侵染家蚕胚胎细胞与草地贪夜蛾细胞的病变比较，重庆师范大学学报(自然科学版)，2005.22(3)：25-28.]
4.本发明采用柞蚕蛹进行柞蚕微孢子虫的继代培养及保存，相比现行依赖细胞系的技术具有显著优势：(1)作为柞蚕微孢子虫继代培养、保存的载体，材料廉价、易得，储存容易，便于操作。现行技术使用细胞系作为微孢子虫继代培养与保存的载体，材料昂贵，细胞系的继代培养、储存条件苛刻，需要不断换液、环境消毒等繁琐操作。柞蚕是野外放养的变态昆虫，一年可放养1-2次，以蛹期滞育越冬，因而可以长期储存，低温下可储存长达一年之久。本发明以柞蚕蛹进行柞蚕微孢子虫的培养及保存，显著降低科研工作者劳动量，节约资源；同时，较其他生物材料而言，柞蚕蛹体积较大且不能运动，易于操作，便于宿主大规模增殖、保存微孢子虫；(2)柞蚕蛹无需进食，不受外界其他因素干扰，能保持体内柞蚕微孢子虫的纯净度。现公开的添食家蚕幼虫进行饲养生产和储存微孢子虫的方法，常因饲养过程中幼虫爬动相互抓伤或进食有污染桑叶而造成微孢子虫的污染。而本发明中，蛹体内部是独立封闭的空间，不易受外界环境干扰，从而保证了体内培养和储存的微孢子虫的纯净度；(3)相比依赖细胞系培养、保存微孢子虫的现有技术而言，柞蚕蛹作为生物材料，存活时间长，培养、保存的柞蚕微孢子虫活力强，不易退化[北方蚕业,2002(4):31-32]。
附图说明
图1是本发明实施例1所述的感染微孢子虫蛹单个精巢组织制备的原代细胞；
图2是本发明实施例1所述的感染微孢子虫蛹单个卵巢组织制备的原代细胞；
图3是本发明实施例1所述的单个精巢组织制备的原代细胞中培养增殖的微孢子虫；
图4是本发明实施例1所述的单个卵巢组织制备的原代细胞中培养增殖的微孢子虫；
图5是本发明实施例1所述的单个精巢组织培养的微孢子虫在原代细胞中的继代扩繁情况；
图6是本发明实施例1所述的单个卵巢组织培养的微孢子虫在原代细胞中的继代扩繁情况；
图7是本发明实施例2所述的柞蚕蛹中增殖的微孢子虫发芽情况；其中，A为储存3个月的柞蚕蛹中微孢子虫发芽情况(1000X)；B为储存6个月的柞蚕蛹中微孢子虫发芽情况(1000X)；
图8是本发明实施例2所述的注射微孢子虫后，柞蚕蛹中微孢子虫的增殖情况；其中，A 为22℃放置10天后转入4℃保存的柞蚕蛹中微孢子虫的增殖情况；B为22℃条件下柞蚕蛹中微孢子虫的增殖情况；
图9是本发明实施例3所述的注射了柞蚕微孢子虫蛹的精巢原代细胞增殖的微孢子虫；
图10是本发明实施例3所述的注射了柞蚕微孢子虫蛹的卵巢原代细胞增殖的微孢子虫；
图11是本发明实施例4所述的柞蚕微孢子虫接种SF21细胞后的透射电镜观察；
图12是本发明实施例4所述的柞蚕微孢子虫接种High5细胞后的透射电镜观察；
图13是本发明的柞蚕微孢子虫株(系)分离、培养和保存的技术路线图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述。应该指出，以下说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语与本发明所属技术领域人员通常理解的含义相同。
本发明实施例所涉及的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为市售产品。
以下实施例中培养原代细胞使用的培养基为：TC-100培养液(购自德国PAN公司)，并按体积比分别添加20％胎牛血清(购自美国Hyclone公司)和1％青链霉素混合液(购自北京索莱宝科技有限公司)。
实施例1
柞蚕精巢或卵巢原代细胞分离、培养柞蚕微孢子虫
1.单个卵巢或精巢组织制备原代细胞分离、培养微孢子虫
将感染柞蚕微孢子虫的蚕蛹，用体积分数为75％的乙醇浸泡15分钟，于超净台内无菌水冲洗2次，放置于无菌纱布上吸干体表水分。无菌操作剪开腹部，取柞蚕蛹单个卵巢或精巢组织，于无菌的盛有生理盐水的小平皿中，剔除卵巢或精巢上粘连的脂肪组织和被膜等，放置于200目灭菌不锈钢MLM-筛网上，无菌小棒研磨，用400ml的TC-100培养液冲洗，接种于48 孔细胞培养板(底面积为0.7cm2/孔)中，置于27℃生化培养箱中静置培养(图1-2)，利用倒置相差显微镜每天观察细胞生长及孢子增殖情况，5-7d后筛选出有孢子增殖的无其它污染物的柞蚕原代细胞(图3-4)。
2.柞蚕正常原代细胞的制备
取多个健康柞蚕蛹，用体积分数为75％的乙醇浸泡15分钟，于超净台内无菌水冲洗2次，放置于无菌纱布上吸干体表水分。无菌操作剪开腹部，用眼科剪刀和镊子解剖取出卵巢组织，放置于盛有无菌生理盐水的小平皿中，剔除卵巢上粘连的脂肪组织和被膜等，再将卵巢转移至盛有无菌生理盐水的小烧杯中，洗涤3次。将卵巢组织剪成0.5-1mm3大小的组织块，加细胞培养液，用灭菌吸管温和抽吸后，直接将悬液连同组织块一起接种于6孔细胞培养板中，将小块均匀涂布于细胞孔的板底，一般每孔接种10-15个卵巢为宜，然后于细胞孔内加入适量培养基，27℃静置培养。
3.柞蚕微孢子虫在原代细胞中的增殖培养
将单个卵巢或精巢组织培养的柞蚕微孢子虫悬液，每5～7天按1：2的比例加入健康蛹制备的生长状态良好的柞蚕原代细胞中，用吸管轻轻混匀后，27℃生化培养箱中静置培养，每天观察微孢子虫增殖扩繁情况(图5-6)，进而获得无菌柞蚕微孢子虫。
4.结果说明
图1和图2分别是感染微孢子虫蛹的单个精巢和单个卵巢组织制备的精巢原代细胞和卵巢原代细胞。精巢原代细胞大小不一形态各异，卵巢原代细胞大小均一多为卵圆形和梭形；图3和图4分别是经过5-7d后显微镜观察筛选出的无其他污染物的单个精巢和单个卵巢组织制备的原代细胞中培养增殖出的微孢子虫情况；图5和图6分别是发病蛹单个精巢和单个卵巢组织原代细胞培养出的微孢子虫在正常原代细胞中继代增殖情况；
该实施例说明柞蚕原代细胞是柞蚕微孢子虫的天然宿主细胞，具备柞蚕微孢子虫感染增殖的最佳条件，相较其他异源细胞更适于微孢子虫侵染增殖；取精巢或卵巢组织操作方便，较脂肪、血球等组织更易于消毒去除杂菌，获得无污染孢子的效率更高，且细胞状态好、不易褐化死亡，存活时间较长，利于微孢子虫的增殖。
实施例2
柞蚕蛹继代培养及保存柞蚕微孢子虫
1.未感染微孢子虫健康蛹的筛选
饲养柞蚕至结茧化蛹，4℃保存备用。样品蛹编号后用75％的酒精进行体表消毒后，采用手术刀片于蛹背部划开约3mm的刀口，迅速用牙签挑取少许脂肪体置于组织裂解液中，用 75％的酒精棉消毒刀口，用融化的切片蜡(华灵牌)进行蜡封后，蛹于4℃储存待用。
挑取的脂肪体提取DNA，采用常规PCR技术和SYBR Green Real-time PCR技术进行样品蛹中微孢子虫分子的检测：
(1)常规PCR：每25μL体系含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物(10pM) 各0.5μL、模板DNA 2μL、rTaq 0.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，去离子水17.25μL。 PCR条件为95℃4min；以95℃30秒，60℃30秒,72℃1分钟进行40个循环，再在72℃下延伸5min，得到的PCR产物加入核酸染色剂，用2％的琼脂糖进行凝胶电泳，电泳结束后在紫外光下观测结果，173bp处无特异性出峰，判定为阴性，即样品蛹未感染微孢子虫。
(2)SYBR Green Real-time PCR：所用仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪。每20μL体系含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物(10pM)各0.4μL、模板DNA 2μL、SYBR PremixExTaq II 10μL，ROX Reference Dye 0.4μL，去离子水6.8μL。荧光定量PCR条件为 95℃30秒；以(95℃5秒，60℃31秒)进行40个循环，熔解曲线反应条件为：95℃15s， 60℃60s，95℃15s，60℃15s。作为参照，DNA模板还包含阳性参照和水。结果判定:根据Ct<35，溶解曲线和阳性参照在相同位置出峰进行阳性结果判定，反之，则为阴性，即未感染微孢子虫。
2.柞蚕微孢子虫株(系)的分离扩繁
将原代细胞培养的微孢子虫培养液5000rpm/min离心5min，去上清，加入500μL，0.1M 的KOH溶液，静置于27℃条件下发芽40min，取部分发芽孢子液进行Giemsa染色，未发芽的孢子内部的孢原质被染色，孢子稍变狭长；而发芽后的孢子明显增粗，孢子成中空状不被染色，统计发芽率。剩余发芽孢子液离心去掉KOH溶液，生理盐水洗3次，用生理盐水调孢子浓度至1×106spores/mL，蛹体表面酒精消毒，然后用一次性无菌注射器注射柞蚕健康蛹，每个蛹注射100μL。同时，将未经发芽处理的孢子作为对照组，同样蛹生理盐水调浓度至1×106 spores/mL后直接注射柞蚕蛹。两组柞蚕蛹均在室温下培养10-15天后转入4℃低温保存。镜检结果表明，发芽处理后的孢子注射柞蚕蛹后，蛹的发病率为100％，未经发芽处理的孢子注射柞蚕蛹后未发病。
发病柞蚕蛹在4℃储存3个月和6个月后，分离柞蚕微孢子虫，镜检观察形态均一，污染少。分离出来的微孢子虫经KOH发芽处理40min后，进行Giemsa染色。统计两个时间点的孢子发芽率。
3.结果说明
图7为储存不同时间后柞蚕微孢子虫的发芽情况，注射前微孢子虫发芽率为52.41％，注射后的柞蚕蛹在4℃储存3个月与6个月的微孢子虫发芽率分别为65.68％和64.84％，二者发芽率上没有明显差别，并较注射前微孢子虫发芽率略高，说明微孢子虫在蛹体储存过程中保持较好活力。
图8为不同存放温度条件下柞蚕蛹中微孢子虫增殖情况，A处理为22℃条件下放置10d 后，转入4℃存放条件下柞蚕蛹孢子增殖情况,结果表明在此条件下微孢子虫可以在蛹中缓慢增殖，对柞蚕蛹影响较小，有利于微孢子虫的长期储存；B处理为22℃存放条件下柞蚕蛹孢子增殖情况，结果表明微孢子虫在22℃条件下可以在蛹中快速大量增殖，有利于短期内获得大量微孢子虫，但柞蚕蛹发病严重容易死亡，进而不利于孢子的长期储存。
本实施例说明了以柞蚕蛹作为微孢子虫培养与保存的载体，材料易得，储存容易，干扰因素少，孢子纯净度高，孢子活力强。
实施例3
柞蚕微孢子虫株(系)的分离、培养与保存
经实施例1所述方法由柞蚕原代细胞培养的柞蚕微孢子虫，经实施例2所述的方法进行柞蚕微孢子虫继代培养、增殖及保存。低温保存微孢子虫的柞蚕蛹依次用体积分数为75％的乙醇浸泡15分钟、无菌水冲洗2次。无菌条件下取柞蚕蛹卵巢或精巢组织，分别剪碎后200 目筛网过滤，适量TC100培养液冲洗，接种于6孔细胞培养板(底面积为9.5cm2/孔)中，获得微孢子虫感染的柞蚕原代细胞。27℃静置培养，待微孢子虫增殖后，即分离到柞蚕微孢子虫株(系)一代。
将柞蚕微孢子虫株(系)一代按实施例2所述方法进行继代培养和保存，得到低温保存微孢子虫的柞蚕蛹依次用体积分数为75％的乙醇浸泡15分钟、无菌水冲洗2次。无菌条件下取柞蚕蛹卵巢或精巢组织，分别剪碎后200目筛网过滤，适量TC100培养液冲洗，接种于6 孔细胞培养板(底面积为9.5cm2/孔)中，获得微孢子虫感染的柞蚕原代细胞。27℃静置培养，待微孢子虫增殖后，即分离到柞蚕微孢子虫株(系)二代。
如此反复循环培养，经过8到10代培养即可分离、培养纯净的微孢子虫株(系)。
低温保存的注射了柞蚕微孢子虫株(系)的柞蚕蛹，可采用实施例1所述方法制备原代细胞培养得到的微孢子虫，经实施例2所述方法注射到柞蚕健康蛹中，室温放置10天后转入 0-4℃低温避光储存，如此重复操作，从而实现柞蚕微孢子虫及其株(系)的长期保存。
结果说明：
图9和图10为注射了柞蚕微孢子虫株(系)一代的柞蚕蛹的精巢和卵巢原代细胞增殖的微孢子虫，结果表明注射了微孢子虫株(系)一代的柞蚕蛹可以继续感染蛹的精巢和卵巢组织，且分离的精巢和卵巢原代细胞可以大量增殖微孢子虫，获得柞蚕微孢子虫株(系)二代。
该实施例说明，本发明建立的柞蚕微孢子虫株(系)分离、培养及保存的技术体系实施性强，操作简单、周期较短、节约人力和资源。
实施例4
柞蚕微孢子虫侵染其他昆虫细胞系
1.柞蚕微孢子虫接种High5和SF21昆虫细胞
High5和SF21细胞分别用完全TNM-FH培养基和SF-900TMⅡ无血清培养基传代培养至对数生长期，然后用吸管轻轻吹打，制成浓度为1.0×106/mL的细胞悬液备用。
制备好的微孢子虫经KOH发芽处理后，按(细胞数:孢子数＝1:30)的比例加入到细胞悬液中，轻轻摇动10min，使其充分混合后，接种于6孔细胞培养板中，每孔加入1mL孢子细胞混悬液，于27℃培养l小时，使其完全贴壁后，再用吸管轻轻除去培养液，重新加入新鲜的培养液后密封，置于27℃进行感染培养。
2.柞蚕微孢子虫接种昆虫细胞后的电镜样品制备
微孢子虫侵染昆虫细胞后，分别在不同时间点收集细胞液，以3000rpm离心5min，弃上清液，用4％的戊二醛溶液室温下固定3d，0.1mol/L磷酸缓冲液清洗三次，再用0.1mol/L 磷酸缓冲的1％OsO4溶液固定2h，再次用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)漂洗。50％、70％、80％、90％、95％乙醇梯度脱水，每种浓度15min；100％乙醇脱水20min；95％、100％丙酮、100％丙酮脱水，每次10min。丙酮加Epon812逐级渗透，Epon812环氧树脂原位包埋。将包埋板放进恒温箱中聚合，修块，LKB超薄切片机切片，醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色，电镜观察超薄切片样品。
4.结果说明
图11和图12是柞蚕微孢子虫接种High5和SF21昆虫细胞后的电镜观察，结果表明，柞蚕微孢子虫可以通过吞噬或胞饮作用进入High5和SF21细胞中，但在这两种细胞的整个病变过程中，均未观察到孢子增殖阶段的其他形态，柞蚕微孢子虫在这两种细胞中不能扩繁增殖。
实施例5
不同储存条件下柞蚕微孢子虫的发芽实验
经实施例2所述方法获得的发病柞蚕蛹于0-4℃条件下储存，分别在储存3个月和6个月后，分离收集蛹中微孢子虫，经KOH发芽处理40min后,将孢子进行涂片,热干燥后甲醇固定1min，Gimesa染色20min,水洗后干燥，显微镜下观察并统计孢子发芽率。
发芽率(％)＝发芽孢子数/孢子总数×100％
将原代细胞增殖的柞蚕微孢子虫悬液，分别置于10％DMS、0.9％NaCL(生理盐水)、30％甘油等保护液中，孢子终浓度为108spores/mL左右，然后于液氮中冻存3个月后，分离收集微孢子虫，经KOH发芽处理40min后,将孢子进行涂片,热干燥后甲醇固定1min，Gimesa染色20min,水洗后干燥，显微镜下观察，统计孢子发芽率。
表1不同保存液中储存3个月的微孢子虫发芽率
Figure BDA0001867399190000111
将原代细胞增殖的柞蚕微孢子虫悬液，3000rpm/min离心8分钟，用生理盐水调孢子浓度至108spores/mL左右，分别置于液氮、-20℃、4℃条件下储存，3个月后分离收集微孢子虫，经KOH发芽处理40min后,将孢子进行涂片,热干燥后甲醇固定1min，Gimesa染色20min,水洗后干燥，显微镜下观察，统计孢子发芽率。
表2不同温度下储存3个月的微孢子虫发芽率
Figure BDA0001867399190000112
结果说明：
由表1和表2所述实验结果显示，储存于0-4℃活蛹体内的柞蚕微孢子虫发芽率达65.68％，远远高于其他储存条件下微孢子虫的发芽率，表明在0-4℃低温活蛹储存条件下，微孢子虫能很好的保持自身活力。
该实施例说明，本发明采用柞蚕蛹作为柞蚕微孢子虫株(系)的大量增殖和保存体系，具有显著优势，保存的微孢子虫活力高。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神的范围内，对本文所述的内容在形式上和细节上作出改动或适当变更与组合来实现本发明技术，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
序 列 表
<110> 一种柞蚕微孢子虫株（系）的分离、培养及保存的方法
<120> 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所
<130> 2015
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 1
gacggaagaa taccacaagg agt 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 2
ctatatgagg gtctcacatc ttgt 24

Claims (9)

1.一种柞蚕微孢子虫株(系)分离方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)获得健康柞蚕精巢或卵巢原代细胞；
(2)从已感染柞蚕微孢子虫的柞蚕材料中获得感染柞蚕微孢子虫的柞蚕精巢或卵巢原代细胞，并通过与步骤(1)获得的柞蚕原代细胞混合，进行柞蚕微孢子虫的培养与增殖；
(3)从步骤(2)获得的混合培养物中提取柞蚕微孢子虫，进行发芽处理后注射入健康柞蚕蛹体内进行继代培养与增殖；
(4)取步骤(3)获得的柞蚕蛹作为步骤(2)的材料依次进行步骤(2)和(3)；
(5)重复步骤(4)多次，实现柞蚕微孢子虫株(系)在柞蚕精巢或卵巢原代细胞中的分离。
2.根据权利要求1所述的一种柞蚕微孢子虫株(系)分离方法，其特征在于：步骤(1)所述健康柞蚕原代细胞的制备方法为：取出健康柞蚕蛹的卵巢或精巢组织，洗涤，剪碎后加入少量细胞培养液，吸管温和抽吸后，直接将悬液连同组织块一起接种于细胞培养板中，将小块均匀涂布于细胞孔的板底，然后向细胞孔内加入适量培养基，于26-28℃静置培养，得到健康柞蚕原代细胞培养液。
3.根据权利要求1所述的一种柞蚕微孢子虫株(系)分离方法，其特征在于：步骤(2)所述获得感染柞蚕微孢子虫的柞蚕精巢或卵巢原代细胞，为将已感染柞蚕微孢子虫的柞蚕原材料进行表面消毒，依次用体积分数为75％的乙醇浸泡15-20分钟、无菌纯净水冲洗2-3次；无菌条件下取单个柞蚕蛹卵巢或精巢组织，分别剪碎后200目筛网过滤，接种于培养板中，挑选出感染柞蚕微孢子虫的柞蚕原代细胞。
4.根据权利要求1所述的一种柞蚕微孢子虫株(系)分离方法，其特征在于：步骤(2)获得的感染柞蚕微孢子虫的柞蚕精巢或卵巢原代细胞，通过与步骤(1)获得的柞蚕原代细胞混合，进行柞蚕微孢子虫的培养与增殖，具体为：向获得的感染柞蚕微孢子虫的柞蚕精巢或卵巢原代细胞中加入适量培养基制备成悬浮液，于26-28℃中培养，并每隔5-7天向1倍体积的悬浮液中加入2倍体积的由步骤(1)获得的细胞培养液，于26-28℃静置培养，实现柞蚕微孢子虫在柞蚕精巢或卵巢原代细胞中的培养与增殖。
5.根据权利要求1所述的一种柞蚕微孢子虫株(系)分离方法，其特征在于：步骤(3)所述从步骤(2)获得的混合培养物中提取柞蚕微孢子虫，具体为：将细胞混合培养物转移至离心管中，2000-6000rpm/min离心3-10min，去上清，得到柞蚕微孢子虫。
6.根据权利要求1所述的一种柞蚕微孢子虫株(系)分离方法，其特征在于：步骤(3)所述发芽处理，具体为：在提取的柞蚕微孢子虫中加入100-1000μL 0.05-0.4M的单一或混合的KOH、NaOH、NaHCO3或Na2CO3溶液，微微震荡，悬浮微孢子虫，26-28℃下静置10-60min使柞蚕微孢子虫部分或全部发芽。
7.根据权利要求1所述的一种柞蚕微孢子虫株(系)分离方法，其特征在于：步骤(3)所述将发芽处理后的柞蚕微孢子虫注射入健康柞蚕蛹体内培养，具体为发芽后的微孢子虫离心去掉溶液，生理盐水清洗1-3次，用生理盐水调微孢子虫浓度至1×105～1×107spores/mL，蛹体表面酒精消毒，然后用一次性无菌注射器注射柞蚕健康蛹，每个蛹注射50-200μL，10-35℃下放置10-15天后转入2-6℃低温保存。
8.根据权利要求1所述的一种柞蚕微孢子虫株(系)分离方法，其特征在于：所述柞蚕健康蛹通过筛选获得，具体操作为：收集柞蚕蛹2-6℃保存备用，取柞蚕蛹表面消毒，挑取少量脂肪体组织，伤口消毒后用胶水、液体蜡等封口，挑取的组织用于提取DNA/RNA，采用分子检测技术进行样品蛹中柞蚕微孢子虫的鉴定，筛选出无微孢子虫感染的健康蚕蛹。
9.一种所述柞蚕微孢子虫及其株(系)的保存方法，其特征在于，
(1)将想保存的柞蚕微孢子虫或者利用权利要求1所述柞蚕微孢子虫株(系)的分离方法所获得的柞蚕微孢子虫株(系)，用生理盐水调浓度至1×105～1×107spores/mL，取健康柞蚕蛹表面酒精消毒，然后用一次性无菌注射器注射柞蚕健康蛹，每个蛹注射50-200μL，10-35℃下放置10-15天后转入0-4℃低温避光保存；
(2)将步骤(1)获得的保存柞蚕微孢子虫株(系)的柞蚕蛹，取其精巢或卵巢原代细胞，进行培养、增殖后，提取该株(系)柞蚕微孢子虫，进行发芽处理后，再次注射新结茧化蛹的健康蛹，注射腹部第一腹节，每个蛹注射50-200μL，于10-35℃下放置10-15天后转入0-4℃低温避光保存；
(3)通过不断重复上述步骤(2)操作，如此反复可实现柞蚕微孢子虫及其株(系)的长期保存。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1807570A (zh) * 2005-12-16 2006-07-26 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种以家蚕为宿主工厂化生产微孢子虫的工艺
CN102618487A (zh) * 2012-02-07 2012-08-01 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所 一种柞蚕卵巢细胞培养基及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1807570A (zh) * 2005-12-16 2006-07-26 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种以家蚕为宿主工厂化生产微孢子虫的工艺
CN102618487A (zh) * 2012-02-07 2012-08-01 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所 一种柞蚕卵巢细胞培养基及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)对柞蚕卵巢初代培养细胞的侵染与增殖;李健男 等;《沈阳农业大学学报》;20050831;第36卷(第4期);451-453页 *
柞蚕微孢子虫体外培养技术体系的建立;岳冬梅 等;《安徽农业科学》;20190430;第47卷(第7期);124-127页 *

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