CN117535153A - 纤毛虫体外培养液及纤毛虫的培养、增殖和长期保存方法 - Google Patents

纤毛虫体外培养液及纤毛虫的培养、增殖和长期保存方法 Download PDF

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CN117535153A CN202311543513.2A CN202311543513A CN117535153A CN 117535153 A CN117535153 A CN 117535153A CN 202311543513 A CN202311543513 A CN 202311543513A CN 117535153 A CN117535153 A CN 117535153A
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Abstract

本发明公开一种纤毛虫体外培养液，以及利用这种体外培养液进行纤毛虫的培养、增殖和长期保存的方法，其中方法按照以下步骤进行，制备健康海参的原代细胞培养液；制备纤毛虫‑原代细胞共培养液，进行海参细胞与纤毛虫的共培养；向纤毛虫‑原代细胞共培养液中加入纤毛虫体外培养液，进行纤毛虫长期持续培养；当体外培养的纤毛虫退化时，可向其中添加健康海参原代细胞培养液，复壮纤毛虫，长期保存B步骤中获得的纤毛虫。本发明提供了一种行之有效、长期无菌培养、保存纤毛虫的方法，为揭示纤毛虫致病机制并创制纤毛虫病害防治药物与预警防治技术提供了高效平台，助力海水养殖产业发展。

Description

纤毛虫体外培养液及纤毛虫的培养、增殖和长期保存方法
技术领域
本发明涉及水产研究领域，特别是一种纤毛虫体外培养液及纤毛虫的培养、增殖和长期保存方法。
背景技术
海水养殖是我国乃至全球海洋经济的重要支柱，为世界不断增长的人口提供了食物与营养方面的持续支持。海参作为单种产值最高的大宗海水养殖品种，2022年产量约25万吨，仅第一产业产值就高达400亿元，是我国海水养殖业的支柱型产业。
纤毛虫病，是一种兼性寄生虫，侵染养殖动物后，在动物体内以细胞和组织残渣为食，严重威胁养殖动物的健康。如，刺参在感染纤毛虫后，轻度的会局部表皮溃烂，重度的会导致刺参严重溃烂、化皮、继发细菌感染并最终导致死亡。然而，目前尚未有高效的防治技术手段和药物，主要原因是，感染刺参的纤毛虫品种繁多，但它们侵染养殖动物的分子机制、增殖与传播流行的规律人们又知之甚少，因此无法有效预防与治疗，亟需研发纤毛虫的体外培养技术，并在细胞和分子水平上分析不同纤毛虫的发育机制和侵染增殖规律等，为纤毛虫病的早期预防及防治药物研发提供基础。
目前，鲜见海洋纤毛虫的侵染机制及增殖规律的相关报导，也未见无菌培养、增殖及保存纤毛虫的系统技术公开。有报道，纤毛虫可以采用L-15培养基添食细菌、米汤，或养殖环境海水、底泥悬浮液等进行体外培养，但这些方式存在的弊端是，只能短时间培养，且培养体系有细菌等复杂病原，无法进行纤毛虫的增殖规律、侵染机制的研究。基于细胞系的体外培养技术是在细胞层面和分子水平上研究病原微生物的增殖、侵染机制的有效方法，通过让不断传代的细胞系被纤毛虫侵染，随着细胞的传代培养，纤毛虫在细胞内不断增殖，经过多代培养后逐渐分离出虫株，并随着细胞继代培养而持续繁殖继而保存下来。但这种方法，需要稳定的细胞系且要维持细胞存活与传代来保证寄生虫的长期培养与保存。而目前，水产养殖动物，只有鱼的细胞系，海参等无脊椎品种并未有稳定细胞系建立。而且，即使建立了海参细胞系，细胞的传代培养条件也比较繁琐，需要不断更换辅助培养液，维持环境的无菌化和细胞传代活力等，而海参属于海水养殖，养殖环境病原微生物繁琐，无菌化工作量巨大，人力、物力资源浪费严重，而建立海参细胞细胞系并维持细胞稳定传代难度更是巨大。
综上，现有技术很难实现海洋纤毛虫无菌持续培养及保存，也难于在细胞层面上开展纤毛虫的侵染、增殖机制研究，是制约纤毛虫病防治技术及药物开发的关键难点。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种纤毛虫的体外培养液，同时还提出一种利用上述培养液，获得大量不同类型的纯净无细菌污染纤毛虫，且可对这些纤毛虫长期培养、保存的方法。
本发明的技术解决方案是：一种纤毛虫体外培养液，其特征在于：所述的培养液按照以下步骤制备，取海参的体壁组织，利用破壁机破壁，以1：10比例加入天然海水，在50-70℃的温度下水浴加热1-3 h，滤除组织块，液体用0.22μm滤膜过滤除菌，收集澄清提取液，获得培养液原液，将培养液原液无菌分装，并密封于-20℃保存，使用时，向培养液原液中加入20-30倍体积的无菌海水稀释，获得纤毛虫体外培养液，体外培养液于4℃保存。
一种利用上所述的纤毛虫体外培养液进行纤毛虫的培养、增殖和长期保存的方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行，
A、制备健康海参的原代细胞培养液，
B、制备纤毛虫-原代细胞共培养液，进行海参细胞与纤毛虫的共培养，
C、向B步骤中获得的纤毛虫-原代细胞共培养液中加入纤毛虫体外培养液，进行纤毛虫长期持续培养，
D、当C步骤培养的纤毛虫退化时，可向其中添加A步骤所获得的原代细胞培养液，复壮纤毛虫，
E、长期保存B步骤中获得的纤毛虫。
所述的A步骤如下进行，
取健康海参并进行表面消毒，用体积分数为75%的乙醇浸泡5-10分钟，再用无菌海水冲洗2-3次，解剖海参，取出健康海参的组织，所述组织为呼吸树、肠道、体壁和生殖腺，用消毒液消毒20 min，并用无菌海水清洗2~3次，将经过上述处理后的海参组织剪碎后加入辅助培养液，形成悬浮液，吸管温和抽吸悬浮液，将液体连同组织块一起接种于细胞培养板中，使组织小块均匀涂布于细胞孔的板底，于18-20 ℃静置培养，得到健康海参原代细胞培养液。
所述的B步骤如下进行，
对感染纤毛虫的海参进行表面消毒，用体积分数为75%的乙醇浸泡5-10分钟，再用无菌海水冲洗2-3次，无菌条件下取感染纤毛虫的组织，消毒液消毒20 min，无菌海水清洗2~3次，分别剪碎后200目筛网过滤，接种于培养板中，18-20 ℃放置2-3天后，挑选出有纤毛虫增殖且无污染的纤毛虫-原代细胞共培养液。
所述的B步骤如下进行，
对感染纤毛虫的海参进行表面消毒，用体积分数为75%的乙醇浸泡5-10分钟，再无菌海水冲洗2-3次，无菌环境下吸取海参体腔液，于3000 rpm/min条件下，离心10 min，去除上清液，将沉淀物用辅助培养液悬浮，得到纤毛虫-原代细胞共培养液。
所述的C步骤如下进行，
每隔7-10天，移去1/3总体积的上层液体，然后加入纤毛虫体外培养液补充至原体积，于18-20℃静置培养。
所述的E步骤如下进行，
将体外培养的纤毛虫放置于4-10℃避光保存，每隔1个月吸除1/3总体积的上层液体，补加纤毛虫体外培养液至原体积，于18-20 ℃培养2-3天后，转入4-10℃继续低温避光保存，
每隔6个月，吸除1/3上层液体，添加健康海参原代细胞培养液，然后直接放置于4-10℃继续避光保存。
所述辅助培养液是添加了2% 胎牛血清和1%青链霉素的L-15培养基；
所述消毒液为无菌海水中添加1-6 %青霉素和链霉素、100-200 µg/mL新霉素和5-10 µg/mL两性霉素。
本发明同现有技术相比，具有如下优点：
本发明提供了一种海洋纤毛虫持续培养和保存的系统技术。利用该技术能无菌分离培养得到大量不同类型纤毛虫且可以长期保存。该技术将纤毛虫与原代细胞共培养，可在细胞层面及分子水平上开展纤毛虫的侵染机制、传播规律、功能基因组学、病理学等相关研究，加速纤毛虫病害的防治药物的开发与防治创新技术的发展，将显著降低水产养殖业经济损失。
本发明的方法的基础在于，提出了一种纤毛虫体外培养液。它以海参体壁提取液作为纤毛虫持续培养的营养液，制备方法简单，储存方便，使用简单。首先，解决了刺参没有细胞系的根本问题；其次，也避免了以原代细胞做营养来源的繁琐耗时与高污染风险。以原代细胞体外培养纤毛虫，需要不断补充健康原代细胞为纤毛虫提供营养来源，而健康原代细胞的制备过程繁琐，需要经过解剖、无菌化操作等多步操作，且每隔7-10天需进行一次，不仅浪费海参材料、也消耗大量人力。同时因为纤毛虫在包囊期，通常以类细胞的隐匿形态存在，在制备健康原代细胞过程中引入纤毛虫包囊的风险非常高，作为培养液添加，具有非常高的污染风险。而以海参体壁提取液作为纤毛虫持续培养的营养液，制备分装后置于-20℃冷冻保存，每次使用前解冻适宜量，经济节约，操作简单，非常节省人力和时间。
本发明中对于纤毛虫的保存方法，采用4-10℃低温保存的方式，可以大幅减少纤毛虫对营养的需求，延长更换培养液的操作时长，显著降低科研工作者劳动量，节约资源；虫体可以成虫或包囊的形式长期保存。
且采用原代细胞不定期对纤毛虫进行复壮，可以有效防止虫体退化死亡，增加虫体保存时间，为科研人员提供更加稳定的研究平台。
附图说明
图1是本发明实施例1所述的健康海参肠道原代细胞；
图2是本发明实施例1所述的与海参肠道原代细胞共培养的纤毛虫-原代细胞共培养液；
图3是本发明实施例2所述的利用纤毛虫体外培养液持续培养增殖的纤毛虫；
图4是本发明实施例3所述的纤毛虫在不同原代细胞液中共培养的扩繁情况；
图5是本发明实施例4所述的低温保存6个月后恢复培养的盾纤毛虫；
图6是本发明实施例5所述的本发明方法培养、保存的不同类型的纤毛虫。
具体实施方式
下面将结合附图说明本发明的具体实施方式如下：如图1至图5所示，一种纤毛虫体外培养液，按照以下步骤制备，取海参的体壁组织，利用破壁机破壁，以1：10比例加入天然海水，在50-70℃的温度下水浴加热1-3 h，滤除组织块，液体用0.22μm滤膜过滤除菌，收集澄清提取液，获得培养液原液，将培养液原液无菌分装，并密封于-20℃保存，使用时，向培养液原液中加入20-30倍体积的无菌海水稀释，获得纤毛虫体外培养液，体外培养液于4℃保存。
一种利用上所述的纤毛虫体外培养液进行纤毛虫的培养、增殖和长期保存的方法，按照以下步骤进行，
A、制备健康海参的原代细胞培养液，
B、制备纤毛虫-原代细胞共培养液，进行海参细胞与纤毛虫的共培养，
C、向B步骤中获得的纤毛虫-原代细胞共培养液中加入纤毛虫体外培养液，进行纤毛虫长期持续培养，
D、当C步骤培养的纤毛虫退化时，可向其中添加A步骤所获得的原代细胞培养液，复壮纤毛虫，
E、长期保存B步骤中获得的纤毛虫。
所述的A步骤如下进行，
取健康海参并进行表面消毒，用体积分数为75%的乙醇浸泡5-10分钟，再用无菌海水冲洗2-3次，解剖海参，取出健康海参的组织，所述组织为呼吸树、肠道、体壁和生殖腺，用消毒液消毒20 min，并用无菌海水清洗2~3次，将经过上述处理后的海参组织剪碎后加入辅助培养液，形成悬浮液，吸管温和抽吸悬浮液，将液体连同组织块一起接种于细胞培养板中，使组织小块均匀涂布于细胞孔的板底，于18-20 ℃静置培养，得到健康海参原代细胞培养液。
所述的B步骤如下进行，
对感染纤毛虫的海参进行表面消毒，用体积分数为75%的乙醇浸泡5-10分钟，再用无菌海水冲洗2-3次，无菌条件下取感染纤毛虫的组织，消毒液消毒20 min，无菌海水清洗2~3次，分别剪碎后200目筛网过滤，接种于培养板中，18-20 ℃放置2-3天后，挑选出有纤毛虫增殖且无污染的纤毛虫-原代细胞共培养液。
所述的B步骤如下进行，
对感染纤毛虫的海参进行表面消毒，用体积分数为75%的乙醇浸泡5-10分钟，再无菌海水冲洗2-3次，无菌环境下吸取海参体腔液，于3000 rpm/min条件下，离心10 min，去除上清液，将沉淀物用辅助培养液悬浮，得到纤毛虫-原代细胞共培养液。
所述的C步骤如下进行，
每隔7-10天，移去1/3总体积的上层液体，然后加入纤毛虫体外培养液补充至原体积，于18-20℃静置培养。
所述的E步骤如下进行，
将体外培养的纤毛虫放置于4-10℃避光保存，每隔1个月吸除1/3总体积的上层液体，补加纤毛虫体外培养液至原体积，于18-20 ℃培养2-3天后，转入4-10℃继续低温避光保存，
每隔6个月，吸除1/3上层液体，添加健康海参原代细胞培养液，然后直接放置于4-10℃继续避光保存。
所述辅助培养液是添加了2% 胎牛血清和1%青链霉素的L-15培养基；
所述消毒液为无菌海水中添加1-6 %青霉素和链霉素、100-200 µg/mL新霉素和5-10 µg/mL两性霉素。
以下为具体实施例：
实施例1
纤毛虫在原代细胞中的培养与增殖。
取商业L-15培养基，加入2% 胎牛血清和1%青链霉素制备成辅助培养液，4℃保存备用。
取天然海水高温灭菌，待冷却至室温后加入4 %青霉素和链霉素、150 µg/mL新霉素和7.5 µg/mL两性霉素，制成消毒液，4℃保存备用。
取健康海参进行表面消毒，用体积分数为75%的乙醇浸泡5-10分钟，再用无菌海水冲洗2-3次。取出健康海参的肠道，消毒液消毒20min，无菌海参清洗2~3次，剪碎后加入少量辅助培养液，吸管温和抽吸后，直接将悬浮液连同组织块一起接种于24孔细胞培养板，将组织小块均匀涂布于细胞孔的板底，镜检计数，使每孔接种106细胞为宜（图1），于18-20℃静置培养，得到健康海参原代细胞培养液。
取感染海参，用体积分数为75%的乙醇浸泡10分钟，于超净台内无菌水冲洗2次，放置于无菌纱布上吸干体表水分。无菌操作剪开腹部，用眼科剪刀和镊子解剖取出肠道组织，放置于盛有消毒液的小平皿中，消毒液消毒20 min后，无菌海水洗涤2~3次。将肠道组织剪成0.5-1mm3 大小的组织块，加辅助培养液，用灭菌吸管温和抽吸后，直接将悬液连同组织块一起接种于24孔细胞培养板中，将小块均匀涂布于细胞孔的板底，一般每孔接种106为宜，然后于细胞孔内加入适量培养基，进而获得无菌纤毛虫-原代细胞共培养液，18 ℃静置培养，每天观察各孔纤毛虫增殖扩繁情况（图2）。
将纤毛虫-原代细胞共培养液在18℃下培养10天后，显微镜下观察，细胞几乎消耗殆尽，
结果说明
图1和图2分别是：健康海参肠道原代细胞，与肠道原代细胞共培养的纤毛虫培养液。
该实施例说明纤毛虫感染的海参，采用组织原代细胞制备方法，可以较容易的去除培养环境中的其他病原微生物，原代细胞培养期间，可持续为纤毛虫提供所需养分，利于其扩繁增殖。
实施例2
纤毛虫的持续培养与增殖
将健康海参解剖，取体壁组织，破壁机破壁，以1：10比例加入天然海水，60℃水浴加热1.5-2 h，滤除组织块，液体用0.22 μm滤膜过滤除菌，收集澄清提取液，无菌分装，密封于-20℃保存。
取出冷冻的培养液原液，无菌环境下常温解冻，加入25倍体积的无菌海水稀释，稀释液于4℃保存待用。取在18℃静置培养10天的纤毛虫-原代细胞培养液，显微镜下观察，海参原代细胞已经消耗殆尽。移去1/3总体积的上层纤毛虫-原代细胞共培养液，加入纤毛虫体外培养液补充至原体积，于18-20℃静置培养，3天后，可见纤毛虫大量增殖（图3）。
结果说明
图3为加入纤毛虫体外培养液持续培养增殖的纤毛虫。
该实施例说明，纤毛虫体外培养液可以有效培养、增殖纤毛虫，增殖纤毛虫活力好、数量多。同时，培养液原液稀释后使用，用量少、节约成本，且使用简单、方便，节约人力、物力。
实施例3
纤毛虫的持续培养、增殖与复壮
取健康海参进行表面消毒，用体积分数为75%的乙醇浸泡5-10分钟，再用无菌海水冲洗2-3次。无菌环境下吸取海参体腔液，于3000 rpm/min条件下，离心10min，沉淀用辅助培养液悬浮，得到纤毛虫体外培养液。再在无菌环境下取出健康海参的肠道和呼吸树组织，消毒液消毒20 min后，无菌海水洗涤2~3次分别剪碎后加入少量辅助培养液，吸管温和抽吸后，直接将悬浮液连同组织块一起接种于24孔细胞培养板，将组织小块均匀涂布于细胞孔的板底，镜检计数，使每孔接种106细胞为宜，于18-20℃静置培养，得到健康海参原代细胞培养液。
取低温保存的纤毛虫-原代细胞共培养液，于18-20℃静置培养，置于显微镜下观察，当原代细胞接近耗尽，取培养液3000 rpm/min离心10min，去上清液，加入适量辅助培养液吹打混匀，显微镜下计数纤毛虫浓度备用。
调节健康呼吸树原代细胞、肠道原代细胞、体腔原代细胞初始浓度为3×106个/mL，每毫升接入10只虫，每个处理重复3孔。混匀培养液后，18℃静置培养，每隔24 h，显微镜下观察纤毛虫的增殖、培养情况（图4）。
结果说明
图4为纤毛虫在不同原代细胞液中共培养的扩繁情况。添加健康呼吸树、肠道、体腔原代细胞的纤毛虫辅助培养液中，纤毛虫的数量在4天后迅速激增。
此实施例说明健康原代细胞的添加可以显著复壮纤毛虫并使其迅速增殖。但若不添加细胞，纤毛虫不再增殖，结合实施例2，可见纤毛虫体外培养液作为纤毛虫持续培养的营养来源，解决了需要反复制备健康原代细胞的繁琐操作的弊端，是一种行之有效的纤毛虫培养液，且显著节约了人力、物力。
实施例4
取4℃低温避光保存1个月的盾纤毛虫培养液，吸除1/3总体积的上层液体，补加纤毛虫体外培养液至原体积，于18-20℃培养2-3天后，转入4-10℃继续低温避光保存；每隔1个月重复上述操作。6个月后，吸除1/3上层培养液，添加健康肠道原代细胞培养液，添加量约106个细胞，补充后，将培养液于18-20℃静置培养，显微镜下观察纤毛虫的增殖情况。3天后，可见纤毛虫开始大量增殖，活动迅速，可以观察到大量二裂殖状态（图5）。
结果说明
图5为低温保存6个月后恢复培养的盾纤毛虫，可见纤毛虫体内积蓄大量颗粒物，二裂殖态大量发生，纤毛虫增殖扩繁活力强。
本实施例说明了本发明方法可以长期保存纤毛虫，同时，在添加健康原代细胞后可以显著复壮纤毛虫并使其迅速增殖，恢复培养的纤毛虫仍具备强劲的增殖能力。
实施例5
从已感染纤毛虫的海参组织中，制备不同类型的纤毛虫-原代细胞培养液。取18℃静置培养7天的某纤毛虫培养液，吸除1/3总体积的上层培养液，补加纤毛虫体外培养液至原体积，于18-20℃培养2-3天后，转入4-10℃继续低温避光保存；每隔1个月重复上述操作。6个月后，显微镜下观察，纤毛虫依旧具备非常强的活力（图6）。
结果说明
图6为本发明方法培养、保存的不同类型的纤毛虫，持续培养、保存6个月后，纤毛虫活力依旧强劲。
该实施例说明本发明方法适用于多种纤毛虫的持续培养、增殖与保存，通过简单补加纤毛虫体外培养液，就可长期保存不同类型的纤毛虫。长期保存的纤毛虫加入健康海参原代细胞后，与原代细胞共培养，可在细胞层面及分子水平上开展不同纤毛虫的侵染机制、传播规律、功能基因组学、病理学等相关研究，有助于发现未知名新型纤毛虫的致病机制，加速纤毛虫病害的防治药物的开发与防治创新技术的发展，将显著降低水产养殖业经济损失。

Claims (8)

1.一种纤毛虫体外培养液，其特征在于：所述的培养液按照以下步骤制备，取海参的体壁组织，利用破壁机破壁，以1：10比例加入天然海水，在50-70℃的温度下水浴加热1-3 h，滤除组织块，液体用0.22 μm滤膜过滤除菌，收集澄清提取液，获得培养液原液，将培养液原液无菌分装，并密封于-20℃保存，使用时，向培养液原液中加入20-30倍体积的无菌海水稀释，获得纤毛虫体外培养液，体外培养液于4℃保存。
2.一种利用如权利要求1所述的纤毛虫体外培养液进行纤毛虫的培养、增殖和长期保存的方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行，
A、制备健康海参的原代细胞培养液，
B、制备纤毛虫-原代细胞共培养液，进行海参细胞与纤毛虫的共培养，
C、向B步骤中获得的纤毛虫-原代细胞共培养液中加入纤毛虫体外培养液，进行纤毛虫长期持续培养，
D、当C步骤培养的纤毛虫退化时，可向其中添加A步骤所获得的原代细胞培养液，复壮纤毛虫，
E、长期保存B步骤中获得的纤毛虫。
3.根据权利要求2所述的纤毛虫的培养、增殖和长期保存方法，其特征在于：所述的A步骤如下进行，
取健康海参并进行表面消毒，用体积分数为75%的乙醇浸泡5-10分钟，再用无菌海水冲洗2-3次，解剖海参，取出健康海参的组织，所述组织为呼吸树、肠道、体壁和生殖腺，用消毒液消毒20 min，并用无菌海水清洗2~3次，将经过上述处理后的海参组织剪碎后加入辅助培养液，形成悬浮液，吸管温和抽吸悬浮液，将液体连同组织块一起接种于细胞培养板中，使组织小块均匀涂布于细胞孔的板底，于18-20 ℃静置培养，得到健康海参原代细胞培养液。
4.根据权利要求2所述的纤毛虫的培养、增殖和长期保存方法，其特征在于：所述的B步骤如下进行，
对感染纤毛虫的海参进行表面消毒，用体积分数为75%的乙醇浸泡5-10分钟，再用无菌海水冲洗2-3次，无菌条件下取感染纤毛虫的组织，消毒液消毒20 min，无菌海水清洗2~3次，分别剪碎后200目筛网过滤，接种于培养板中，18-20 ℃放置2-3天后，挑选出有纤毛虫增殖且无污染的纤毛虫-原代细胞共培养液。
5.根据权利要求2所述的纤毛虫的培养、增殖和长期保存方法，其特征在于：所述的B步骤如下进行，
对感染纤毛虫的海参进行表面消毒，用体积分数为75%的乙醇浸泡5-10分钟，再无菌海水冲洗2-3次，无菌环境下吸取海参体腔液，于3000 rpm/min条件下，离心10 min，去除上清液，将沉淀物用辅助培养液悬浮，得到纤毛虫-原代细胞共培养液。
6.根据权利要求2所述的纤毛虫的培养、增殖和长期保存方法，其特征在于：所述的C步骤如下进行，
每隔7-10天，移去1/3总体积的上层液体，然后加入纤毛虫体外培养液补充至原体积，于18-20℃静置培养。
7.根据权利要求2所述的纤毛虫的培养、增殖和长期保存方法，其特征在于：所述的E步骤如下进行，
将体外培养的纤毛虫放置于4-10℃避光保存，每隔1个月吸除1/3总体积的上层液体，补加纤毛虫体外培养液至原体积，于18-20 ℃培养2-3天后，转入4-10℃继续低温避光保存，
每隔6个月，吸除1/3上层液体，添加健康海参原代细胞培养液，然后直接放置于4-10℃继续避光保存。
8.根据权利要求2所述的纤毛虫的培养、增殖和长期保存方法，其特征在于：所述辅助培养液是添加了2% 胎牛血清和1%青链霉素的L-15培养基；
所述消毒液为无菌海水中添加1-6 %青霉素和链霉素、100-200 µg/mL新霉素和5-10 µg/mL两性霉素。
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