CN101451121A

CN101451121A - 褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法

Info

Publication number: CN101451121A
Application number: CNA2008102495658A
Authority: CN
Inventors: 樊廷俊; 魏云波; 姜国建
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2008-12-26
Filing date: 2008-12-26
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2028-12-26
Also published as: CN101451121B

Abstract

本发明涉及一种褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法，它是以褐点石斑鱼心脏组织为材料，采用胰蛋白酶消化法启动原代培养，在含胎牛血清、碱性成纤维样细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、硫酸软骨素和对数期褐点石斑鱼鳍细胞培养上清液的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；由本发明构建的褐点石斑鱼心脏细胞系，目前已传至第70代，其工艺科学合理，可望应用于鱼类病毒的分离、繁殖、病毒疫苗制备，以及病毒与宿主细胞相互作用等方面研究；还可作为环境毒理学研究环境污染物的模型，对海洋中存在的各种环境污染物，包括基因毒物、诱变剂、致癌物、环境激素和内分泌干扰物等，进行污染监测和安全性评价。

Description

褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法

技术领域

本发明涉及一种利用褐点石斑鱼心脏组织细胞建立心脏细胞系的方法——褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法。

背景技术

石斑鱼是我国重要的海水养殖鱼类，广泛分布于印度洋和太平洋的热带海域，我国南海及东海南部均有分布。褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)俗称“老虎斑”，是一种具有较高的经济价值名贵石斑鱼。近年来，各种鱼类病毒性疾病大规模爆发，造成石斑鱼养殖业巨大的经济损失，已经成为制约鱼类养殖业可持续发展的重要因素之一。鱼类细胞系正是研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的重要研究体系，另外，随着海洋环境污染的日益加剧，海洋中各种环境污染物，包括基因毒物、诱变剂、致癌物、环境激素和内分泌干扰物等对水产养殖业和人类健康带来了极大的威胁，利用鱼类细胞系作为环境毒理学研究环境污染物的模型，进行环境污染监测和安全性评价，也成为鱼类细胞培养的重要用途之一。目前，由于海洋鱼类细胞系特别是褐点石斑鱼各种组织细胞系的缺乏，褐点石斑鱼病毒学和环境毒理学等方面的研究受到阻碍，其它海洋鱼类细胞系不能有效的对褐点石斑鱼病毒进行分离、鉴定、繁殖，研制病毒疫苗以及研究病毒与宿主细胞相互作用，也无法针对性的检测海洋中存在的各种环境污染物对褐点石斑鱼的影响，并研究污染物对褐点石斑鱼细胞的作用机理。

显然，建立褐点石斑鱼各种组织细胞系是非常必要的，可为鱼类病毒学和环境毒理学等相关研究奠定坚实的基础，为石斑鱼养殖业带来巨大的经济效益，褐点石斑鱼各种组织细胞系还可作为海洋污染早期预警的主要手段之一，对海洋中存在的各种环境污染物进行监测和安全性评价，促进水产养殖业的持续健康发展。

发明内容

本发明的目的就是利用褐点石斑鱼心脏组织，提供一种褐点石斑鱼心脏细胞系的构建技术，以弥补现有技术的不足。

本发明的构建方法：首先对鲜活褐点石斑鱼用浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水消毒处理24小时，以75％酒精再次消毒，置于超净工作台中解剖取下心脏组织，磷酸盐缓冲液漂洗后剪成大致1立方毫米的组织块；选择浓度为0.0625％～0.125％的胰蛋白酶对心脏组织块消化5-10分钟，并离心收集心脏组织块；将该心脏组织块用含有5％胎牛血清和0.25‰～1‰比例的硫酸软骨素的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于多个25毫升培养瓶中，22～24℃下正置干贴16～20小时后，每瓶加入5毫升褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液，置22～24℃生化培养箱中培养，每隔3～5天吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，再添加2.5毫升上述褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液；待褐点石斑鱼心脏细胞长成单层后，再使用浓度为0.125％～0.25％胰蛋白酶溶液消化，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；所述的褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液配方为含有20％胎牛血清和0.25‰～1‰比例的硫酸软骨素、pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液。为了促进褐点石斑鱼心脏细胞的分裂和快速增殖，本发明又添加了0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.04‰～0.06‰的I型人胰岛素样生长因子和20％-40％的已抽滤的对数期褐点石斑鱼鳍细胞培养上清液。

本发明构建的主要特点是：褐点石斑鱼心脏细胞系可以连续传代，既可为鱼类病毒学等多种相关研究提供理想的体外研究，又可作为环境毒理学研究环境污染物的模型，进行环境监测和安全性评价。经这种方法所构建的心脏细胞系现已传至第70代。

具体实施方式

将上述本发明的方法按照细致步骤进行详述如下：

1、褐点石斑鱼心脏组织块的制备：鲜活褐点石斑鱼于浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后于75％酒精中消毒1～2分钟。于超净工作台中无菌解剖取下心脏组织，用磷酸盐缓冲液漂洗2遍后在含有5％胎牛血清的DMEM/F12培养液中，将心脏组织剪成约1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收集心脏组织块，本发明考虑到褐点石斑鱼心脏的组织特点，专门选择浓度为0.0625％～0.125％的胰蛋白酶对心脏组织块消化5-10分钟；1000转/分钟离心收集组织块；将该心脏组织块用含有5％胎牛血清(Hyclone)和0.25‰～1‰比例的硫酸软骨素(Sigma)的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液(Gibco)充分悬浮，均匀接种于多个25毫升培养瓶中；将培养瓶放入22～24℃培养箱中，正置干贴16～20小时。

2、褐点石斑鱼心脏细胞专用培养液的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液(pH7.0～7.4)3.0毫升，加入硫酸软骨素0.5～2毫克，待完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入1毫升胎牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至5.0毫升，即为本发明的褐点石斑鱼心脏细胞专用培养液。

为了促进褐点石斑鱼心脏细胞的分裂和快速增殖，在上述专用培养液的基础上又添加了0.01‰～0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子(Sigma)和0.04‰～0.06‰的人I型胰岛素样细胞生长因子(Sigma)。为了提供体外培养的褐点石斑鱼心脏细胞所需的众多未知的促分裂增殖因子，达到其最佳生长条件，在上述专用培养液的基础上又添加了占上述专用增殖培养液20％-40％的对数期褐点石斑鱼鳍细胞培养上清液。此对数期细胞上清液取自目前已建成的褐点石斑鱼鳍细胞系，经0.22微米的微孔滤膜过滤除去杂细胞和其他杂质而得。

3、褐点石斑鱼心脏细胞原代培养的启动：将每瓶干贴后的心脏组织中加入5毫升的上述专用培养液，于22～24℃培养；心脏细胞迁出后，每间隔3～5天，吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入2.5毫升新鲜的褐点石斑鱼心脏细胞专用培养液；细胞在褐点石斑鱼心脏细胞专用培养液中生长状态良好，增殖明显。

4、褐点石斑鱼心脏细胞的传代培养：待褐点石斑鱼心脏细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.125％～0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化0.5～1.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼心脏细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升心脏细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼心脏细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。现已传至第70代。

实施例1

将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后于75％酒精中消毒2分钟，用棉球擦拭鱼体表后解剖取出心脏组织，置于盛有磷酸盐缓冲液的烧杯中，用镊子夹取心脏组织漂洗2遍，洗去心脏组织表面血污；转入含有5％胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收集心脏组织块，加入浓度为0.0625％的胰蛋白酶对心脏组织块消化5分钟；1000转/分钟离心收集组织块；将该心脏组织块用含有5％胎牛血清和0.25‰的硫酸软骨素的pH值为7.2的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于多个25平方厘米培养瓶中；将培养瓶放入22℃培养箱中，正置干贴16小时。

取常规配制的DMEM/F12培养液(pH7.2)3毫升，加入硫酸软骨素0.5毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入1毫升胎牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至5.0毫升，即为褐点石斑鱼心脏细胞专用培养液。在上述专用培养液中又添加了0.01‰人碱性成纤维细胞生长因子和0.04‰的人I型胰岛素样细胞生长因子，更有利于褐点石斑鱼心脏细胞的分裂和快速增殖。将每瓶干贴后的心脏组织中加入5毫升的上述专用培养液，于22℃培养；心脏细胞迁出后，每间隔5天，吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入2.5毫升新鲜的褐点石斑鱼心脏细胞专用培养液。待心脏细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.125％的胰蛋白酶溶液，静置消化1.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼心脏细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升心脏细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼心脏细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。

实施例2

将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后于75％酒精中消毒2分钟，用棉球擦拭鱼体表后解剖取出心脏组织，置于盛有磷酸盐缓冲液的烧杯中，用镊子夹取心脏组织漂洗2遍，洗去心脏组织表面血污；转入含有5％胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收集心脏组织块，加入浓度为0.125％的胰蛋白酶对心脏组织块消化5分钟；1000转/分钟离心收集组织块；将该心脏组织块用含有5％胎牛血清和0.5‰的硫酸软骨素的pH值为7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于多个25平方厘米培养瓶中；将培养瓶放入24℃培养箱中，正置干贴18小时。

将每瓶干贴后的心脏组织中加入5毫升的pH值为7.4的褐点石斑鱼心脏细胞专用培养液，其中添加了占上述专用增殖培养液0.015‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.06‰的人I型胰岛素样细胞生长因子和20％的对数期褐点石斑鱼鳍细胞培养上清液，有利于褐点石斑鱼心脏细胞的贴壁、分裂和快速增殖。于24℃培养；心脏细胞迁出后，每间隔4天，吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入2.5毫升新鲜的褐点石斑鱼心脏细胞专用培养液；待褐点石斑鱼心脏细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化1分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼心脏细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升心脏细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼心脏细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。

实施例3

将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后于75％酒精中消毒1分钟，用棉球擦拭鱼体表后解剖取出心脏组织，置于盛有磷酸盐缓冲液的烧杯中，用镊子夹取心脏组织漂洗2遍，洗去心脏组织表面血污；转入含有5％胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收集心脏组织块，加入浓度为0.125％的胰蛋白酶对心脏组织块消化10分钟；1000转/分钟离心收集组织块；将该心脏组织块用含有5％胎牛血清和1‰的硫酸软骨素的pH值为7.2的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于多个25平方厘米培养瓶中；将培养瓶放入24℃培养箱中，正置干贴20小时。

将每瓶干贴后的心脏组织中加入5毫升的褐点石斑鱼心脏细胞专用培养液，其中添加了占上述专用增殖培养液0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.06‰的人I型胰岛素样细胞生长因子和40％的对数期褐点石斑鱼鳍细胞培养上清液，以满足褐点石斑鱼心脏细胞的最佳增殖条件。24℃培养；心脏细胞迁出后，每间隔3天，吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入2.5毫升新鲜的褐点石斑鱼心脏细胞专用培养液；待褐点石斑鱼心脏细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化1.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼心脏细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升心脏细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼心脏细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。

Claims

1、一种褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法，首先对鲜活褐点石斑鱼用浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水消毒处理24小时，以75％酒精再次消毒，置于超净工作台中解剖取下心脏组织，磷酸盐缓冲液漂洗后剪成大致1mm³的组织块；用浓度为0.125％～0.25％的胰蛋白酶对心脏组织块消化5-10分钟，并离心收集心脏组织块；将该心脏组织块用含有5％胎牛血清和0.25‰～1‰硫酸软骨素的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，并均匀接种于多个25毫升培养瓶中，在22～24℃下正置干贴16～20小时后，每瓶加入5毫升褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液，置22～24℃生化培养箱中培养，每隔3～5天吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，再添加2.5毫升上述褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液；待褐点石斑鱼心脏细胞长成单层后，再使用浓度为0.0625％～0.125％胰蛋白酶溶液消化，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；所述的褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液配方为含有20％胎牛血清和0.25‰～1‰比例的硫酸软骨素、pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液。

2、如权利要求1所述的构建方法，其特征是在上述褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液中又添加占上述专用增殖培养液0.01‰～0.02‰比例的人碱性成纤维细胞生长因子和占上述专用增殖培养液0.04‰～0.06‰比例的I型人胰岛素样生长因子。

3、如权利要求2所述的构建方法，其特征是在上述褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液中又添加了占上述专用增殖培养液20％-40％的已抽滤的对数期褐点石斑鱼鳍细胞培养上清液。