CN102604887B - 一种哲罗鲑体细胞体外培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，涉及一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。本发明提供了一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。方法：一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体组织；三、原代培养组织块；四、细胞的原代培养；五、体细胞传代培养，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。本发明方法培养的细胞生长状态良好。本发明方法可有效地增加细胞分裂次数，使得哲罗鲑体外细胞的实际分裂次数达到30次以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。
背景技术
哲罗鲑(Hucho taimen)为我国珍贵、冷水性鱼类之一，主要分布在亚洲北部地区，西至伏尔加河流域、东至伯朝拉河流域、南至黑龙江流域，北至勒拿河等流域。哲罗鲑大部分时间生活在水流湍急的溪水中，冬季在较深的水体如大江干流、湖泊中越冬，春季向溪流洄游产卵。由于繁殖期过度捕捞，使哲罗鲑补充群体数量大大减少，以及人为环境污染及生存环境条件破坏等原因，使哲罗鲑的自然资源量显著下降。目前，黑龙江的哲罗鲑数量较过去显著减少，在黑龙江省的渔获物中几乎不占比重。自2005年我国哲罗鲑人工繁殖和苗种驯化成功后，该鱼因其生长速度快、易驯养、营养价值高等优点，而被广泛养殖，涉及到全国20几个省市县。近些年，随着哲罗鲑养殖规模的扩大、由于种质衰退和养殖环境恶化等原因，一些冷水性鱼类的暴发性疾病频频爆发，导致我国哲罗鲑等冷水性鱼类的养殖产量锐减。目前，国内外学者虽对哲罗鲑生态习性、生长繁殖、生化和遗传等方面进行了大量的研究，但对其细胞培养方面的研究还尚未见报道。
发明内容
本发明提供一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。
本发明哲罗鲑体细胞体外培养方法，按以下步骤进行：一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体组织，将组织放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的D-Hanks缓冲液中浸泡20秒，再用D-Hanks缓冲液冲洗3遍，得清洗后的组织；三、原代培养组织块：将清洗后的组织剪碎至0.8～1.2mm3的块状，然后将剪碎的组织块移入细胞培养瓶中，使组织块均匀地平铺于细胞培养瓶的底部，向细胞培养瓶中加入0.5mL细胞培养液，将细胞培养瓶倒置于19℃的培养箱中，培养4小时后将细胞培养瓶翻转，并向细胞培养瓶加入8mL细胞培养液，在19℃的培养箱中继续培养至组织块长满细胞培养瓶底面积的80％；四、细胞的原代培养：取0.5mL步骤三得到的原代培养后的组织块放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23℃下于50～100rpm的摇床上消化，每5分钟收集4mL上层消化液，移入预先加入1mL血清的离心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向组织块中补加4mL胰蛋白酶消化液，然后将收集到的消化液和血清混合物于1000r/min离心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL细胞培养液，得悬浮液，调整悬浮液的细胞浓度至105个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％～90％；五、体细胞传代培养：然后消化细胞培养瓶内细胞，收集细胞培养瓶内混合液体于1000r/min离心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入细胞培养液得细胞悬液，调整细胞悬液浓度至1×104～5×104个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％，再次传代，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。
冷水性鱼类因其具有独特的生长环境和代谢机制，其细胞培养一直以来是国内外鱼类细胞培养的技术难点。因此，为解决我国冷水性鱼类病毒性疾病检测和疫苗制备的迫切需要，本发明建立了哲罗鲑体细胞的体外培养方法，对促进我国冷水性鱼类的渔业健康、稳定发展具有重要的实践意义。本发明方法培养的细胞生长状态良好。本发明方法可有效地增加细胞分裂次数，使得哲罗鲑体外细胞的实际分裂次数达到30次以上。
附图说明
图1为具体实施方式十一中培养鉴定的活细胞在可见光下的形态图；图2为具体实施方式十一中培养鉴定的活细胞PI染色后荧光下的形态图；图3为具体实施方式十一中培养鉴定的活细胞hoechst33342染色后荧光下的形态图；图4为具体实施方式十一中的死细胞在可见光下的形态图；图5为具体实施方式十一中培养鉴定的死细胞PI染色后荧光下的形态图；图6为具体实施方式十一中培养鉴定的死细胞hoechst33342染色后荧光下的形态图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式哲罗鲑体细胞体外培养方法，按以下步骤进行：一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体组织，将组织放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的D-Hanks缓冲液中浸泡20秒，再用D-Hanks缓冲液冲洗3遍，得清洗后的组织；三、原代培养组织块：将清洗后的组织剪碎至0.8～1.2mm3的块状，然后将剪碎的组织块移入细胞培养瓶中，使组织块均匀地平铺于细胞培养瓶的底部，向细胞培养瓶中加入0.5mL细胞培养液，将细胞培养瓶倒置于19℃的培养箱中，培养4小时后将细胞培养瓶翻转，并向细胞培养瓶加入8mL细胞培养液，在19℃的培养箱中继续培养至组织块长满细胞培养瓶底面积的80％；四、细胞的原代培养：取0.5mL步骤三得到的原代培养后的组织块放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23℃下于50～100rpm的摇床上消化，每5分钟收集4mL上层消化液，移入预先加入1mL血清的离心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向组织块中补加4mL胰蛋白酶消化液，然后将收集到的消化液和血清混合物于1000r/min离心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL细胞培养液，得悬浮液，调整悬浮液的细胞浓度至105个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％～90％；五、体细胞传代培养：然后消化细胞培养瓶内细胞，收集细胞培养瓶内混合液体于1000r/min离心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入细胞培养液得细胞悬液，调整细胞悬液浓度至1×104～5×104个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％，再次传代，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中断颈处死哲罗鲑的具体方法为：选择体长为12～14cm的哲罗鲑，采用医用尖头镊子插入哲罗鲑口中，另一只手握住其鱼体躯干部，采用背侧移位断颈处死。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二所述哲罗鲑鱼体组织为肝脏、肾脏、鳍缘或吻端。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中采集哲罗鲑鱼体组织的具体方法为：采用碘酒擦拭哲罗鲑鱼体表一次，然后将哲罗鲑浸泡于体积浓度为75％的乙醇溶液中30秒，取出后用灭菌纱布吸干鱼体表面，取全部或部分组织。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中第二次在19℃的培养箱中继续培养期间，每48小时更换细胞培养液一次。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三、步骤四和步骤五中所述细胞培养液为含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和质量浓度为20％的胎牛血清的B2培养基。其它与具体实施方式一至五之一相同。
本实施方式所述B2培养基可替换为M199培养基、DMEM培养基、MEM培养基或者F12培养基。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四中所述胰蛋白酶消化液为含有质量浓度0.25％的胰蛋白酶的D-Hanks缓冲液。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤四中置于19℃培养箱中培养期间每48小时更换细胞培养液一次。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤五中置于19℃培养箱中培养期间每48小时更换细胞培养液一次。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤五中消化细胞培养瓶内细胞的方法为：用D-Hanks缓冲液将细胞丰度达到80％～90％的细胞培养瓶冲洗2遍后，加入1mL 0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液，5分钟后加入1mL血清终止消化。其它与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式哲罗鲑体细胞体外培养方法，按以下步骤进行：一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体肝脏组织，将肝脏组织放入含有100 IU/mL青霉素和100 IU/mL链霉素的D-Hanks缓冲液中浸泡20秒，再用D-Hanks缓冲液冲洗3遍，得清洗后的肝脏组织；三、原代培养组织块：将清洗后的肝脏组织用医用灭菌剪刀剪碎至0.8～1.2mm3的块状，然后将剪碎的肝脏组织块移入细胞培养瓶中，使肝脏组织块均匀地平铺于细胞培养瓶的底部，向细胞培养瓶中加入0.5mL细胞培养液，将细胞培养瓶倒置于19℃的培养箱中，培养4小时后将细胞培养瓶翻转，并向细胞培养瓶加入8mL细胞培养液，在19℃的培养箱中继续培养至肝脏组织块长满细胞培养瓶底面积的80％；四、细胞的原代培养：取0.5mL步骤三得到的原代培养后的肝脏组织块放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23℃下于50rpm的摇床上消化，每5分钟收集4mL上层消化液，移入预先加入1mL血清的离心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向肝脏组织块中补加4mL胰蛋白酶消化液，然后将收集到的消化液和血清混合物于1000r/min离心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL细胞培养液，得悬浮液，调整悬浮液的细胞浓度至105个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％；五、体细胞传代培养：然后消化细胞培养瓶内细胞，收集细胞培养瓶内混合液体于1000r/min离心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入细胞培养液得细胞悬液，调整细胞悬液浓度至1×104～5×104个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％，再次传代，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。
对本实施方式方法培养得到的肝脏细胞进行细胞形态学鉴定，具体方法为：1、将所培养的肝脏细胞连同培养瓶在800倍微分干涉显微镜下观察，依据细胞的形状和大小区别细胞类型，将肝脏细胞为类成纤维型和类上皮细胞型以及其它细胞型。2、在培养瓶的细胞培养液(含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和质量浓度为20％的胎牛血清的B2培养基)内加入1μg/mL的Hoechst 33342和0.5μg/mL的PI染色15分钟，用D-Hanks缓冲液洗两遍，再加入新细胞培养液(含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和质量浓度为20％的胎牛血清的B2培养基)，在800倍500nm荧光显微镜下观察，观察肝细胞核质比例、染色质和核仁大小及生长状态。其中，细胞核蓝染色，细胞质无色的为正常细胞，其细胞核与细胞质比例适当，而且生长状态良好；细胞核蓝染，细胞质红色的为死亡细胞；细胞核高度蓝染，伴有核仁分解，细胞质无色的为凋亡细胞。
本实验培养鉴定的活细胞形态如图1-3所示，图1为可见光下的形态；图2为PI染色后荧光下的形态，活细胞不染色，死细胞发出红色荧光，图2中仅有一个细胞是死细胞，见图2中右上角亮点；图3为hoechst33342染色后荧光下的形态，所有细胞核发出蓝色荧光。
本实验培养鉴定的死细胞形态如图4-6所示，图4为可见光下的形态，图5为PI染色后荧光下的形态，活细胞不染色，死细胞发出红色荧光，图中仅有一个细胞是死细胞，图6为hoechst33342染色后荧光下的形态，所有细胞发出蓝色荧光。说明本方法培养的细胞生长状态良好。
对本实施方式方法培养得到的肝脏细胞进行细菌、真菌检测，具体方法为：将培养瓶内培养48h的细胞培养液(含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和质量浓度为20％的胎牛血清的B2培养基)以0.5mL接种到10mL大豆胰蛋白胨培养基(奥博星生物)和10mL麦芽汁培养液(奥博星生物)中，各2只，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周，另外设立阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组：将枯草芽孢杆菌186(购自广州市微生物研究所)和白假丝酵母菌(为白假丝酵母菌标准菌株AX2.2086，购自广州市微生物研究所)分别接种到大豆胰蛋白胨和麦芽汁培养液中，各2只，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周；阴性对照组：将大豆胰蛋白胨和麦芽汁培养液各2只，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。两周以后，阴性对照组4只培养基肉眼观察无明显变化，阳性对照组4只培养基肉眼观察均出现浑浊为实验有效。此时实验组4支试管的任何一支如果出现混浊，说明感染细菌。如果实验组4支试管均无明显变化则可以确定没有感染细菌。
实验结果：阴性对照组4只培养基肉眼观察无明显变化，阳性对照组4只培养基肉眼观察均出现浑浊，证明实验有效。实验组4支试管均无明显变化，可以确定没有感染细菌。
Claims (10)
1.一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于哲罗鲑体细胞体外培养方法，按以下步骤进行：一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体组织，将组织放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的D-Hanks缓冲液中浸泡20秒，再用D-Hanks缓冲液冲洗3遍，得清洗后的组织；三、原代培养组织块：将清洗后的组织剪碎至0.8～1.2mm3的块状，然后将剪碎的组织块移入细胞培养瓶中，使组织块均匀地平铺于细胞培养瓶的底部，向细胞培养瓶中加入0.5mL细胞培养液，将细胞培养瓶倒置于19℃的培养箱中，培养4小时后将细胞培养瓶翻转，并向细胞培养瓶加入8mL细胞培养液，在19℃的培养箱中继续培养至组织块长满细胞培养瓶底面积的80％；四、细胞的原代培养：取0.5mL步骤三得到的原代培养后的组织块放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23℃下于50～100rpm的摇床上消化，每5分钟收集4mL上层消化液，移入预先加入1mL血清的离心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向组织块中补加4mL胰蛋白酶消化液，然后将收集到的消化液和血清混合物于1000r/min离心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL细胞培养液，得悬浮液，调整悬浮液的细胞浓度至105个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％～90％；五、体细胞传代培养：然后消化细胞培养瓶内细胞，收集细胞培养瓶内混合液体于1000r/min离心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入细胞培养液得细胞悬液，调整细胞悬液浓度至1×104～5×104个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19℃培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80％，再次传代，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。
2.根据权利要求1所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤一中断颈处死哲罗鲑的具体方法为：选择体长为12～14cm的哲罗鲑，采用医用尖头镊子插入哲罗鲑口中，另一只手握住其鱼体躯干部，采用背侧移位断颈处死。
3.根据权利要求1或2所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤二所述哲罗鲑鱼体组织为肝脏。
4.根据权利要求3所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤二中采集哲罗鲑鱼体组织的具体方法为：采用碘酒擦拭哲罗鲑鱼体表一次，然后将哲罗鲑浸泡于体积浓度为75％的乙醇溶液中30秒，取出后用灭菌纱布吸干鱼体表面，取全部或部分组织。
5.根据权利要求4所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤三中第二次在19℃的培养箱中继续培养期间，每48小时更换细胞培养液一次。
6.根据权利要求5所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤三、步骤四和步骤五中所述细胞培养液为含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和质量浓度为20％的胎牛血清的B2培养基。
7.根据权利要求6所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤四中所述胰蛋白酶消化液为含有质量浓度0.25％的胰蛋白酶的D-Hanks缓冲液。
8.根据权利要求7所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤四中置于19℃培养箱中培养期间每48小时更换细胞培养液一次。
9.根据权利要求8所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤五中置于19℃培养箱中培养期间每48小时更换细胞培养液一次。
10.根据权利要求9所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤五中消化细胞培养瓶内细胞的方法为：用D-Hanks缓冲液将细胞丰度达到80％～90％的细胞培养瓶冲洗2遍后，加入1mL 0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液，5分钟后加入1mL血清终止消化。
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| 鱼类培养的体细胞与成熟卵的电融合技术研究;石连玉 等;《水产学杂志》;19931130;第6卷(第1期);37-40 * |
| 黄晓明 等.文昌鱼(Branchiostoma belcheri)离体细胞原代培养初步研究.《厦门大学学报》.2006,第45卷181-183. * |
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