CN105601386B - 一种甘蓝型油菜小孢子苗水培培养液及越夏培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜小孢子苗水培培养液及越夏培养的方法，步骤包括将甘蓝型油菜小孢子苗接入培养液中进行水培；待小孢子苗长至三叶一心时更换为添加了终浓度为0.1‑0.5mg/L多效唑的培养液；此后每30天更换一次添加有相同多效唑浓度的培养液；大田移栽前20天更换一次未添加多效唑的培养液；十月中旬开始，将水培种植的小孢子苗移栽至试验田中并进行土壤灌溉。本发明提供的方法降低油菜小孢子苗越夏过程中由于传统B5培养基污染问题造成的幼苗损失，在小孢子再生植株发育成型后摆脱无菌环境，彻底解决了后期由于污染造成的损失，节约小孢子苗越夏的药品试剂费用。

Description

一种甘蓝型油菜小孢子苗水培培养液及越夏培养的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜小孢子苗水培培养液及越夏培养的方法。

背景技术

自1982年Hichter从甘蓝型油菜小孢子培养中获得再生植株后，该技术立刻受到各国油菜育种家的青睐。近几十年以来，国内外广大学者对影响甘蓝型油菜小孢子培养及其成苗的诸多因素进行了广泛研究,游离小孢子培养成为目前产生油菜单倍体的主要途径。小孢子培养技术在油菜遗传和育种研究上有着重要应用价值，该技术经过国内外专家学者十几年的发展和完善，油菜小孢子培养技术有了极大的提高，对于影响小孢子出胚率、成苗率、加倍率等关键因素的研究取得了一系列的进展。然而，油菜小孢子培养技术大规模应用到育种过程中还存在一些问题。目前，我国长江流域冬油菜区由于油菜种植生长时间的限制，从小孢子培养到再生苗移栽到大田一般需5-6个月的时间，小孢子苗不得不保存在光照培养室内反复继代直至10月或11月移栽至田间,在此期间需要经过5-6轮的继代培养，此过程被称之为油菜小孢子苗的“越夏”。油菜小孢子苗继代越夏过程工作量大，继代操作要求严格，试剂费用昂贵，且容易因为污染问题造成幼苗损失，此外，由于继代培养后的小孢子苗长势弱，对田间自然环境适应性差，在移栽至大田之前要对其进行一个月的“炼苗”，以上继代培养的种种不足极大地限制了油菜小孢子培养试验规模。

现如今，油菜小孢子培养过程中小孢子苗越夏普遍采取继代培养方式来实现，而继代培养过程繁琐，操作要求严格，容易污染造成损失，需要花费高额的人工成本和药品试剂成本。

植物水培技术是近几十年新发展起来的一种作物栽培方式，它不用天然土壤栽培作物，而使用营养液通过一定的栽培设施栽培作物。营养液可以替代天然土壤向作物提供水分、养分等，使作物能够正常生长并完成其整个生命周期。

本发明首次将水培技术应用到油菜小孢子苗越夏的过程中，此方法能够极大的节省传统继代越夏过程所需的人工成本和药品费用，此外还能有效的减少传统继代越夏过程中由于污染造成的小孢子苗的损失。该方法为长江中下游地区油菜小孢子苗培养规模化生产提供了一条经济、高效、便捷的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种甘蓝型油菜小孢子苗水培培养液，该培养液适用于甘蓝型油菜小孢子苗的培养，成本低廉，高效。

本发明的另一个目的在于提供了一种甘蓝型油菜小孢子苗越夏培养的方法，该方法克服现有小孢子培养过程中小孢子苗传统继代越夏方法的缺陷，首次将油菜水培技术应用到油菜小孢子苗越夏培养的过程中，建立了一套高效、经济、便捷的油菜小孢子苗越夏培养的体系。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种甘蓝型油菜小孢子苗水培培养液，包括(单位，mg/L)：

KNO₃ 490-530，MgSO₄·7H₂O 470-510，KH₂PO₄ 120-160，Ca(NO₃)₂·4H₂O1000-1200，FeSO₄·7H₂O 12-14，EDTA-2Na 18.00-19.00，MnCl₂·4H₂O 0.900-0.100，ZnSO₄·7H₂O0.08-0.12，CuSO₄·5H₂O 0.035-0.045，H₃BO₃ 1.3-1.5，Na₂MoO₄·4H₂O0.040-0.050，其余为双蒸水。

一种甘蓝型油菜小孢子苗越夏培养的方法，包括下述步骤：将经过1到2次继代成苗的甘蓝型油菜小孢子苗接入培养液中进行水培；待小孢子苗长至三叶一心时更换为添加了终浓度为0.1-0.5mg/L多效唑的培养液。此后每30天更换一次添加有相同多效唑浓度的培养液。大田移栽前20天更换一次未添加多效唑的培养液。十月中旬开始，将水培种植的小孢子苗移栽至试验田中并进行进行土壤灌溉。

所述的培养液包括(单位，mg/L)：KNO₃ 490-530，MgSO₄·7H₂O 470-510，KH₂PO₄120-160，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1000-1200，FeSO₄·7H₂O 12-14，EDTA-2Na 18.00-19.00，MnCl₂·4H₂O0.900-0.100，ZnSO₄·7H₂O 0.08-0.12，CuSO₄·5H₂O 0.035-0.045，H₃BO₃1.3-1.5，Na₂MoO₄·4H₂O 0.040-0.050，其余为双蒸水。

以上所述的方法，优选的，甘蓝型油菜小孢子苗固定在培养板中后再接入培养液中进行水培，具体步骤包括：沿方形海绵一条对角线剪开一个小口，用海绵方块夹住苗茎基部，用海绵将小孢子苗固定在培养板上的小孔中。

以上所述的方法，优选的，所述的培养液包括(单位，mg/L)：KNO₃ 510，MgSO₄.7H₂O490，KH₂PO₄ 140，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1180，FeSO₄·7H₂O 13.995，EDTA-2Na 18.61，MnCl₂·4H₂O0.905，ZnSO₄·7H₂O 0.11，CuSO₄·5H₂O 0.04，H₃BO₃1.43，Na₂MoO₄·4H₂O 0.045，其余为双蒸水。

以上所述的方法，优选的，所述的培养板为KT板；

以上所述的方法，优选的，水培时，小孢子苗超过一半长的根系浸没到培养液中同时根系露出水面2cm以上。

以上所述的方法，优选的，水培时，光照培养室光周期16h/8h(光暗比)，温度20℃。

以上所述的方法，优选的，小孢子苗进行两次继代后再进行水培。

以上所述的方法，优选的，多效唑的终浓度为0.35mg/L。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

降低油菜小孢子苗越夏过程中由于传统B5培养基污染问题造成的幼苗损失。使用本发明能够在小孢子再生植株发育成型后摆脱无菌环境，彻底解决了后期由于污染造成的损失。节约小孢子苗越夏的药品试剂费用，对比传统继代方法而言，使用本发明能够节约88％的药品试剂费用，每一万株苗越夏越能够节约4680元的药品试剂费用。

节约小孢子培养越夏过程中产生的人工成本，传统继代培养方式越夏过程操作要求高，需要专门培训过的技术人员进行操作，且效率极低，平均1000株苗完成一次继代培养需要一个熟练的技术人员4个工作日(32小时)的工作，使用本发明能够有效的提高人工效率，平均1000株苗完成一次培养液的更换仅需一个普通工人2小时的时间。

省去了小孢子苗进行大田移栽前的炼苗过程，传统小孢子苗由于长期生长在无菌的培养基上，幼苗生长弱小无法适应大田环境，所以会在大田移栽前进行一段时间的炼苗，此过程费时费力且会造成一部分弱小幼苗的损失，使用本发明培养的小孢子苗由于摆脱了无菌环境，且在多效挫的合理使用下当生长到适合移栽的时间，小孢子苗已经长得足够旺盛，能够适应大田自然环境。

具体实施方式

本发明实施例所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规技术。所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

试验所用甘蓝型油菜为华油杂62，于2014年10月播种在武汉华中农业大学油菜试验田中，大田种植，常规管理。在次年三月份油菜开花现蕾时期进行小孢子培养。

获得甘蓝型油菜小孢子离体再生苗：

油菜小孢子培养方法参考余凤群(余凤群,刘后利.甘蓝型油菜未成熟小孢子培养体系的研究[D].华中农业大学博士学位论文,湖北,武汉,1994)的试验方法并作适当的调整，具体步骤如下：在三月初初花期取3-4mm大小的花蕾，放入无菌的烧杯中，用70％酒精消毒1min，0.1％HgCl₂消毒10min，无菌水冲洗3次，每次5min。将消毒后的花蕾转移至无菌试管中，用玻璃棒捣碎至匀浆，倒入装有0.44(um)尼龙膜的漏斗中过滤至10ml离心管内。用B5提取液进行定容至10ml刻度线，封口膜进行密封后进行离心5min，转速800r/min。离心完毕后将离心管上层清液倒掉，重新加入B5提取液并用吸管吸打离心管底部花粉至混匀，并再次进行离心。将离心管上层清液倒掉，加入NLN-16培养基并用吸管吸打离心管底部花粉使其重新悬浮，然后转入三角瓶中，用封口膜将三角瓶密封后放入32℃培养箱暗培养48小时，然后重新将三角瓶内的液体转移到离心管内进行离心5min，转速为600r/min，掉到上层清液后加入3-4ml NLN-13培养基并用吸管吸打离心管底部花粉使其重新悬浮，然后分装到6cm培养皿内，每皿滴入2-3滴悬浮液并加入NLN-13培养基进行稀释，保证液体刚刚覆盖培养皿底部，以上所有操作均在无菌条件下进行(离心和暗培养除外)。将培养皿放入25℃培养室暗培养2-3周，待肉眼可见胚状体后置于摇床上，转速为55-60转/min，在25℃条件下震荡1周，当胚生长到子叶期后转入B5固体培养基上进行培养和继代成苗(培养温度为24-26℃，光照每天12h，光强为1800lux)。

一种甘蓝型油菜小孢子苗越夏培养的方法，包括下述步骤：

1.制作前期准备工作：将KT板制成60cm*80cm规格的培养板，培养板上用打孔器均匀打出直径为1.2cm的圆形小孔，将塑料盆用黑色油漆刷黑晒干制成培养盆，将厚度为1cm的海绵剪成边长为1cm的方块，并将海绵方块沿一条对角线剪开一个小口用来固定小孢子苗。配制培养液，每个培养盆中添加10L纯水配置的培养液(具体配制见表1)。

2.进行小孢子苗的移栽：将经过2次继代成苗的甘蓝型油菜小孢子苗从B5固体培养基中挖出洗净，然后用海绵方块夹住苗茎基部固定至培养板上的小孔中，最后将固定有小孢子苗的培养板放置在装有10L培养液的培养盆中，确保小孢子苗超过一半长的根系浸没到培养液中且根系露出水面2cm以上。

共计分5次对1910株小孢子苗进行了移栽，移栽一周后统计小孢子苗的存活率，本实施例结果显示对小孢子再生苗进行水培种植后的存活率超过90％(表2)。

小孢子苗进行水培培养至三叶一心时期时，更换添加了终浓度为0.35mg/L的多效唑的培养液继续培养，此后每30天更换一次添加有相同终浓度的多效唑的培养液。

3.小孢子苗移栽至大田：大田移栽前20天更换一次未添加多效唑的培养液。十月中旬开始，将水培种植的小孢子苗从培养板上移出，移栽至试验田中并进行进行土壤灌溉。对共计1773株小孢子苗分3次移栽至大田中，移栽一周后统计小孢子苗存活率，本实施例结果显示小孢子苗进行大田移栽的存活率超过93％(表3)。

表1培养液配方

表2水培种植小孢子苗存活率

表3小孢子苗大田移栽存活率

表45月-10月份每种植1000棵油菜小孢子苗所需药品费用对比

注：水培培养液主要由大量元素提供，故没有计算用量极少的铁盐和微量元素的费用；B5固体培养基主要由蔗糖和琼脂粉配制而成，而其他大量元素、铁盐、微量元素用量很少故没计算在内。

通过表4可以看到，本试验使用培养液代替B5固体培养基来培养油菜小孢子苗，并对两种方法所花费的费用做了计算。每1000棵小孢子苗从5月到10月的种植过程中两种培养方法花费的药品试剂费用差别很大。其中，B5固体培养基继代培养1000棵小孢子苗需要花费531元药品费，而水培技术种植1000棵小孢子苗仅需63元药品费用，水培技术能够节约大约88％的药品试剂费用。

Claims (7)

1.一种甘蓝型油菜小孢子苗越夏培养的方法，包括下述步骤：将经过1到2次继代成苗的甘蓝型油菜小孢子苗接入培养液中进行水培；待小孢子苗长至三叶一心时更换为添加了终浓度为0.1-0.5mg/L多效唑的培养液；此后每30天更换一次添加有相同多效唑浓度的培养液；

大田移栽前20天更换一次未添加多效唑的培养液；十月中旬开始，将水培种植的小孢子苗移栽至试验田中并进行进行土壤灌溉。

所述的培养液，包括，单位，mg/L：

KNO₃ 490-530，MgSO₄·7H₂O470-510，KH₂PO₄ 120-160，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1000-1 200，FeSO₄·7H₂O 12-14，EDTA-2Na 18.00-19.00，MnCl₂·4H₂O 0.900-0.100，ZnSO₄·7H₂O0.08-0.12，CuSO₄·5H₂O 0.035-0.045，H₃BO₃ 1.3-1.5，Na₂MoO₄·4H₂O 0.040-0.050，其余为双蒸水。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的甘蓝型油菜小孢子苗固定在培养板中后再接入培养液中进行水培，具体步骤包括：沿方形海绵一条对角线剪开一个小口，用海绵方块夹住苗茎基部，用海绵将小孢子苗固定在培养板上的小孔中。

3.根据权利要求1所述的方法，所述的培养液，其特征在于：KNO₃ 510，MgSO₄.7H₂O 490，KH₂PO₄ 140，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1180，FeSO₄·7H₂O 13.995，EDTA-2Na 18.61，M nCl₂·4H₂O0.905，ZnSO₄·7H₂O 0.11，CuSO₄·5H₂O 0.04，H₃BO₃ 1.43，Na₂MoO₄·4H₂O 0.045，其余为双蒸水。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：水培时，所述的小孢子苗超过一半长的根系浸没到培养液中同时根系露出水面2cm以上。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：水培时，光照培养室光周期16h/8h，温度20℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的小孢子苗进行两次继代后再进行水培。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：多效唑的终浓度为0.35mg/L。