CN102217532A - 甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及油菜小孢子培养方法，公开了一种甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法，属植物新品种培育新方法。针对目前甘蓝型油菜小孢子培养中存在的问题，在取样时期、时间、方式、提取液、培养方法、加倍方法和长途无菌运输等技术方面分别行了改进，使得甘蓝型油菜小孢子培养效率大幅度提高，培养方法和培养程序简化，降低了培养成本，方便推广和应用。
Description
技术领域
本发明涉及油菜小孢子培养方法，尤其涉及甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法，属植物新品种培育新方法。
背景技术
甘蓝型油菜是我国主要油料作物，其遗传育种、基因组学研究、代谢组学研究、种质资源创新、细胞遗传学研究和分子遗传学研究十分活跃。油菜小孢子离体培养在上述领域有着十分广泛的应用。
Lichter于1982年利用甘蓝型油菜游离小孢子培养获得再生植株，随后各国学者对影响油菜小孢子培养及其成苗的诸多因素进行了广泛的研究，使得油菜小孢子培养技术更为简化、效率更高、便于操作。我国学者根据我国温室栽培条件不足、取材主要来自大田的实际情况，研究了大田油菜小孢子培养的制约因素及相关技术，形成了一套有别于国外的甘蓝型油菜小孢子培养技术体系。但是，尽管如此，甘蓝型油菜小孢子培养技术仍然繁琐，效率低下，存在进一步简化和提高效率的要求和余地。
目前甘蓝型油菜小孢子培养技术主要来自Lichter的方法，主要包括：初花期从主花序和上部一次分枝花序上摘取处于单核晚期的花蕾16个，用75％的酒精进行1min的表面消毒，再在0.1％的升汞中消毒10min。用无菌水洗涤3次，在含13％蔗糖的B5液体培养基(含B5大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH5.8)中研磨成匀浆，用40μm的尼龙网过滤，滤液经800r/min离心5min，除去上清液，重复3次。加8mL含16％蔗糖和50mg/L的秋水仙素的NLN液体培养基中，于32℃恒温培养箱中暗培养2天，使小孢子加倍。将加倍后的小孢子悬浮液经800r/min离心5min，除去上清液。再加8mL含16％蔗糖的NLN液体培养基，将上述小孢子悬浮液分装于10个直径9cm的一次性无菌培养皿中，添加NLN液体培养基将培养皿底部覆盖。密封后将培养皿置于32℃恒温培养箱中热激暗培养2天，然后移到25℃恒温培养箱中暗培养至有肉眼可见的胚状体出现，转至摇床继续培养(40r/min，25℃，黑暗)至胚状体长大。之后将胚状体转移到含2％蔗糖的B5固体培养基(含B5大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，0.8％琼脂，pH5.8)的培养瓶中，在2℃低温生长箱中春化处理10d，再在25℃、16h光照及弱光下光照培养，长大后移栽到大田。
从上述的小孢子培养过程可以看出，甘蓝型油菜小孢子培养过程繁琐、复杂、效率低、成本高。尤其是每次取样折断整个花序，使得每个单株只能取样一次，取样的群体要求较大。对于只有少数种子的材料难以进行小孢子培养，而且由于取样来自不同的单株，单株间基因型的差别影响利用小孢子培养获得的DH群体用来研究遗传规律。而且，为了加快研究进程，我国大部分科研、教学单位在夏季到青海加代进行小孢子培养，胚状体苗的长途无菌运输也成为制约油菜小孢子培养成败的一个因素。
针对上述油菜小孢子培养中存在的问题进行研究，简化培养过程、提高培养效率、降低培养成本是决定油菜小孢子培养能否推广普及的关键。
发明内容
针对目前甘蓝型油菜小孢子培养中存在的问题，本发明在取样时期、时间、方式、提取液、培养方法、加倍方法和长途无菌运输等技术方面分别行了改进，目的是大幅度提高甘蓝型油菜小孢子培养效率、简化培养方法和培养程序、降低培养成本。
为实现本发明目的，技术方案如下：
1、将取样时期由过去的初花期提前到现蕾期
目前油菜小孢子培养的取样时间通常在油菜初花后。由于油菜花期升温快、可供取样的适合培养时间短，往往造成小孢子的培养时间紧，后期田间大量试验任务与室内小孢子培养工作重叠。为了增加小孢子培养时间、缓解开花后期田间与室内工作的矛盾，我们改进了取样时期，将现在的初花后取样提前到现蕾以后，提前的时间大约9天左右。具体方法为：在青海省西宁市青海农科院试验田，在现蕾期、气温在20℃的上午或下午，选取31005(H155×Qva)每个单株上所有2.8mm～3.5mm单核靠边期的花蕾40个，放入装有碎冰的50mL离心管中，置于冰盒中带回实验室。去掉碎冰，将30mL 84消毒液倒入50mL离心管中，盖上盖子，灭菌10min，其间反复上下摇晃，使84消毒液与花蕾和管壁充分接触灭菌。在超净工作台内将灭过菌的花蕾移入另外一个无菌的50mL离心管中，用4℃无菌水洗涤3次。然后按照小孢子培养程序进行小孢子培养。
表1取样时期对小孢子培养效果的影响
由表1可以看出，在初花前9天(见附图1)，取样培养可以获得胚状体，只是可以用来培养的合适大小的花蕾较少，所得的胚状体较少，但是出赔率较高。随着时间的推移，可以用于培养的花蕾增多，出胚率也显著增加。初花前后一周可用于培养的合适大小的花蕾数量大，出胚率达到最高。初花后15天以后适合培养的花蕾数量急剧下降，出胚率也显著降低。所以，将小孢子培养的时间提前到现蕾期，不仅可以获得较为理想的培养效果，而且可以将培养时间增加30％左右，缓解油菜初花期后的用工压力。
2、在一天中气温达到20℃左右取样出胚率最高
多年的油菜小孢子培养实践表明，取样时的气温对出胚率存在较大的影响。为了提高培养效率，需要探究合适的取样温度。我们在一天的上午7点、上午10点、下午14点、下午17点四个不同的时间取样，发现出胚率明显不同。由表2可见，一天中，上午7点取样没有得到胚状体，上午10点和下午17点取样能够获得胚状体，但出胚率较低。下午14点取样出胚率最高，培养效果最好。在西宁8月中旬，早上7点的气温较低(10℃左右)，下午14点气温可达到20℃左右，上午10点和下午17点气温都低于20℃。
表2取样时间对小孢子培养效果的影响
3、反复取样代替一次破坏性取样
油菜小孢子培养的取样方式过去采取折断主花序、再在室内摘取合适大小的花蕾培养。这种取样方式造成每个单株只能使用一次，要求用来培养的材料要有足够种子，以便产生足够大的取样群体。通常，一个主花序适合培养的花蕾只有4～5个，要满足一个季节的小孢子培养需要50个以上的单株。对于难以获得足够种子和足够大取样群体的材料，很难利用常规的折断主花序取样的方法进行小孢子培养。因此，我们对小孢子培养的取样方式进行改进，从现蕾期开始选取每个单株上适合大小的花蕾进行培养，让较小的花蕾继续生长，然后分期分批进行培养，从而实现每个单株多次反复取样，大大提高材料的使用效率。而且，这样做，可以以单株为单位取样，保证了材料的遗传背景的一致，解决了过去不同单株的花蕾混合取样、难以保证样品遗传背景一致的问题。结果表明，改进后的小孢子出胚率与过去的取样方式的差异不明显，但是材料的利用效率提高了9倍，从而可以减少样品数量，减少试验用地，降低试验成本(见附图2)。
表3取样方式对小孢子培养效率的影响
4、利用13％的蔗糖溶液替代含13％蔗糖的B5液体培养基提取小孢子
过去小孢子培养的提取液一直采用含13％蔗糖的B5液体培养液，该培养液包括B5大量元素、微量元素、铁盐和有机成分、13％蔗糖。考虑到小孢子提取时间短，能够吸收的营养元素有限，但提取过程需要大量的B5液体培养液，常常造成价格昂贵的B5大量元素、微量元素、铁盐和有机成分白白浪费。因此我们尝试去掉这些B5成分，只保留维持渗透压的13％蔗糖，结果发现改进后的提取液没有减少出胚率。因此这是一种切实可行的降低成本的有益改进。
表4不同的提取液对小孢子培养效果的影响
5、直接在32℃暗培养替代32℃暗培养两天再在25℃暗培养
以往油菜小孢子培养的方法是先将装有花粉悬浮液的培养皿放在32℃的恒温培养箱中热激暗培养2天，再将其移到25℃的恒温培养箱中暗培养至出胚。为了简化培养的操作程序、缩短培养时间，我们探索直接在32℃的恒温培养箱中暗培养，结果表明，这样不仅不影响出胚率和出胚数，还能够缩短出胚时间4
表5培养方式对小孢子培养效果的影响
天左右(见附图3)，这项改进可以减少异地加代时间，使得试管苗能够及时运回内地、保证越冬前将试管苗移栽到大田。
6、胚状体的长途无菌运输
目前国内相关单位普遍采取夏季到青海异地加代小孢子培养来加快研究进程，小孢子胚状体的长途无菌运输是大家普遍遇到的难题。常用的运输方法有两种，一种是将胚状体转移到B5固体培养基上，一种是用B5液体培养基运输。前者的优点是固体培养基在长途运输过程中不晃动，胚状体间相互不影响，污染少。缺点是这种方式运输的效率低，每个容器中可放置的胚状体少。采用液体培养基可以使运输的胚状体数量增加8倍以上，运输体积减少7倍，因此运输效率提高15倍以上。但是，采用液体培养基运输，由于液体摇晃，污染的机率增加，一般污染率为1/3～1/4。所以，为了保险起见，如果胚状体较少，应该采用固体培养基运输。如果胚状体较多，可以采用液体培养基运输，但是要采取措施，使得容器密封完好，减少运输过程中的摇晃(见附图4)。
表6胚状体的长途无菌运输
7、采用苗期秋水仙素浸根加倍替代秋水仙素处理花粉加倍
目前油菜小孢子培养中的染色体加倍通常在培养前用含秋水仙素的NLN培养基处理小孢子2天，报道认为加倍率高达80％以上。但是，我们多年实践表明，秋水仙素对小孢子有伤害，导致很多材料的小孢子不能膨大、生长，无法得到胚状体。尽管传统的苗期浸根的加倍率只有47.59％，不及用含秋水仙素的NLN培养基处理小孢子2天的加倍率高，但是由于在小孢子前期培养中没有秋水仙素的抑制，出赔率高，而且不影响出胚，移栽成活率高(97.85％)。与用秋水仙素处理小孢子后难以得到胚状体相比，苗期浸根发加倍成本也不高，是一种简便和切实可行的染色体加倍方法。
表7染色体加倍方式对小孢子培养效率的影响
本发明有益效果在于：(1)将现在的初花后取样提前到现蕾以后，使得培养工作前移，小孢子培养时间增加9天左右，使得培养的成功率提高1倍多。(2)在一天中气温达到20℃左右取样出胚率最高。(3)每个单株反复取样材料较过去一次折断取样相比，取样群体的利用效率提高了9倍，可以减少样品数量，减少试验用地，降低试验成本。(4)利用13％的蔗糖溶液替代含13％蔗糖的B5液体培养基提取小孢子，没有减少出胚率培养，降低了成本，并且减少了配制B5的操作和用工。(5)直接32℃暗培养替代32℃暗培养两天再25℃暗培养，使得出胚时间提前4天左右。(6)采用液体培养基可以使运输的胚状体数量增加8倍以上，运输体积减少7倍，因此运输效率提高15倍以上。
附图说明
图1本发明取样前甘蓝型油菜的花序图片；
图2本发明连续取样后甘蓝型油菜的的花序图片；
图3本发明甘蓝型油菜的出胚图片；
图4本发明胚状体用含13％蔗糖的B5培养液长途无菌运输图片；
具体实施方式
为对本发明进行进行更好的说明，举实施例如下：改进后的甘蓝型油菜小孢子简化高效培养技术通过如下方式实现：
在青海省西宁市青海农科院，在现蕾期、气温在20℃的上午或下午，反复多次选取31005(H155×Qva)每个单株上所有2.8mm～3.5mm单核靠边期的花蕾40个，放入装有碎冰的50mL离心管中，置于冰盒中带回实验室。去掉碎冰，将30mL 84消毒液倒入50mL离心管中，盖上盖子，灭菌10min，其间反复上下摇晃，使84消毒液与花蕾和管壁彻底灭菌。在超净工作台内将灭过菌的花蕾移入另外一个无菌的50mL离心管中，用冷藏至4℃的无菌水洗涤3次。倒掉无菌水，在离心管中滴入1～2mL冷藏至4℃的无菌的13％的蔗糖溶液，快速研磨至匀浆，用40μm的尼龙网过滤小孢子至另一无菌的50mL离心管中，加冷藏至4℃的无菌的13％的蔗糖溶液至45mL处，密封，在800r/min转速下离心5min，弃上清液，重复上述洗涤过程两次。加8mL含16％蔗糖的NLN液体培养基，将上述小孢子悬浮液分装于10个直径9cm的培养皿中，添加NLN液体培养基将培养皿底部覆盖。密封后将培养皿置于32℃恒温培养箱中暗培养至有肉眼可见的胚状体出现，转至摇床继续培养(40r/min，25℃，黑暗)至胚状体长大。将50个胚状体转入装有B5固体培养基(含2％蔗糖)的150mL的三角瓶中，或者将400个胚状体装入装有B5液体培养基(含13％蔗糖)的50mL的离心管中，密封，通过火车等方式运回内地。之后将胚状体转移到2％蔗糖的B5固体培养基(含B5大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，0.8％琼脂，pH5.8)的培养瓶中，在4℃低温生长箱中春化处理10d，再在25℃、16h光照及弱光下光照培养，直至移栽到温室。等试管苗长至5～10片叶时，将苗子挖出，洗净，用1g/L的秋水仙素溶液浸根4小时，再将苗子栽到温室。花期将有花粉的单株套袋自交获得DH种子。
Claims (2)
1.甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法，包括取样、培养基提取小孢子、小孢子培养、胚状体的长途无菌运输及胚状体培养，其特征在于，对各环节进行了改进，具体如下：在甘蓝型油菜现蕾期、气温20℃时，H155×Qva选取每个单株上所有2.8mm～3.5mm单核靠边期的花蕾30-50个，放入装有碎冰的离心管中；去掉碎冰，将84消毒液倒入离心管中，灭菌，其间反复上下摇晃；将灭过菌的花蕾，用4℃的无菌水洗涤；倒掉无菌水，在离心管中滴入4℃的无菌13％蔗糖溶液，快速研磨成匀浆，用尼龙网过滤小孢子至另一无菌离心管中，加4℃的无菌13％的蔗糖溶液，密封，离心，弃上清液，加含16％蔗糖的NLN液体培养基，将小孢子悬浮液分装于培养皿中，添加NLN液体培养基将培养皿底部覆盖，密封；然后将培养皿置于32℃恒温培养箱中暗培养至有肉眼可见的胚状体出现，转至摇床继续培养至胚状体长大；将胚状体转入含2％蔗糖、B5固体培养基的三角瓶中，或者将胚状体装入含13％蔗糖、B5液体培养基的离心管中，密封，运输；之后将胚状体转移到含2％蔗糖、B5固体培养基的培养瓶中，在2℃低温生长箱中春化处理10d，再在25℃、16h光照及弱光下光照培养，直至移栽到温室；等再生苗长至5～10片叶时，将苗子挖出，洗净，用秋水仙素溶液浸根4-5小时，再将苗子栽于温室；花期将有花粉的单株套袋，自交获得DH种子。
2.如权利要求1所述的甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法，其特征在于，取样时期提前至蕾期、多次反复取样、在环境温度达到20℃以上时取样、用蔗糖溶液替代B5培养液作提取液、根据胚状体的多少选择适当的长途运输方式等。
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