CN102640704B - 提高甘蓝型油菜花粉小孢子培养产胚率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高甘蓝型油菜花粉小孢子培养产胚率的方法，将甘蓝型油菜的播种时间提前，比当地油菜正常播种季节提前5～10天，并在播种前先施加底肥；从田间播种到开花期期间保持土壤水分充裕，在开花前30～40天重施追肥1次；在开花期时进行田间取蕾，选取植株长势旺、分枝多、主花序及一次分枝上的花蕾足够多的花蕾进行取蕾，取花蕾上从外到内第3～4环的花蕾；将取得的花蕾用B5-13培养基分离出游离小孢子，经过培养后，即可获得诱导出来的胚状体。结果每个花蕾的产胚量都超过了500个胚。本发明的方法简单，容易实施，成本低廉，使用效果好。

Description

提高甘蓝型油菜花粉小孢子培养产胚率的方法
技术领域
本发明涉及农业种植领域，尤其是一种提高甘蓝型油菜花粉小孢子培养产胚率的方法。
背景技术
甘蓝型油菜Brassica napus L是三种油用油菜（白菜型油菜、芥菜型油菜、甘蓝型油菜）中籽粒产量最高的种类，目前在我国长江游流域大量种植，是我国最重要的油料作物。甘蓝型油菜花粉小孢子培养产胚率是种质资源创新的一个关键，在甘蓝型油菜小孢子培养过程中，产胚率低的原因很多归咎与植株的基因型，在国内外甘蓝型油菜小孢子培养中，一般情况每个花蕾的产胚量只有几十个，有的甚至只有几个。
发明内容
本发明的目的是：提供一种提高甘蓝型油菜花粉小孢子产胚率的方法，它能显著提高甘蓝型油菜花粉小孢子产胚率，以克服现有技术的不足。
本发明是这样实现的：提高甘蓝型油菜花粉小孢子培养产胚率的方法，将甘蓝型油菜的播种时间提前，比当地油菜正常播种季节提前3～10天，并在播种前先施加底肥；从田间播种到开花期期间保持土壤水分充裕，在开花前30～40天重施追肥1次；在开花期时进行田间取蕾，选取植株长势旺、分枝多、主花序及一次分枝上的花蕾足够多的花蕾进行取蕾，取花蕾上从外到内第3～4环的花蕾；将取得的花蕾用B5-13培养基分离出游离小孢子，然后用含有200mg/L秋水仙素的NLN-13培养基将游离小孢子分装成15蕾/皿，首先在32℃下暗培养24小时，然后更换成不含秋水仙素的NLN-13培养基，继续在32℃暗培养48小时后转移到25℃暗培养10～15天，即可获得诱导出来的胚状体。
所述的底肥以有机肥为主，在有机肥中增施磷、钾、硼肥，施加量为有机肥2500～3500公斤/亩，过磷酸钙75～85公斤/亩，氯化钾或硫酸钾20～30公斤/亩及硼砂1～1.5公斤/亩。
所述的追肥为尿素为20公斤/亩、复合肥20公斤/亩、清粪水2500～3000公斤/亩及堆渣肥2000～2500公斤/亩。
将游离小孢子在培养皿中培养25～28天，将培养基更换为新的NLN-13培养基，然后在3℃的冰箱内保存15～150d，这样的方式可以解决现有技术中胚状体或苗越夏难的问题。该方式包括胚状体从保存时间到换液次数，以及最长保存时间全部技术，都极大减少人力、财力和物力，提高利用甘蓝型油菜小孢子培养创新种质资源的效率，对于创新种质资源、尤其是特优和特异种质资源具有重要作用。
为了进一步验证本发明的实验效果，进行了如下实验：
1、材料与方法
1.1、试验时间及地点
试验设在地处重庆北碚地区，平均海拔260m,年平均气温14.5℃，无霜期平均265d，年平均降水量1200mm。属岩盆地地貌，试验地为西南大学校内农场，位于重庆市北碚区天生路，施肥、管理比较方便，土壤为黄壤土。
1.2 试验设计
试验设4个处理，包括方案1、方案2、方案3及常规方案（对照），每个处理面积49.1m2，处理重复2次。方案1、方案2及方案3中施肥、取蕾及培养的具体内容对应实施例1、实施例2及实施例3。
表1
Figure 679806DEST_PATH_IMAGE001
1．3 试验材料
供试土壤的农化性状：酸性黄壤土。
供试肥料：尿素（N 46% ，赤水天然气化工厂生产），普通过磷酸钙（P2O5 18%，开磷集团息烽磷肥厂生产，氯化钾（K2O 60%，俄罗斯生产）。
供试品种：LCD17(LCD10×LCD01)。
1.4 试验研究方法
所诱导出来的胚状体直接在肉眼下进行观察。
2、结论
根据观察可以得知，通过该培养体系获得小孢子的产胚率可以达到500个胚/蕾以上。
由于采用上述的技术方案，与现有技术相比，本发明采用对甘蓝型油菜的播种、田间管理、取蕾及培养等多个关键技术进行改进，甘蓝型油菜小使孢子培养产胚率极大提高，根据本发明随机统计了10皿（产胚量中等）的产胚量，结果每个花蕾的产胚量都超过了500个。本发明的方法简单，容易实施，成本低廉，使用效果好。
具体实施方式
本发明的实施例1：提高甘蓝型油菜花粉小孢子培养产胚率的方法，将甘蓝型油菜的播种时间提前，比当地油菜正常播种季节提前3天，并在播种前先施加底肥；从田间播种到开花期期间保持土壤水分充裕，在开花前35天重施追肥1次；在开花期时进行田间取蕾，选取植株长势旺、分枝多、主花序及一次分枝上的花蕾足够多的花蕾进行取蕾，取花蕾上从外到内第3～4环的花蕾；将取得的花蕾用B5-13（含13%的蔗糖）培养基分离出游离小孢子，然后用含有200mg/L秋水仙素的NLN-13（含13%的蔗糖）培养基将游离小孢子分装成15蕾/皿，首先在32℃下暗培养24小时，然后更换成不含秋水仙素的NLN-13培养基，继续在32℃暗培养48小时后转移到25℃暗培养12天后，即可获得诱导出来的胚状体；其中所述的底肥以有机肥为主，在有机肥中增施磷、钾、硼肥，施加量为有机肥3000公斤/亩，过磷酸钙50公斤/亩，氯化钾或硫酸钾25公斤/亩及硼砂1.2公斤/亩；所述的追肥为尿素为20公斤/亩、复合肥20公斤/亩、清粪水28公斤/亩及堆渣肥2200公斤/亩；将游离小孢子在培养皿中培养28天，将培养基更换为新的NLN-13培养基，然后在3℃的冰箱内保存15天~150天。
本发明的实施例2：提高甘蓝型油菜花粉小孢子培养产胚率的方法，将甘蓝型油菜的播种时间提前，比当地油菜正常播种季节提前5天，并在播种前先施加底肥；从田间播种到开花期期间保持土壤水分充裕，在开花前30天重施追肥1次；在开花期时进行田间取蕾，选取植株长势旺、分枝多、主花序及一次分枝上的花蕾足够多的花蕾进行取蕾，取花蕾上从外到内第3～4环的花蕾；将取得的花蕾用B5-13培养基分离出游离小孢子，然后用含有200mg/L秋水仙素的NLN-13培养基将游离小孢子分装成15蕾/皿，首先在32℃下暗培养24小时，然后更换成不含秋水仙素的NLN-13培养基，继续在32℃暗培养48小时后转移到25℃暗培养12天后，即可获得诱导出来的胚状体；其中所述的底肥以有机肥为主，在有机肥中增施磷、钾、硼肥，施加量为有机肥2500公斤/亩，过磷酸钙75公斤/亩，氯化钾或硫酸钾20公斤/亩及硼砂1公斤/亩；所述的追肥为尿素为20公斤/亩、复合肥20公斤/亩、清粪水2500公斤/亩及堆渣肥2000公斤/亩；将培养得到的小孢子在培养皿中培养25天后，再将培养基更换为新的NLN-13培养基，然后在3℃的冰箱内保存90d，见光培养5天后胚就完全转变成绿色。
本发明的实施例3：提高甘蓝型油菜花粉小孢子培养产胚率的方法，将甘蓝型油菜的播种时间提前，比当地油菜正常播种季节提前10天，并在播种前先施加底肥；从田间播种到开花期期间保持土壤水分充裕，在开花前40天重施追肥1次；在开花期时进行田间取蕾，选取植株长势旺、分枝多、主花序及一次分枝上的花蕾足够多的花蕾进行取蕾，取花蕾上从外到内第3～4环的花蕾；将取得的花蕾用B5-13培养基分离出游离小孢子，然后用含有200mg/L秋水仙素的NLN-13培养基将游离小孢子分装成15蕾/皿，首先在32℃下暗培养24小时，然后更换成不含秋水仙素的NLN-13培养基，继续在32℃暗培养48小时后转移到25℃暗培养12天后，即可获得诱导出来的胚状体；其中所述的底肥以有机肥为主，在有机肥中增施磷、钾、硼肥，施加量为有机肥3500公斤/亩，过磷酸钙85公斤/亩，氯化钾或硫酸钾30公斤/亩及硼砂1.5公斤/亩；所述的追肥为尿素为20公斤/亩、复合肥20公斤/亩、清粪水3000公斤/亩及堆渣肥2500公斤/亩；将游离小孢子在培养皿中培养28天，将培养基更换为新的NLN-13培养基，然后在3℃的冰箱内保存150d。

Claims (1)

1.一种提高甘蓝型油菜花粉小孢子培养产胚率的方法，其特征在于：将甘蓝型油菜的播种时间提前，比当地油菜正常播种季节提前3～10天，并在播种前先施加底肥；从田间播种到开花期期间保持土壤水分充裕，在开花前30～40天重施追肥1次；在开花期时进行田间取蕾，选取植株长势旺、分枝多、主花序及一次分枝上的花蕾足够多的花蕾进行取蕾，取花蕾上从外到内第3～4环的花蕾；将取得的花蕾用B5-13培养基分离出游离小孢子，然后用含有200mg/L秋水仙素的NLN-13培养基将游离小孢子分装成15蕾/皿，首先在32℃下暗培养24小时，然后更换成不含秋水仙素的NLN-13培养基，继续在32℃暗培养48小时后转移到25℃暗培养10～15天，即可获得诱导出来的胚状体；所述的底肥以有机肥为主，在有机肥中增施磷、钾、硼肥，施加量为有机肥2500～3500公斤/亩，过磷酸钙75～85公斤/亩，氯化钾或硫酸钾20～30公斤/亩及硼砂1～1.5公斤/亩；所述的追肥为尿素为20公斤/亩、复合肥20公斤/亩、清粪水2500～3000公斤/亩及堆渣肥2000～2500公斤/亩。
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黄桃翠.温室种植甘蓝型油菜小孢子培养技术研究.《西南大学硕士学位论文》.2009,(第10期),全文.

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