CN108770686B - 一种油菜小孢子高效培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种油菜小孢子高效培养方法，步骤包括：S1、取材、选蕾；S2、加倍培养：花粉用含有14～16mg/L秋水仙碱的NLN‑16液体培养基稀释暗培养；S3、胚诱导培养：将加倍培养后没有污染的NLN‑16花粉悬浮液离心，留下沉淀的花粉用含有7～8mg/L秋水仙碱的NLN‑13培养液稀释进行暗培养；S4、再生苗培养；S5、成苗移栽。本发明建立了一套油菜高效小孢子培养技术体系，这套技术能够有效地提高目前难以出胚基因型材料的出胚效率、一次成苗率和加倍率。

Description

一种油菜小孢子高效培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种油菜小孢子高效培养方法。

背景技术

小孢子培养是将处于单核中晚期的小孢子从花药中分离出来培养，形成单倍体胚，再经过加倍后形成正常的二倍体植株。80年代德国研究者从油菜小孢子培养中获得植株后，继续对供体植株的生理状态、单核小孢子发育阶段、培养基的组分、受体材料的基因型、分离小孢子的方法以及小孢子培养环境条件等方面进行了详细的研究，最终获得了一套具有广适应性的油菜小孢子再生体系(Lichter,1982；Choung and Beversdorf,1985)。国内的研究者对影响油菜小孢子培养胚诱导效率、秋水仙碱处理的加倍率及无菌苗直接移栽的存活率等诸多因素也进行了深入的研究，低温诱导胚状体和增加琼脂浓度能有效提高一次成苗率，避免了二次成苗弱小和错过夏繁季节(王汉中等，2004；杨立勇等，2005)。但是目前仍然存在个别基因型的材料小孢子培养中出胚率低，成苗后加倍率低的现状。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种油菜小孢子高效培养方法，这套技术能够有效地提高目前难以出胚基因型材料的出胚效率、一次成苗率和加倍率。

本发明提供了一种油菜小孢子高效培养方法，步骤包括：

S1、取材、选蕾：选取生长良好的油菜花序处于单核靠边期的花蕾，灭菌，抽提花粉；

S2、加倍培养：花粉用含有14～16mg/L秋水仙碱的NLN-16液体培养基稀释后在31.5-32.5℃条件下暗培养48h-72h；

S3、胚诱导培养：将加倍培养后没有污染的NLN-16花粉悬浮液离心，留下沉淀的花粉用含有7～8mg/L秋水仙碱的NLN-13培养液稀释，稀释后的悬浮液分装入培养皿中，培养皿封口后在24～26℃的条件下进行暗培养14～16天，将悬浮培养液用NLN-13培养基稀释，分装到新的培养皿中，培养9-11天后查看是否有可见的白色颗粒状胚的形成，无可见胚形成则继续培养，有可见胚形成则将可见胚移至恒温摇床上进行暗培养，直至胚继续生长；

S4、再生苗培养：将步骤S3所得的胚移入培养基进行再生苗诱导，13～17天换一次培养基进行继代培养，继代培养1～2次至长出再生苗；

S5、成苗移栽：洗净再生苗根部的培养基后，用秋水仙碱溶液浸根，然后进行移栽。

优选的，步骤S4中，将步骤S3所得的子叶形胚移入B5固体培养基进行再生苗诱导，将步骤S3所得的低质量胚转移到B5固体培养基上，并加入仅覆盖胚状体的浅层液体NLN-13培养基，然后进行再生苗诱导。所述低质量胚为球形胚、心形胚等非子叶形胚。

更加优选的，步骤S4所述再生苗诱导为：于20℃，16hr光/8hr暗，2000LUX光强条件下培养，进行再生苗的诱导。

优选的，步骤S3中，恒温摇床上进行暗培养的条件为转速50rpm、在25℃环境下进行暗培养直至胚继续生长。

优选的，步骤S1所述生长良好的油菜花序为主枝花序或距主花序最近的侧枝花序。

更加优选的，步骤S1所述花蕾选取长度为2.5～4mm的花蕾，其中，主枝花序上的花蕾选取长度为2.5～3.5mm的花蕾，侧枝花序上的花蕾选取长度为3.0～4mm的花蕾。

优选的，步骤S1所述灭菌步骤包括：将花蕾用75％的酒精消毒30-40s，然后用升汞消毒10min,最后用无菌水清洗3次，每次5min。

优选的，步骤S1所述抽提花粉步骤包括：向灭菌后的花粉中加入B5液体培养基，研磨使花粉散出，继续加入B5液体培养基，悬浮液通过300目滤布过滤，用滤液冲洗花粉，将花粉悬浮液稀释后离心，弃上清液，得到沉淀的花粉。

优选的，步骤S3中，将所述沉淀的花粉用含有7～8mg/L秋水仙碱的NLN-13培养液稀释至每毫升溶液含花蕾1.5～2个；将所述悬浮培养液用NLN-13培养基稀释2倍。

优选的，步骤S5中，所述用秋水仙碱溶液浸根为采用质量浓度0.1％的秋水仙碱溶液浸泡4～6小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

此项专利中在小孢子胚诱导发生过程中加入低浓度的秋水仙碱，在处理2周左右后转移到含有秋水仙碱的悬浮培养基中持续到出胚阶段。所处理材料的出胚率相比85mg/L秋水仙碱只处理2天的出胚率提高了20％-50％，并且所得植株的加倍率也提高了10％-30％。低浓度的秋水仙碱持续处理小孢子细胞既能够促进胚诱导发生又能够提高成苗植株的加倍率。另外针对非子叶胚进行NLN13(液体)-B5固体双层培养基培养，相比B5单层固体培养基培养能够显著提高一次成苗率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明提供的油菜小孢子高效培养方法的流程示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1

本实施例提供了一种油菜小孢子高效培养方法，步骤包括：

1.取材

取材时间为天气晴朗的上午10点之间，取材的部位，选取主花序的花蕾,该花序有以下特点：

1)最好选主枝，主枝的花序对于出胚率很重要(主花序花粉活力强，小孢子的发育时期较一致)。选主枝上花序已开花，且开花的朵数在1-10朵之间,开3-5朵花的主花序的花蕾的出胚率相对较高。

2)在选花蕾时，不要选柱头露出的和花蕾裂开的，以免灭菌不彻底；

3)如果没有合适的主花序可取,可以取侧枝的花蕾,但一定要选取距主花序最近的侧枝；

4)如果遇到阴雨天气，为了不影响实验进程也可以取材，但一定要选取生长良好的花序，因为有研究报道低温有利于小孢子胚的发生(尽量避免雨天取样)。

2.选蕾

在实验室选取长度为2.5-3.5的花蕾，如果是侧枝，则花蕾的长度要稍大一点，即3.0-4mm(选蕾时最好用刻度尺量取长度)。在选蕾时要注意看清楚花蕾是否有被小虫啃噬的现象，如有，则丢弃该花序，以防污染。

注意：

1)甘蓝型油菜花序一般选取大小在2.5～3.5mm之间的花蕾，但是不同的油菜品种花蕾的发育时期不尽相同，可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定恰当发育时期(最佳时期为单核靠边期)；

2)取蕾以后如果不能立刻进行小孢子的提取过程的话，应将花蕾放置于4度暗室保存)。

3.灭菌

选取的花蕾用75％的酒精消毒30-40s，然后用升汞消毒10min,最后用无菌水清洗3次，每次5min。

4.抽提花粉

1)将灭菌的花蕾40个放置于玻璃管中，加入1-2滴B5液体培养液，用玻璃棒研磨使花粉散出，研磨至糊状，在管中加入半吸管B5,倒入过滤器过滤，花粉滤液盛入10ml离心管；

2)用滴管吸B5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉，冲2-3次后，在10ml离心管中将花粉悬浮液稀释；

3)将花粉悬浮液离心，800转/min，离心5min；

4)将离心管中的上层清液吸去，再加液体B5抽提液，并将沉淀的花粉用吸管冲散，再次悬浮离心(用封口膜封口)，800转/min，离心5min，吸去上清液；

5.加倍培养

1)将沉淀的花粉用含有15mg/L秋水仙碱的NLN-16液体培养基稀释(注：稀释不要超过15ml,因为加倍完以后还要在15ml的离心管中再次稀释离心)，倒入三角瓶在32℃条件下暗培养2天左右(48h-72h之间)；

2)2天后检查是否有污染的现象，如果没有污染，则分皿继续培养；

6.胚诱导培养

1)将加倍后没有污染的NLN-16花粉悬浮液再次倒入玻璃离心管中离心，600转/min，离心5min，倒掉NLN-16液体，留下沉淀的花粉；

2)将沉淀的花粉用含有7.5mg/L秋水仙碱的NLN-13培养液稀释到15ml，稀释后的悬浮液分装入直径9cm的培养皿中，一般每皿加入悬浮液5ml左右，每ml含花蕾大约1.5-2个，用7.5mg/L秋水仙碱NLN-13补充到终体积为25ml，用封口膜封皿；

3)将封口的培养皿在25℃的条件下进行暗培养15天，之后将悬浮培养液用NLN-13培养基稀释2倍，分装到新的直径9cm的培养皿中，大概10天左右开始查看是否有可见的白色颗粒状胚的形成，如果没有则继续培养，如果有可见的胚出现，则移至室内恒温摇床上转速设置50rpm、在25℃环境下进行暗培养，直至胚继续生长。

7.再生苗培养阶段

1)将暗培养获得子叶形胚移入B5固体培养基，于20℃，16hr光/8hr暗，2000LUX光强条件下培养，进行再生苗的诱导；如果暗培养中所得的低质量胚如球形胚、心形胚，用滴管吸取转移到B5固体培养基上，加入仅仅覆盖胚状体的浅层液体NLN-13培养基在同上光温条件下培养；

2)进行再生苗诱导培养的胚一般15天左右换一次培养基进行继代培养，具体的时间依据胚在培养基中的生长状态决定，继代1-2次直至长出再生植株(第一次培养胚时，培养基应在25ml左右，一般15天左右换一次培养基进行继代培养，以提高成苗率)；

3)长出的再生植株继续在B5固体培养基上培养，依据生长状态定期进行继代。

8.成苗移栽

获得的再生苗一般在10月中旬开始移栽到大田，移栽时先要洗尽根部的培养基，在0.1％秋水仙碱溶液中浸泡4-6小时后移栽到穴盘中，立刻浇足定根水，用遮阳网覆盖，一般白天覆盖，晚上打开，直至移栽的再生苗成活，然后按照一般的大田管理进行管理。

注意事项：

1)移栽之前田地不要漫灌，防止田地过湿，否则不利于起苗；

2)种植密度不要过高，防止后期因生长竞争引起的开花现象；

3)苗活稳后，要及时松土，可防止土壤板结问题，也利于苗的成长；

4)移栽的前几天一定要保持田间湿润，但田地不要太湿。

上述方法中涉及到的各培养基配方如下：

1)B5-13液体培养基(1000ml)

调节PH值5.85-5.9，定容至1000ml，高温灭菌。

2)NLN-13培养基(1000ml)

调节PH值5.85-5.9，定容至1000ml后0.22μmol抽滤除菌。

(3)NLN-16培养基(1000ml)

调节PH值5.85-5.9，定容至1000ml后0.22μmol抽滤除菌。

(4)加入15mg/L秋水仙碱NLN-16培养基(1000ml)

调节PH值5.85-5.9，定容至1000ml后0.22μmol抽滤除菌。

(5)加入7.5mg/L秋水仙碱NLN-13培养基(1000ml)

调节PH值5.85-5.9，定容至1000ml后0.22μmol抽滤除菌。

(6)固体B5-3培养基

调节PH值5.85-5.9，定容至1000ml后高温灭菌。

上述培养基中，涉及到的各母液配方如表1所示。

表1油菜小孢子培养的各种母液配方

作为对照，用85mg/L秋水仙碱处理花粉2天然后转入培养皿进行后续培养，与在小孢子胚诱导发生过程中加入15mg/L秋水仙碱，在处理2周后转移到含有7.5mg/L秋水仙碱的悬浮培养基中持续到出胚阶段的处理方式进行出胚率和加倍率的比较，对比结果如表2所示，从表2可以看出采用本申请提供的方法所处理材料的出胚率相比85mg/L秋水仙碱处理2天的出胚率提高了20％-50％，并且所得植株的加倍率也提高了10％-30％，说明低浓度的秋水仙碱持续处理小孢子细胞既能够促进胚诱导发生又能够提高成苗植株的加倍率。

表2不同秋水仙碱浓度和处理方法对出胚率和加倍率的作用

进一步的，对低质量非子叶胚的培养方法进行对比，在其余条件相同的情况下，将非子叶胚进行B5单层固体培养基培养，与本申请中将非子叶胚进行NLN13(液体)-B5固体双层培养基培养方式形成对比，观察一次成苗率的差异，具体结果如表3所示。

表3 NLN13(液体)-B5(固体)双层培养基提高非子叶胚的一次成苗率

从表3可见，外对非子叶胚进行NLN13(液体)-B5固体双层培养基培养，相比B5单层固体培养基培养能够有效提高一次成苗率。

实施例2

本实施例提供了一种油菜小孢子高效培养方法，其步骤与实施例1基本相同，区别在于：

加倍培养过程如下：

1)将沉淀的花粉用含有16mg/L秋水仙碱的NLN-16液体培养基稀释(注：稀释不要超过10ml,因为加倍完以后还要在10ml的离心管中再次稀释离心)，倒入三角瓶在31.5℃条件下暗培养60h；

2)60h后检查是否有污染的现象，如果没有污染，则分皿继续培养；

胚诱导培养过程如下：

1)将加倍后没有污染的NLN-16花粉悬浮液再次倒入离心管中离心，800转/min，离心5min，倒掉NLN-16液体，留下沉淀的花粉；

2)将沉淀的花粉用含有7mg/L秋水仙碱的NLN-13培养液稀释，稀释后的悬浮液分装入直径9cm的培养皿中，一般每皿加入悬浮液5ml左右，每ml含花蕾大约1.5-2个，用封口膜封皿；

3)将封口的培养皿在24℃的条件下进行暗培养16天，之后将悬浮培养液用NLN-13培养基稀释2倍，分装到新的直径9cm的培养皿中，大概10天左右开始查看是否有可见的白色颗粒状胚的形成，如果没有则继续培养，如果有可见的胚出现，则移至恒温摇床上转速设置50rpm、在25℃环境下进行暗培养，直至胚继续生长。

采用上述方法所处理材料的出胚率及加倍率与实施例1基本一致。

实施例3

本实施例提供了一种油菜小孢子高效培养方法，其步骤与实施例1基本相同，区别在于：

加倍培养过程如下：

1)将沉淀的花粉用含有14mg/L秋水仙碱的NLN-16液体培养基稀释(注：稀释不要超过10ml,因为加倍完以后还要在10ml的离心管中再次稀释离心)，倒入三角瓶在32.5℃条件下暗培养55h；

2)55h后检查是否有污染的现象，如果没有污染，则分皿继续培养；

胚诱导培养过程如下：

1)将加倍后没有污染的NLN-16花粉悬浮液再次倒入离心管中离心，800转/min，离心5min，倒掉NLN-16液体，留下沉淀的花粉；

2)将沉淀的花粉用含有8mg/L秋水仙碱的NLN-13培养液稀释，稀释后的悬浮液分装入直径9cm的培养皿中，一般每皿加入悬浮液5ml左右，每ml含花蕾大约1.5-2个，用封口膜封皿；

3)将封口的培养皿在26℃的条件下进行暗培养14天，之后将悬浮培养液用NLN-13培养基稀释2倍，分装到新的直径9cm的培养皿中，大概10天左右开始查看是否有可见的白色颗粒状胚的形成，如果没有则继续培养，如果有可见的胚出现，则移至恒温摇床上转速设置50rpm、在25℃环境下进行暗培养，直至胚继续生长。

采用上述方法所处理材料的出胚率及加倍率与实施例1基本一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种油菜小孢子高效培养方法，其特征在于：步骤包括：

S1、取材、选蕾：选取生长良好的油菜花序中处于单核靠边期的花蕾，灭菌，抽提花粉；

S2、加倍培养：花粉用含有14～16mg/L秋水仙碱的NLN-16液体培养基稀释后在31.5-32.5℃条件下暗培养48h-72h；

S3、胚诱导培养：将加倍培养后没有污染的NLN-16花粉悬浮液离心，留下沉淀的花粉用含有7～8mg/L秋水仙碱的NLN-13培养液稀释至每毫升溶液含花蕾1.5～2个，稀释后的悬浮液分装入培养皿中，培养皿封口后在24～26℃的条件下进行暗培养14～16天，将悬浮培养液用NLN-13培养基稀释2倍至秋水仙碱浓度为3.5～4mg/L；分装到新的培养皿中，培养9-11天后查看是否有可见的白色颗粒状胚的形成，无可见胚形成则继续培养，有可见胚形成则将可见胚移至恒温摇床上进行暗培养，直至胚继续生长；

S4、再生苗培养：将步骤S3所得的胚移入培养基进行再生苗诱导，13～17天换一次培养基进行继代培养，继代培养1～2次至长出再生苗；

将步骤S3所得的子叶形胚移入B5固体培养基进行再生苗诱导，将步骤S3所得的非子叶形胚转移到B5固体培养基上，并加入仅覆盖胚状体的浅层液体NLN-13培养基，然后进行再生苗诱导；

S5、成苗移栽：洗净再生苗根部的培养基后，用秋水仙碱溶液浸根，然后进行移栽；所述用秋水仙碱溶液浸根为采用质量浓度0.1％的秋水仙碱溶液浸泡4～6小时。

2.如权利要求1所述的油菜小孢子高效培养方法，其特征在于：步骤S4所述再生苗诱导为：于20℃，16hr光/8hr暗，2000LUX光强条件下培养，进行再生苗的诱导。

3.如权利要求1所述的油菜小孢子高效培养方法，其特征在于：步骤S3中，恒温摇床上进行暗培养的条件为转速50rpm、在25℃环境下进行暗培养直至胚继续生长。

4.如权利要求1所述的油菜小孢子高效培养方法，其特征在于：步骤S1所述生长良好的油菜花序为主枝花序或距主花序最近的侧枝花序。

5.如权利要求4所述的油菜小孢子高效培养方法，其特征在于：步骤S1所述花蕾选取长度为2.5～4mm的花蕾，其中，主枝花序上的花蕾选取长度为2.5～3.5mm的花蕾，侧枝花序上的花蕾选取长度为3.0～4mm的花蕾。

6.如权利要求1所述的油菜小孢子高效培养方法，其特征在于：步骤S1所述灭菌步骤包括：将花蕾用75％的酒精消毒30-40s，然后用升汞消毒10min,最后用无菌水清洗3次，每次5min。

7.如权利要求1所述的油菜小孢子高效培养方法，其特征在于：步骤S1所述抽提花粉步骤包括：向灭菌后的花粉中加入B5液体培养基，研磨使花粉散出，继续加入B5液体培养基，将花粉悬浮，悬浮液通过300目滤布过滤，用滤液冲洗花粉，将花粉悬浮液稀释后离心，弃上清液，得到沉淀的花粉。

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