CN109937876A

CN109937876A - 一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法

Info

Publication number: CN109937876A
Application number: CN201910220015.1A
Authority: CN
Inventors: 李英; 张西林; 侯喜林; 王建军; 刘同坤; 肖栋
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2019-06-28

Abstract

本发明公开了一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法。一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法，包括：(1)采集花蕾；(2)培育小孢子胚胎：将步骤(1)采集的花蕾消毒清洗、润洗；将润洗后的花蕾研磨，过滤，离心，黄绿色沉淀用添加1号培养基稀释，进行热激处理，24‑26℃暗培养14‑16天，形成胚状体；1号培养基为添加0.04～0.08mg/L6‑BA、10～20mg/L抗坏血酸和1mg/mL活性炭的NLN‑13培养基；(3)成熟胚萌发成植株。本发明所述方法在能够保证出胚率的情况下，简化操作步骤，大大减少了操作时间，提高了植株生产效率。

Description

一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法

技术领域

本发明属于组培领域，涉及一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法。

背景技术

小白菜主要是异花授粉植物，在传统育种工作中，需要得到纯化亲本只能通过常规自交，由于自交衰退，纯合亲本的选育就是一个非常困难的问题，并且用时长，耗费人力以及财力，育种效率很低。小孢子培养技术是利用细胞全能性，将单个细胞培养成纯合植株的过程，能够有效的缩短育种年限，很短的时间内就可获得大量的纯合植株，大大的提高了育种效率。lichter1982年首次在甘蓝型油菜上发现，利用小孢子培养技术可以获得胚状体，从此芸薹属蔬菜小孢子培养方面不断取得新的进展，目前在芸薹属青花菜、大白菜、甘蓝、不结球白菜等品种上都取得了成功。在我国，这项技术相对起步比较迟，主要是在借鉴国外的知识上，迅猛发展起来的，1993年曹鸣庆首次成功利用游离小孢子培养技术培育出了胚状体，后来这项技术在我国快速发展，在芸薹属的许多品种中都取得了突破性的进展，并且在芸薹属的青花菜、芥蓝、花椰菜中获得了小孢子再生植株。但目前该技术出胚率低，且污染问题较为严重。

不结球白菜难以鉴定其倍性，因为其从苗期到花期没有明显的形态学特征，尽管在花期单倍体会产生发育不良的花或者败育的花粉，部分四倍体株型较大或有较大的花，但是二倍体和四倍体依然难以区分。因此,长期以来都是通过显微观察来鉴定个体的染色体倍性,主要方法有花粉粒大小判别法、根尖染色体计数法、气孔保卫细胞叶绿体计数法、保卫细胞长度测量法等。这些方法费时费力且不准确。

流式细胞术(flow cytomertry,FCM)是20世纪70年代发展起来的一项技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,可以定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某种特异蛋白的含量,以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞数量。流式细胞术不受植物取材部位和细胞所处时期的限制,制样简单,灵敏度、分辨率及准确性较高,数据的可重复性好,测试速度快,适合于样品较多的倍性检测分析。目前流式细胞术已经普遍应用于植物基因组大小或者植物倍性研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法。

本发明的另一目的是提供一种不结球白菜小孢子植株倍性鉴定方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

本发明采取的技术方案：

一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法，具体包括如下步骤

(1)花蕾的选取：选取花瓣与花药长度比为1:1的花蕾；

(2)培育小孢子胚胎：将步骤(1)采集的花蕾消毒清洗后用1/2NLN-13培养基润洗；将润洗后的花蕾充分研磨，过滤，离心，黄绿色沉淀用添加1号培养基稀释，分装到培养皿中热激处理，24-26℃暗培养14-16天，形成胚状体；所述的1号培养基为添加0.04～0.08mg/L6-BA、10～20mg/L抗坏血酸和1mg/mL活性炭的NLN-13培养基；

(3)成熟胚萌发成植株：将胚状体至于1号培养基中进行振荡培养，将其中转绿的成熟胚转移到固体2号培养基中培育38-50d，直接进行炼苗移栽；所述的固体2号培养基为添加0.02mg/L NAA、2mg/L 6-BA、3％蔗糖和1.2％琼脂的1/2MS培养基。

本发明步骤(1)中1号培养基优选添加0.08mg/L6-BA、20mg/L抗坏血酸和1mg/mL活性炭的NLN-13培养基。

本发明步骤(1)中选取花瓣与花药长度比约为1:1的花蕾，上述选取花瓣与花药比值接近1:1这一时期的花蕾，处在单核期和单核靠边期的细胞最多，选用该时期的花蕾，出胚率高。优选的取材时间为早晨9点到11点进行样品的采集，此时外界环境温度低，植物水分含量高，花粉活力强，将选取的花蕾，添加蒸馏水放入4℃冰箱中，尽可能保持花粉活性。

本发明步骤(2)选用次氯酸钠溶液为消毒液，所述次氯酸钠溶液质量浓度为1％，可通过以下方法制备所得：倒取5.6％次氯酸钠溶液2mL，用蒸馏水定容到11.2mL。

本发明步骤(2)选用NLN-13培养基。

本发明步骤(2)充分研磨可选用磨样机，例如型号为：德国IKA控制型试管分散机S025；过滤可选用细胞过滤器，细胞过滤器的的直径优选为直径24mm，孔径为40μm。

本发明步骤(2)中黄绿色沉淀优选稀释至细胞数为10⁵个mL。

本发明步骤(2)中热激处理具体为32-34℃热激处理1-2天；热激处理、暗培养和振荡培养所用培养基均为含有0.08mg/L6-BA、20mg/L抗坏血酸和1mg/mL的活性炭的NLN-13培养基。发明人发现选用含有0.08mg/L6-BA、20mg/L抗坏血酸和1mg/mL的活性炭的NLN-13培养基，活性炭的存在能够有效的吸附细胞生长过程中代谢的有害物质，6-BA能够促进芽的形成,也可以诱导愈伤组织发生，抗坏血酸能够提高抗氧化能力，从而促进胚状体的形成。三者协同，能显著提高出胚率。

本发明步骤(3)中2号培养基，通过以下方法制备所得：常规1/2MS培养基中+0.02mg/L NAA+2mg/L 6-BA+3％蔗糖+1.2％琼脂，该培养基能够简单有效，只需要一次转胚就可获得根系健壮，植株健壮的组培苗，并且玻璃化及褐化较少。

一种不结球白菜小孢子植株倍性鉴定方法，包括：

(1)取样提取及染色：取其鲜嫩叶片，加入提取液，高通量组织磨样器研磨，过滤，离心，弃上清液染色，静置15min；所述的提取液配方为：10mmol/L MgSO4·7H₂O、50mmol/LKCl、5mmol/L HEPES、0.25％(v/v)Triton X-100和1％的PVP，调其pH至8.0，4℃保存；所述的染色液配方为：10mmol/L MgSO4·7H₂O、50mmol/L KCl、5mmol/L HEPES、0.25％(v/v)Triton X-100、0.4mg/ml碘化丙啶(PI)和0.04mg/ml RNase，现配现用；

(2)流式细胞仪倍性分析：采用美国Beckman Coulter公司生产的CytoFLEX型号的流式细胞仪；以普通白菜2n＝20为对照，二倍体2C峰在150附近，4C峰在300附近，待测植株2C峰在150附近，4C峰在300附近视为二倍体，2C峰在75附近，4C峰在150附近视为单倍体，2C峰在300附近，4C峰在600附近视为四倍体。

其中，步骤(1)中研磨选用高通量研磨机(SCIENTZ-48)，60Hz，3min，解决了传统手工切叶片费时费工、研磨效果差的问题。

步骤(1)中鲜嫩叶片为50-200mg，洁净无病虫害；每个样品中加入1-1.5ml提取液。过滤选用细胞过滤器，所述细胞过滤器的直径优选为直径24mm，孔径为40μm；离心选用离心机，转速及时间为5000r/min、5min。

步骤(2)中上机检测选用美国Beckman Coulter公司生产的CytoFLEX型号的流式细胞仪进行检测。

有益效果：与现在小孢子培养及倍性鉴定技术比较，本发明的优点：

本方法主要是在原步骤上进行优化，发明出一种高效简洁的方法，该方法主要在以下两方面进行了改进：1.6-BA和AsA对小孢子出胚率影响较高，添加0.08mg/L6-BA、20mg/L抗坏血酸能够较大幅度提高出胚率。2.选用高通量组织磨样器进行磨样可在保证鉴定效果的前提下，简化操作步骤，批量进行研磨，大大减少操作时间，提高试验效率。

附图说明

图1为不同品种小孢子出胚情况；

图2为振荡培养3天；

图3为在固体培养基上培养6天；

图4为在固体培养基上培养18天；

图5为在固体培养基上培养30天；

图6为在固体培养基上培养50天；

图7为6-BA及抗坏血酸处理对‘NHCC-224’品种小孢子出胚率的对比图；A图为CK：不加6-BA和AsA；B图为添加0.08mg/L6-BA、20mg/L抗坏血酸

图8为单倍体的峰值图；

图9为二倍体的峰值图；

图10为四倍体的峰值图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

1、花蕾的选取：于早晨9点到11点进行样品的采集，选取花瓣与花药比值接近1:1的花蕾(约为2-3mm)，添加少量蒸馏水保存在4℃冰箱。

2、培育小孢子胚胎：将采集好的样品放入到2ml的离心管中，用1％次氯酸钠直接加入进行消毒20分钟，用灭菌水清洗2次，各5分钟，最后一次用1/2NLN-13进行润洗。把清洗好的样品转移到磨样机(德国IKA控制型试管分散机S025)的试管中，加入少量1/2NLN-13，进行磨样，使样品充分研磨。准备好50mL的离心管，在其上方放置40μm的细胞过滤塞过滤，离心，倒去上清液，再加入1/2NLN-13震荡摇匀，再离心，倒掉上清，留下黄绿色沉淀。然给后试管中加入少量的1号培养基，稀释至细胞数为10⁵个每mL。分装到直径为3.5cm的培养皿中，用封口膜进行封口。进行32.5℃1天热激处理，拿出来后放到25℃环境中进行暗培养15天。

3、成熟胚萌发成植株：暗培养15天后，将胚状体放在弱光、25℃、60r/min的摇床上进行振荡培养，把其中转绿的成熟胚转移到固体2号培养基(常规1/2MS培养基中添加0.02mg/L NAA、添加2mg/L 6-BA、添加1％活性炭、添加3％蔗糖、添加1.2％琼脂)中进行培养，培育40d后，植株长成根系健壮，3-5片真叶时即可直接进行炼苗移栽。

本实施例中，热激处理、暗培养和振荡培养所用的培养基均为含有0.08mg/L的6-BA、20mg/L的抗坏血酸和1mg/mL的活性炭的NLN-13培养基(即1号培养基)。如图2为振荡培养3天的小孢子胚图。

实施例2：不同品种不结球白菜小孢子的培养

选取14个不同品种(快菜、五月慢、NHCC-224、苏州青×矮脚黄、NHCC-074、NHCC-072、大丰菜、NHCC-003、NHCC-068、NHCC-088、二青、NHCC-073、如皋黑塌菜、NHCC-063)采用实施例1所述方法进行小孢子培养试验，统计他们的出胚率，比对该发明对小孢子出胚率的影响。其中‘快菜’、‘NHCC-224’、‘NHCC-074’、‘大丰菜’、‘NHCC-068’、‘二青’为易出胚品种，‘如皋黑塌菜’、‘五月慢’、‘苏州青×矮脚黄’为可出胚品种，‘NHCC-072’、‘NHCC-003’、‘NHCC-088’、‘NHCC-073’、‘NHCC-063’为不易出胚品种。如图1，如对比出胚结果，在选取的14个品种中，出胚率达到了100％，其中5个不易出胚品种全都出胚，并且易出胚品种‘快菜’及‘NHCC-224’分别达到了26.8胚/ml、12.9胚/ml。

实施例3：6-BA和抗坏血酸对不结球白菜小孢子出胚率的影响

选取了出胚率高的‘NHCC-224’，进行了6-BA及抗坏血酸对小孢子出胚率的研究，如表1，分为四种情况，对照、只添加6-BA、只添加抗坏血酸、以及同时添加6-BA和抗坏血酸，对比结果可以发现，什么都没添加时，两个品种的出胚率都很不高，分别添加6-BA及20mg/L或30mg/L的抗坏血酸后，都对出胚率有不同程度的提高，添加大于30mg/L的抗坏血酸会抑制出胚；而同时添加6-BA及20mg/L或30mg/L的抗坏血酸后，出胚率又有所提高，而又以添加0.08mg/L6-BA、20mg/L抗坏血酸为最高出胚率，比对照的高出将近一倍。图7是品种‘NHCC-224’对照(NLN-13)与品种‘NHCC-224’同时添加0.08mg/L6-BA、20mg/L抗坏血酸后，对比出胚情况图。

表1 不同浓度的6-BA和AsA对‘NHCC-224’出胚率的影响

实施例4：流式细胞法倍性鉴定

取通过实施例3得到的‘NHCC-224’小孢子再生植株空白对照株的鲜嫩叶50-200mg，用纸擦干净，加入pH为8.0的提取液A，其配比为10mmol/L MgSO4·7H₂O、50mmol/LKCl、5mmol/L HEPES、0.25％(v/v)Triton X-100和1％的PVP；用高通量组织研磨器研磨(SCIENTZ-48)，60Hz，3min,；用直径24mm，孔径为40μm细胞过滤器过滤；离心，5000r/min,5min,弃上清液,重复一次；用提取液B染色，其配比为10mmol/L MgSO4·7H₂O、50mmol/LKCl、5mmol/L HEPES、0.25％(v/v)Triton X-100、0.4mg/ml碘化丙啶(PI)和0.04mg/mlRNase，现配现用，静置15min；采用美国Beckman Coulter公司生产的CytoFLEX型号的流式细胞仪，以普通白菜2n＝20为对照，二倍体2C峰在150附近，4C峰在300附近，待测植株2C峰在150附近，4C峰在300附近视为二倍体，2C峰在75附近，4C峰在150附近视为单倍体，2C峰在300附近，4C峰在600附近视为四倍体。图八九十分别为单倍体、二倍体、四倍体。

表2 实施例4所述方法操作时间与传统操作时间对比

传统操作步骤	操作时间(min)	改良操作步骤	操作时间(min)
				取样	20	取样	20
研磨(48个样品)	144	研磨(48个样品)	3
				过滤离心	20	过滤离心	20
染色	15	染色	15
				总时间	209	总时间	58

本实施例在研磨阶段采用了高通量组织研磨器(SCIENTZ-48)进行研磨，对比传统人工手动冰上切片，用研磨器可同时对48个待测样品进行研磨，极大地减少了工作时间，既可批量研磨又节省了大量人力物力，提高了实验效率。

表3 ‘NHCC-224’流式细胞仪倍性鉴定结果

品种	株数	单倍体	二倍体	四倍体	加倍率
						NHCC-224	61	17	34	10	72％

Claims

1.一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法，其特征在于具体包括如下步骤

(1)花蕾的选取：选取花瓣与花药长度比为1:1的花蕾；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中1号培养基为添加0.08mg/L6-BA、20mg/L抗坏血酸和1mg/mL活性炭的NLN-13培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中选用质量浓度为1％的次氯酸钠溶液对花蕾进行消毒。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)过滤选用细胞过滤器；所述细胞过滤器的直径优选为直径24mm，孔径为40μm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中黄绿色沉淀用1号培养基稀释至细胞数为10⁵个每毫升。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中每个培养皿分装2ml，热激处理条件为32-34℃热激处理1-2天。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中热激处理和暗培养所用的培养基为含有0.08mg/L6-BA、20mg/L抗坏血酸和1mg/mL的活性炭的NLN-13培养基。

8.一种不结球白菜小孢子植株倍性鉴定方法，其特征在于包括：

(1)取样提取及染色：取其鲜嫩叶片，加入提取液，高通量组织磨样器研磨，过滤，离心，弃上清液染色，静置15min；所述的提取液配方为：10mmol/L MgSO4·7H₂O、50mmol/L KCl、5mmol/L HEPES、0.25％(v/v)Triton X-100和1％的PVP，调其pH至8.0，4℃保存；所述的染色液配方为：10mmol/L MgSO4·7H₂O、50mmol/L KCl、5mmol/L HEPES、0.25％(v/v)TritonX-100、0.4mg/ml碘化丙啶(PI)和0.04mg/ml RNase，现配现用；

9.根据权利要求8所述的不结球白菜小孢子植株倍性鉴定方法，其特征在于步骤(1)中鲜嫩叶片为50-200mg，洁净无病虫害；每个样品中加入1-1.5ml提取液。

10.根据权利要求8所述的不结球白菜小孢子植株倍性鉴定方法，其特征在于磨样选用高通量组织磨样器SCIENTZ-48，60Hz，3min；过滤选用细胞过滤器，所述细胞过滤器的直径优选为直径24mm，孔径为40μm；离心选用离心机，转速及时间为5000r/min、5min。