CN102524066A - 获得青蒿单倍体植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得青蒿单倍体植株的方法，该方法通过分离小孢子发育时期处于单核晚期的青蒿花药，依次通过愈伤诱导、愈伤分化和生根培养获得青蒿花培植株。之后通过流式细胞术检测所获得的青蒿花培植株的遗传物质倍性，结果显示通过本发明所述方法可以获得单倍体青蒿植株。本发明填补了青蒿单倍体育种领域的技术空白，为青蒿纯系育种平台的构建和以单倍体青蒿为材料的如单倍体转基因技术等实验的开展奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种获得青蒿单倍体植株的方法。
背景技术
青蒿(Artemisia annua L.)为菊科蒿属一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其植株地上部分提取的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前最有效的治疗疟疾的药物。世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法。随着近年来对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家还发现青蒿素及其衍生物具有抗血吸虫、抗炎、抗肿瘤以及免疫调节等功能，是一种极具潜力的天然药物。
目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成青蒿素的难度大，产量低，成本高，不具备可行性。因此，通过传统育种和基因工程育种手段培育青蒿素高产品系具有重要的实际应用价值。
青蒿为严重自交不亲和植物，因此高产植株很难通过自交等传统育种手段在短期内获得纯合品系。通过转基因技术，如过量表达青蒿素合成途径上的关键酶基因亦可以有效提高青蒿素含量，但是这同样面临由于自交不亲和导致的高产性状无法在转基因后代中稳定遗传的难题。
通过花药培养培育单倍体进而通过施用秋水仙素等染色体加倍剂使染色体倍性恢复到正常水平是育种学家经常采用且技术相对较为成熟的手段。该技术自上世纪50年代以来已被广泛地应用于很多植物，包括蔬菜、花卉和粮食作物。
基于青蒿的自交不亲和性，对于性状优良、青蒿素含量高的青蒿植株，通过花药培养培育成单倍体，然后采用染色体加倍剂使单倍体青蒿植株染色体恢复到正常水平进而培育成纯合品系是青蒿育种的一个优良方法，通过该方法可以在较短时间内培育出青蒿素含量高的青蒿纯合品系。然而，到目前为止，国内外还没有关于通过花药培养培育青蒿单倍体植株的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服目前尚无培育青蒿单倍体植株方法的现状，提供一种通过花药培养培育青蒿单倍体植株的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明提供了一种获得青蒿单倍体植株的方法包括如下步骤：
(1)选取青蒿花药中小孢子发育处于单核期的青蒿花蕾；
(2)采集小孢子处于单核晚期的花蕾，消毒后将花药分离出来接种于愈伤诱导培养基上，黑暗培养一段时间后继续见光培养；
(3)将步骤(2)长出的愈伤组织转移至愈伤分化培养基培养至分化出芽；
(4)将分化出芽的健壮小苗转移至生根培养基进行生根培养；
(5)将生根后的茁壮幼嫩青蒿苗移出培养灌，移栽入土；
(6)对步骤(5)获得的花培植株进行倍性鉴定，筛选出单倍体青蒿植株。
优选地，步骤(1)所述小孢子发育时期为单核晚期，即单核靠边期。
优选地，步骤(2)所述花药接种密度为10～50枚/皿，更优选地为30枚/皿。
优选地，步骤(2)所述黑暗培养为25℃下黑暗培养15～50天，更为优选地，为15～30天。
优选地，步骤(2)所述见光培养的条件为：温度为25℃、光照强度为2000lx、光照周期为16/8(光照/黑暗时间比)；所述见光培养的时间为5～15天，更为优选地，为5～10天。
优选地，步骤(2)所述愈伤诱导培养基为MS+6-BA+NAA，其中，6-BA(6-苄氨基嘌呤)浓度优选为0.5～1.5mg/L，更优选地为1.0mg/L；NAA(萘乙酸)浓度优选为0.1～0.8mg/L，更优选地为0.3mg/L。
优选地，步骤(3)所述愈伤分化培养基为MS+6-BA+NAA，其中，6-BA浓度优选为1.0～4.0mg/L，更优选地为4.0mg/L；NAA浓度优选为0.01～0.1mg/L，更优选地为0.05mg/L。
优选地，步骤(4)所述生根培养基为1/2MS+NAA，其中，NAA浓度优选为0～1.0mg/L，更优选地为0.5mg/L。
优选地，步骤(6)所述倍性鉴定方法为流式细胞法。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：首次实现了通过花药培养培育出青蒿花培植株，并从其中鉴定出了单倍体青蒿苗，填补了青蒿单倍体育种领域的技术空白，为青蒿纯系育种平台的构建以及以青蒿单倍体为材料的如单倍体转基因技术等实验的开展奠定了基础。
附图说明
图1为青蒿小孢子发育时期鉴定图；其中，(a)为四分体时期小孢子；(b)为单核期小孢子；
图2为青蒿花培植株通过流式细胞术鉴定倍性的结果图；其中，(a)为对照正常二倍体植株，(b)为检测到的单倍体青蒿花培植株。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规技术条件。
实施例1
第一步、青蒿小孢子发育时期的鉴定
当青蒿进入生殖生长期后，在短日照条件刺激下即进入开花周期。选取直径在1～2cm的花蕾，在解剖镜下用医用解剖镊(产品编号WA3030，购于上海医疗器械有限公司)分离出花药，置于载玻片上，用传统压片染色方法制片镜检，染色剂采用醋酸洋红，鉴定出小孢子发育时期，选取发育处于单核晚期即单核靠边期的青蒿花药。镜检结果如图1所示：其中，(a)显示小孢子发育处于四分体时期，在该时期，由同一个小孢子母细胞通过减数分裂形成的四个小孢子被共同的胼胝质壁包围在一起；(b)显示小孢子发育处于单核期，在四分体时期的小孢子经过一段时间的发育之后，包被在其外面的胼胝质壁逐渐溶解，四个小孢子从里面游离出来，即进入单核期，单核期小孢子的体积相比较之前的四分体时期迅速增大，并形成一定形状和厚度的壁。
第二步、青蒿花药的分离接种
通过镜检观察后根据结果选取发育处于单核晚期的青蒿花蕾，采集后置于2.0mL离心管，在超净台上完成分离和接种操作，包括如下步骤：
(1)将花药分离和接种整个过程中用到的所有器械放入超净台紫外杀菌30min，包括解剖镜、医用解剖镊(产品编号WA3030，购于上海医疗器械有限公司)、针灸针(市售可得，规格为0.25mm×40mm)等。
(2)用70％乙醇对花蕾进行外部消毒1min，接着用15％次氯酸钠对花蕾进行外部消毒10min，最后用灭菌水清洗花蕾5次。
(3)将经步骤(2)消毒过的花蕾置于解剖镜下方，用解剖镊分离出花蕾内部的花。青蒿有两种花，包括排列于花蕾外轮的单性花(雌性花)和排列于内部的数轮两性花(包括雌蕊和雄蕊)。用解剖镊继续割裂分离出的两性花，将其内部的花药剥离出来。
(4)将分离出来的青蒿花药用针灸针挑起接种于愈伤诱导培养基上，接种密度为每皿30枚左右。培养基配方为MS+1.0mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA，装于90mm常规培养皿。
第三步、愈伤诱导和分化培养
将第二步中接种过花药后的培养皿置于25℃下黑暗培养20天，以诱导出愈伤，之后进行见光培养，培养条件为25℃、光照强度为2000lx、光照周期为16/8(光照/黑暗时间比)，见光培养时间为7天。之后将白色稍泛绿色的胚性愈伤转移至愈伤分化培养基进行分化培养。愈伤分化培养基装于90mm常规培养皿，培养基配方为MS+4.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA，培养条件同愈伤诱导见光培养的条件。愈伤分化培养时间为25天。
第四步、生根壮苗
愈伤分化后，剪取茁壮嫩芽接种于生根培养基。生根培养基装于150mL三角瓶，每瓶盛装50mL，培养基配方为1/2MS+0.5mg/L NAA。生根培养20天后，将再生的花培植株移入珍珠岩炼苗3天。
炼苗后将健康幼嫩的青蒿花培植株移栽入土。花培植株移栽入土后施以常规水分和养料，培养45天后，即可采用流式细胞术对花培植株进行倍性鉴定。
第五步、花培植株倍性检测
本实施例采用流式细胞术对所得花培植株进行倍性鉴定，该方法快捷灵敏，已被广泛应用于植物的倍性鉴定。
流式细胞术的检测原理为：当植株细胞的细胞核携带有荧光素标记物，并通过激光照射区时，将受激光激发，产生代表细胞核内不同物质、不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度与细胞核的DNA含量成正比。荧光信号经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，最后即可通过计算机输出结果判定被检测细胞的DNA含量。
流式细胞法的检测方法为：
(1)配制实验所需溶液，包括MgSO4缓冲液、提取液A和提取液B。
MgSO4缓冲液：0.246g(10mM)MgSO4·7H2O+0.370g(50mM)KCl+0.120g(5mM)HEPES(准确称取HEPES1.1915g，加入ddH2O定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存)。以ddH2O定容至100mL，调pH至8.0。
提取液A：MgSO4缓冲液中附加1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-30，贮藏于4℃中备用；
提取液B：MgSO4缓冲液附加0.40mg/mL碘化丙锭(propidium iodide，PI)和0.04mg/mL RNase(DNase free)，现配现用。配制DNase free的RNA酶时，将RNA酶A溶于10mM Tris·HCl(pH 7.5)、15mMNaCl中，配成10mg/mL的溶液，于100℃中加热15min，缓慢冷却至室温后分装成小份，保存于-20℃冰箱中。
(2)样品制备
剪取幼嫩青蒿叶片放入培养皿中，加入1mL的提取液A，在培养皿里用锋利的刀片快速将其切碎，对照和花培植株均做一份。溶液用200目尼龙布过滤至1.5mL离心管中，以1000rpm的转速离心5min，弃去上清液至0.1mL刻度处；再加入1mL提取液A于沉淀中，充分混匀，以1000rpm的转速离心5min，弃去上清液至0.1刻度处(重复三次)。加入500μL提取液B，以锡箔纸包住离心管以避光保存，充分混匀后于37℃染色30min。
(3)倍性检测
步骤(2)染色后即可进行上样检测。将对照和花培植株样本进行流式细胞仪检测并通过与之连接的电脑软件BD FACS Calibur Software Package分析检测结果，绘制成图。结果如图2所示：其中，(a)为对照正常二倍体植株流式细胞术检测结果图，图中结果显示在200通道处有单峰；(b)为单倍体花培植株流式细胞术检测结果图，图中结果显示在100通道处有单峰。结果显示，本实施例的方法通过花药培养获得了青蒿单倍体植株。
实施例2
本实施例同实施例1，所不同之处在于：
第二步的步骤(4)中，所述接种密度为10枚/皿；所述愈伤诱导培养基配方为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA；
第三步中，所述接种过花药后的培养皿是置于25℃下黑暗培养15天；所述见光培养时间为5天；所述愈伤分化培养基配方为MS+1.0mg/L6-BA+0.01mg/L NAA。
第四步中，所述生根培养基配方为1/2MS。
实施例3
本实施例同实施例1，所不同之处在于：
第二步的步骤(4)中，所述接种密度为20枚/皿；所述愈伤诱导培养基配方为MS+0.8mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA；
第三步中，所述接种过花药后的培养皿是置于25℃下黑暗培养30天；所述见光培养时间为10天；所述愈伤分化培养基配方为MS+2.0mg/L6-BA+0.08mg/L NAA。
第四步中，所述生根培养基配方为1/2MS+0.8mg/L NAA。
实施例4
本实施例同实施例1，所不同之处在于：
第二步的步骤(4)中，所述接种密度为50枚/皿；所述愈伤诱导培养基配方为MS+1.5mg/L6-BA+0.8mg/L NAA；
第三步中，所述接种过花药后的培养皿是置于25℃下黑暗培养50天；所述见光培养时间为15天；所述愈伤分化培养基配方为MS+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。
第四步中，所述生根培养基配方为1/2MS+1.0mg/L NAA。
综上所述，本发明首次实现了通过花药培养培育出青蒿花培植株，并从其中鉴定出了单倍体青蒿苗，填补了青蒿单倍体育种领域的技术空白，为青蒿纯系育种平台的构建以及以青蒿单倍体为材料的如单倍体转基因技术等实验的开展奠定了基础。
Claims (10)
1.一种获得青蒿单倍体植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取青蒿花药中小孢子发育处于单核期的青蒿花蕾；
(2)采集小孢子发育处于单核晚期的花蕾，消毒后将花药分离出来接种于愈伤诱导培养基上，黑暗培养，之后见光培养；
(3)将步骤(2)长出的愈伤组织转移至愈伤分化培养基培养至分化出芽；
(4)将分化出芽的健壮小苗转移至生根培养基进行生根培养；
(5)将生根后的茁壮幼嫩青蒿苗移出培养灌，移栽入土；
(6)对步骤(5)获得的花培植株进行倍性鉴定，筛选出单倍体青蒿植株。
2.如权利要求1所述的获得青蒿单倍体植株的方法，其特征在于，步骤(1)所述的小孢子发育时期为单核晚期，即单核靠边期。
3.如权利要求1所述的获得青蒿单倍体植株的方法，其特征在于，步骤(2)所述花药接种密度为10～50枚/皿。
4.如权利要求3所述的获得青蒿单倍体植株的方法，其特征在于，所述花药接种密度为30枚/皿。
5.如权利要求1所述的获得青蒿单倍体植株的方法，其特征在于，步骤(2)所述黑暗培养具体为在25℃下黑暗培养15～50天。
6.如权利要求1所述的获得青蒿单倍体植株的方法，其特征在于，步骤(2)所述见光培养的条件为：温度为25℃、光照强度为2000lx、光照周期为光照/黑暗时间比是16/8；所述见光培养的时间为5～15天。
7.如权利要求1所述的获得青蒿单倍体植株的方法，其特征在于，步骤(2)所述愈伤诱导培养基为MS+6-BA+NAA，其中6-BA浓度为0.5～1.5mg/L，NAA浓度为0.1～0.8mg/L。
8.如权利要求1所述的获得青蒿单倍体植株的方法，其特征在于，步骤(3)所述愈伤分化培养基为MS+6-BA+NAA，其中6-BA浓度为1.0～4.0mg/L，NAA浓度为0.01～0.1mg/L。
9.如权利要求1所述的获得青蒿单倍体植株的方法，其特征在于，步骤(4)所述生根培养基为1/2MS+NAA，其中NAA浓度为0～1.0mg/L。
10.如权利要求1所述的获得青蒿单倍体植株的方法，其特征在于，步骤(6)所述倍性鉴定方法为流式细胞法。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109937876A (zh) * | 2019-03-22 | 2019-06-28 | 南京农业大学 | 一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法 |
| CN113892431A (zh) * | 2021-11-20 | 2022-01-07 | 上海市农业生物基因中心 | 一种通过组织培养获得生菜单倍体植株的方法 |
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- 2011-12-20 CN CN2011104308060A patent/CN102524066A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 伍晓丽等: "青蒿花药培养研究", 《时珍国医国药》 * |
| 施 波等: "青蒿茎段愈伤组织的诱导及植株再生", 《湖北民族学院学报(自然科学版)》 * |
| 穆胜玉等: "青蒿组织培养体系建立的研究", 《重庆科技学院学报( 自然科学版)》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109937876A (zh) * | 2019-03-22 | 2019-06-28 | 南京农业大学 | 一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法 |
| CN113892431A (zh) * | 2021-11-20 | 2022-01-07 | 上海市农业生物基因中心 | 一种通过组织培养获得生菜单倍体植株的方法 |
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