CN110506635A

CN110506635A - 一种万寿菊花粉诱导培养基及诱导培养方法

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Publication number: CN110506635A
Application number: CN201910941149.2A
Authority: CN
Inventors: 李传传
Original assignee: Individual
Current assignee: China Science And Technology Research Institute Hubei Co ltd
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2019-11-29
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: CN110506635B

Abstract

本发明提供了一种万寿菊花粉诱导培养基，该培养基由一定浓度的大量元素、微量元素、Na₂‑EDTA、FeSO₄·7H₂O、肌醇、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、叶酸、5’‑单磷酸腺苷、色氨酸、脯氨酸、水解干酪素、玉米冷浸液、没食子酸、6‑BA、2,4‑D、头孢噻胯、硝普钠、胰岛素、DMSO及麦芽糖配制而成。本发明还提供了一种万寿菊花粉诱导培养方法，包括以下步骤：花蕾采集、花蕾预处理、小孢子分离以及诱导培养。本发明显著提高了万寿菊花粉小孢子愈伤诱导效率，建立了万寿菊小孢子诱导培养体系，为今后万寿菊单倍体育种的开展奠定基础。

Description

一种万寿菊花粉诱导培养基及诱导培养方法

技术领域

本发明属于花卉培育技术领域，具体涉及一种万寿菊花粉诱导培养基及诱导培养方法。

背景技术

万寿菊（Tagetes erecta L.）又名臭芙蓉、万寿灯、蜂窝菊、臭菊花，为菊科万寿菊属草本植物，原产墨西哥及美洲地区。万寿菊为一年生花卉，其茎杆直立，粗壮而光滑，常具褐色纵纹及沟槽；叶对生或互生，羽状全裂，裂片披针形，叶缘有数个油腺点；头状花序顶生，具长总梗，中空；花径5~13cm，总苞钟状；舌状花有长爪，边缘常皱曲；花色有乳白、黄、橙、桔红色至复色等深浅不一；花期5~10月，果熟期9~10月。万寿菊栽培品种多，花期长，花色艳丽，花型紧凑，并且较耐早霜、耐半荫、耐移植、抗性强、病虫害较少，国内自20世纪80年代开始引进万寿菊，规模化发展很快，现已成为我国主要栽培的园林绿化花卉之一，常用来点缀花坛、广场、布置花丛、花境和培植花篱。中、矮生品种适宜作花坛、花径、花丛材料，也可作盆栽；植株较高的品种可作为背景材料或切花。万寿菊是常见叶黄素来源植物中含量最高的，从万寿菊花瓣中提取的叶黄素属纯天然色素，无毒副作用，具有色泽鲜艳、着色力强、耐光、耐热、耐酸碱等特性，广泛应用于饲料添加剂、食品添加剂、医药、工业染料、水产品等行业。此外，万寿菊还具有有效的杀虫、抑菌作用，植株对氟化氢、二氧化硫等气体有较强的抗性和吸收作用。万寿菊叶、花均可入药，有清热化痰、补血通经、祛瘀生血的功效，主治感冒咳嗽、腮腺炎、乳腺炎、眼痛、牙痛等病症。

目前，国内市场上的主流万寿菊品种均来自国外。国外万寿菊品种综合性状优良，但是价格昂贵；相比之下，国产品种价格低，但存在整齐度、观赏性和抗逆性差的问题。因此，培育具有中国自主知识产权、综合性状优良的万寿菊新品种，提高国产万寿菊品种市场竞争力，对中国万寿菊产业发展至关重要。然而国内对万寿菊的研究落后于国外，尤其是在育种方面还有很大的差距。目前杂交育种是万寿菊的主要育种方法，杂交育种的关键是获得优良的纯系，对于自花授粉的植物可以通过逐代自交获得稳定的纯系，但是万寿菊是异花授粉植物，用传统的方法获得较为纯合的材料需要较长时间，并且程序复杂，因此育种进展较为缓慢。

由于现代生物技术育种的快速发展，近年来单倍体育种日益受到广大育种工作者的重视。单倍体育种是指利用某种植物组织培养技术进行诱导产生单倍体植株。单倍体植株在植物遗传分析和育种工作中具有显著作用，尤其是对控制杂交后代形状分类和缩短育种周期上的作用更为明显，在花卉苗木育种工作中具有很好的应用前景。单倍体属于具有配子染色体的个体。高等植物孢子体中二倍体的含量较多，单倍体仅占1套染色体，但是仅有的单倍体含量却是进行基因、生理、胚胎和遗传等问题研究的重要材料。单倍体还具有基因染色体单一，不存在隐性关系的优势。针对单倍体的研究很容易发现优良的隐性性状，这对于育种材料的选择具有很大的作用。在使用 F1 进行合体配子制造出的单倍体植株，单倍体植株通过加倍之后单倍体和双单倍体自交之后不会分离，在很大程度上缩短育种周期。此外单倍体育种还能够与传统的杂交育种、诱变育种、远源杂交育种以及转基因技术相结合，形成一整套实用、高效的育种技术体系。

尽管单倍体植株表现出良好的育种效果，但是自然界产生单倍体的频率一般是很低的，仅在0.002~0.02%之间，阻碍了其在育种实践中的广泛应用。随着植物组织培养技术的发展，植物细胞具有全能性得到了广泛证实，因此，采用人工诱导方式进行雌、雄配子的离体培养为大量生产单倍体提供了有效的手段。在现有技术中，花药和花粉培养是获得单倍体的主要途径，具有快速稳定杂种性状、缩短育种年限、提高育种选择效率等优点。花药培养是把整个花药接种到培养基上，在离体培养条件下，促使其小孢子诱导形成单倍体植株，属于组织培养的范畴。在花药培养的基础上发展起了花粉培养技术，也叫游离小孢子培养，是指不经过任何形式的花药预培养，直接从花蕾或花药中获得游离的、新鲜的小孢子群体而进行培养的方法，属于细胞培养的范畴。花药培养比花粉培养要求的技术相对简单，但由于花药壁等体细胞组织的影响，花培植株不仅来自花粉，也来自花药的药壁药隔等其他部分，结果得到的是不同倍性水平的混杂群体。而花粉培养就可以克服这个困难。同时，花粉培养还有一些其他的优点：小孢子是真正的单倍体细胞培养系统，是研究雄核发育、胚胎发生机制的理想材料；由于花粉能均匀的接触化学和物理的诱变因素，是研究吸收、转化和诱变的理想材料；另外，还能从每个花药里获得更多的单倍体植株。

尽管花粉培养技术有很多优势，但是由于存在愈伤组织或胚状体诱导率低、绿苗分化率低或白苗化现象等问题，导致花粉培养技术还不能够有效地应用于育种和遗传研究。在花粉培养中，材料的基因型是决定出胚（愈）率高低的重要因素，它主要体现在两方面，第一是基因型的反应范围，不同种的植物，对花培的反应差异显著，如十字花科植物易经花培诱导产生单倍体植株，而菊科植物则较难；同一种内的不同品种、不同来源的材料又有区别。此外，影响花粉培养效率的因素还有供体植株的生长状态、花粉小孢子发育时期、培养前预处理、培养条件和培养基的组成及成分等等。培养基是花粉培养的物质基础，培养基组分对花粉的刺激和启动，是花粉能否诱导成功以及再分化的最关键的因素。培养基组分通常包括大量元素、微量元素、有机附加物、碳源、生长调节剂等，此外在培养基中添加一些特殊的附加物也可能对花粉培养的效率有直接影响。

利用花粉培养产生单倍体植株的方法已经在许多具有经济价值和观赏价值的植物上取得了成功，其中十字花科植物是迄今为止愈伤组织或胚状体诱导成功并长成植株最多的科属，这可能是由于十字花科植物基因对诱导响应能力较强，同时也与人们对十字花科蔬菜作物育种较为重视有关。而菊科植物基因在花粉培养方面可能具有顽拗性，导致其愈伤组织或胚状体产生较为困难。就万寿菊而言，关于其花药培养的研究已有报道，但是存在着诱导频率和分化成苗率低的问题。有些品种虽有获得单倍体植株的报道，但其诱导率极低，可重复性差，很难利用。此外由于花药壁、花药隔、花丝等二倍体细胞的干扰，获得的花培植株中单倍体率极低。而关于万寿菊花粉培养的研究还未见报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种万寿菊花粉诱导培养基及诱导培养方法，采用该方法能成功诱导花粉小孢子形成愈伤组织，为建立万寿菊花粉培养再生体系，加快万寿菊的育种进程奠定基础。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

一种万寿菊花粉诱导培养基，其特征在于，所述培养基依据以下配方配制而成：KNO₃1500-1700mg/L，NH₄NO₃550-650mg/L，KCl 280-320mg/L，KH₂PO₄ 160-180mg/L，CaCl₂·2H₂O442-460mg/L，MgSO₄·7H₂O 139-147mg/L，H₃BO₃ 3.0-3.4mg/L，KI 0.7-0.9mg/L，MnSO₄·4H₂O 9.6-10.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.7-2.3mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O0.02-0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg/L，Na₂-EDTA 35.8-37.6mg/L，FeSO₄·7H₂O27.4-28.2mg/L，肌醇90-110mg/L，盐酸吡哆醇0.4-0.6mg/L，盐酸硫胺素0.9-1.1mg/L，叶酸1.0-1.5mg/L，5’-单磷酸腺苷3.8-4.4mg/L，色氨酸1.5-2.5mg/L，脯氨酸2.0-3.0mg/L，水解干酪素400-450mg/L，玉米冷浸液26-34ml/L，没食子酸5.0-7.0mg/L，6-BA 1.8-2.2mg/L，2,4-D 0.9-1.1mg/L，头孢噻胯37-43mg/L，硝普钠45-55μmol/L，胰岛素1.8-2.2mg/L，DMSO19-23mg/L，麦芽糖70-80g/L。

所述培养基为液体培养基，其pH值为5.6-6.0。

所述培养基中玉米冷浸液的制备方法为：称取新鲜玉米粒400g，用研钵研碎，加入600ml生理盐水，浸泡4h，用双层纱布过滤，将滤液在4000r/min条件下离心处理20min，取上清液备用。

一种万寿菊花粉诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）花蕾采集：将万寿菊播种育苗，进入初花期后取材，选择生长健康的万寿菊作为供体植株，在晴天上午9:00-10:00采集小孢子发育时期处于单核靠边期的花蕾用于试验；

2）花蕾预处理：将花蕾用湿纱布包好，外面包裹一层塑料膜保湿，置于4℃冰箱低温处理2d；再将花蕾置于甘露醇提取液中预处理3d；

3）小孢子分离：将预处理后的花蕾进行消毒，然后将花蕾置于试管中，加入 15mL甘露醇提取液，用高速分散器超速旋切，把旋切好的悬浮液，用400目筛网过滤，滤液以700r/min、5min低速离心，重复3次，收集小孢子；

4）诱导培养：将小孢子悬浮于适量的诱导培养基中，用血球计数器调整小孢子密度，然后将悬浮液分装到直径60mm的培养皿中，每皿3mL，用封口膜封口，在24~26℃、黑暗条件下进行液体浅层静置培养。

所述步骤1）中采集的花蕾为：长度为2.3~3.0cm，花蕾纵径/横径之比为2.25~2.45，花药为黄色，小孢子基本上处于单核靠边期。

所述步骤2）中甘露醇提取液的成分为：甘露醇60g/L，CaCl₂1.2g/L，MES 1.0g/L，pH 值为5.6-6.0。

所述步骤3）中花蕾消毒的方法为：先用清水清洗花蕾3次，再将其放入由0.1%HgCl₂+0.1%吐温20配成的消毒液中浸泡8~10min，同时用玻璃棒轻轻搅动，然后滤去消毒液，再用无菌水冲洗3次。

所述步骤4）中小孢子密度为1×10⁵~2×10⁵个/ml。

本发明具有如下技术优势：

1、本发明明确了万寿菊花蕾的预处理方法，采用4℃低温处理2d结合甘露醇预处理3d的方法，能够改善花粉的生理状态，延缓花粉退化，提高内源激素的水平，有利于小孢子适应离体后的培养环境，促使大部分的小孢子得以正常生长，从而提高愈伤组织产量。

2、本发明的诱导培养基配方调整了部分大量元素、微量元素的浓度，使其更适合于万寿菊小孢子的诱导培养；除了添加常规生长调节剂6-BA、2,4-D进行组合以外，还添加了适宜浓度的叶酸、5’-单磷酸腺苷、色氨酸、脯氨酸、水解干酪素、玉米冷浸液、没食子酸、头孢噻胯、硝普钠、胰岛素、DMSO，以麦芽糖作为碳源，该培养基配方是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，能够有效提高万寿菊小孢子愈伤组织产量，达到提高万寿菊花粉培养效率的目的。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种万寿菊花粉诱导培养方法，包括以下步骤：

1）花蕾采集：以‘安提瓜’和‘发现’两个品种万寿菊作为供试材料，将万寿菊播种育苗，进入初花期后取材，选择生长健康的万寿菊作为供体植株，在晴天上午9:00-10:00采集长度为2.3~3.0cm，花蕾纵径/横径之比为2.25~2.45，花药为黄色的花蕾，此时花蕾中小孢子基本上处于单核靠边期。

2）花蕾预处理：将花蕾用湿纱布包好，外面包裹一层塑料膜保湿，置于4℃冰箱低温处理2d；再将花蕾置于甘露醇提取液中预处理3d，甘露醇提取液的成分为：甘露醇60g/L，CaCl₂1.2g/L，MES 1.0g/L，pH 值为5.8。

3）小孢子分离：将预处理后的花蕾先用清水清洗花蕾3次，再将其放入由0.1%HgCl₂+0.1%吐温20配成的消毒液中浸泡8~10min，同时用玻璃棒轻轻搅动，然后滤去消毒液，再用无菌水冲洗3次；然后将花蕾置于试管中，加入15mL甘露醇提取液，用高速分散器超速旋切，把旋切好的悬浮液，用400目筛网过滤，滤液以700r/min、5min低速离心，重复3次，收集小孢子。

4）诱导培养：将小孢子悬浮于适量的诱导培养基中，用血球计数器调整小孢子密度为1×10⁵~2×10⁵个/ml，然后将悬浮液分装到直径60mm的培养皿中，每皿3mL，用封口膜封口，在25℃、黑暗条件下进行液体浅层静置培养，培养45d后吸尽培养皿中的培养液，用电子天平测定愈伤组织重量，单位为mg/皿。

诱导培养基的配方为：KNO₃1600mg/L，NH₄NO₃600mg/L，KH₂PO₄ 170mg/L，CaCl₂·2H₂O 451mg/L，KCl 300mg/L，MgSO₄·7H₂O 143mg/L，H₃BO₃ 3.2mg/L，KI 0.8mg/L，MnSO₄·4H₂O 10.0mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，Na₂-EDTA36.7mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，肌醇100mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，叶酸1.25mg/L，5’-单磷酸腺苷4.1mg/L，色氨酸2.0mg/L，脯氨酸2.5mg/L，水解干酪素425mg/L，玉米冷浸液30ml/L，没食子酸6.0mg/L，6-BA2.0mg/L，2,4-D 1.0mg/L，头孢噻胯40mg/L，硝普钠50μmol/L，胰岛素2.0mg/L，DMSO 21mg/L，麦芽糖75g/L，pH值为5.8；其中玉米冷浸液的制备方法为：称取新鲜玉米粒400g，用研钵研碎，加入600ml生理盐水，浸泡4h，用双层纱布过滤，将滤液在4000r/min条件下离心处理20min，取上清液备用。

对比例1：甘露醇预处理时间对万寿菊花粉愈伤组织诱导的影响

相对于实施例1，更改了甘露醇预处理时间，具体如下：将采集的花蕾用湿纱布包好，外面包裹一层塑料膜保湿，置于4℃冰箱低温处理2d；再将花蕾置于甘露醇提取液中预处理0d、1d、2d、4d，然后分别分离出小孢子，进行诱导培养，结果见下表1。

甘露醇预处理是诱导花粉小孢子从正常的配子体发育途径转向孢子体发育途径的有效处理之一，其作用机理一是给小孢子提供了一个良好的渗透胁迫环境促进细胞内各物质的代谢，二是给小孢子适当的营养饥饿促进其脱分化。从表1可以看出，甘露醇预处理时间对万寿菊小孢子愈伤组织产量有着十分明显的影响。没有经过甘露醇预处理时，两种材料的小孢子诱导出的愈伤组织产量均为最低，而经过甘露醇预处理1~4d的小孢子愈伤组织产量均有所提高，其中预处理3d的效果最好，安提瓜愈伤组织产量可达95.54mg/皿，发现愈伤组织产量可达73.25mg/皿，可见甘露醇预处理促进了万寿菊小孢子的胚胎发生，使小孢子由配子体发育途径转向孢子体发育途径，促进了愈伤组织的形成。

对比例2：硝普钠对万寿菊花粉愈伤组织诱导的影响

相对于实施例1，更改了诱导培养基的配方，具体如下：将诱导培养基中的硝普钠浓度分别改为0μmol/L、25μmol/L、100μmol/L、200μmol/L，其余成分与实施例1相同，采用这些诱导培养基对两种材料的小孢子进行诱导培养，结果见下表2。

硝普钠可以作为外源NO供体。NO是一种普遍存在于生物体内的信号分子，能够调节植物的生长发育，并参与植物体对各种生物和非生物胁迫反应的信息传递，也有学者认为NO是一种有别于传统激素的植物生长调节剂。从表2可以看出，硝普钠对万寿菊小孢子愈伤组织产量有着十分明显的影响，且呈现明显的浓度效应。与不加硝普钠相比，添加低浓度的硝普钠（25、50、100μmol/L），其愈伤组织产量均有所提高，说明对愈伤组织的形成具有显著的促进作用；而添加高浓度的硝普钠（200μmol/L），其愈伤组织产量有所降低，说明对愈伤组织的形成具有抑制作用。当硝普钠浓度为50μmol/L时，两种材料的愈伤组织产量均达到最大。

对比例3：胰岛素对万寿菊花粉愈伤组织诱导的影响

相对于实施例1，更改了诱导培养基的配方，具体如下：将诱导培养基中的胰岛素浓度分别改为0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L，其余成分与实施例1相同，采用这些诱导培养基对两种材料的小孢子进行诱导培养，结果见下表3。

从表3可以看出，随着胰岛素浓度的增加，万寿菊小孢子愈伤组织产量呈现出先升后降的趋势。在胰岛素浓度为2.0mg/L时，两种材料的愈伤组织产量最高，即安提瓜愈伤组织产量为95.54mg/皿，发现愈伤组织产量为73.25mg/皿，当胰岛素浓度升至6.0mg/L时，两种材料的愈伤组织产量分别下降为41.15mg/皿和31.70mg/皿，与不添加胰岛素时的愈伤组织产量接近，说明高浓度的胰岛素不利于万寿菊小孢子愈伤组织的诱导。胰岛素是动物蛋白类激素，在动物组织培养中应用较为广泛。我们尝试将胰岛素添加到诱导培养基中，发现一定浓度的胰岛素对万寿菊小孢子愈伤组织的诱导具有促进作用，可以提高愈伤组织产量，并且作用效果较为显著。

对比例4：头孢噻胯对万寿菊花粉愈伤组织诱导的影响

相对于实施例1，更改了诱导培养基的配方，具体如下：将诱导培养基中的头孢噻胯浓度分别改为0mg/L、20mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L，其余成分与实施例1相同，采用这些诱导培养基对两种材料的小孢子进行诱导培养，结果见下表4。

从表4可以看出，在诱导培养基中加入20~100mg/L的头孢噻胯，愈伤组织产量均有所提高，说明对万寿菊小孢子胚胎发生具有促进作用，并且当头孢噻胯浓度为40mg/L时，两种材料的愈伤组织产量均达到最大。头孢噻胯是一种对真核生物毒性较低的头孢菌抗生素，添加在培养基中可以控制细菌污染。此外，在我们的研究中发现头孢噻胯还表现出似生长素活性，能够促进体细胞胚胎发生，因此对万寿菊小孢子愈伤组织的诱导也具有促进作用。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种万寿菊花粉诱导培养基，其特征在于，所述培养基依据以下配方配制而成：KNO₃1500-1700mg/L，NH₄NO₃550-650mg/L，KCl 280-320mg/L，KH₂PO₄ 160-180mg/L，CaCl₂·2H₂O442-460mg/L，MgSO₄·7H₂O 139-147mg/L，H₃BO₃ 3.0-3.4mg/L，KI 0.7-0.9mg/L，MnSO₄·4H₂O 9.6-10.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.7-2.3mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O0.02-0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg/L，Na₂-EDTA 35.8-37.6mg/L，FeSO₄·7H₂O27.4-28.2mg/L，肌醇90-110mg/L，盐酸吡哆醇0.4-0.6mg/L，盐酸硫胺素0.9-1.1mg/L，叶酸1.0-1.5mg/L，5’-单磷酸腺苷3.8-4.4mg/L，色氨酸1.5-2.5mg/L，脯氨酸2.0-3.0mg/L，水解干酪素400-450mg/L，玉米冷浸液26-34ml/L，没食子酸5.0-7.0mg/L，6-BA 1.8-2.2mg/L，2,4-D 0.9-1.1mg/L，头孢噻胯37-43mg/L，硝普钠45-55μmol/L，胰岛素1.8-2.2mg/L，DMSO19-23mg/L，麦芽糖70-80g/L。

2.根据权利要求1所述的一种万寿菊花粉诱导培养基，其特征在于，所述培养基为液体培养基，其pH值为5.6-6.0。

3.根据权利要求1所述的一种万寿菊花粉诱导培养基，其特征在于，所述培养基中玉米冷浸液的制备方法为：称取新鲜玉米粒400g，用研钵研碎，加入600ml生理盐水，浸泡4h，用双层纱布过滤，将滤液在4000r/min条件下离心处理20min，取上清液备用。

4.一种万寿菊花粉诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种万寿菊花粉诱导培养方法，其特征在于，所述步骤1）中采集的花蕾为：长度为2.3~3.0cm，花蕾纵径/横径之比为2.25~2.45，花药为黄色，小孢子基本上处于单核靠边期。

6.根据权利要求4所述的一种万寿菊花粉诱导培养方法，其特征在于，所述步骤2）中甘露醇提取液的成分为：甘露醇60g/L，CaCl₂1.2g/L，MES 1.0g/L，pH 值为5.6-6.0。

7.根据权利要求4所述的一种万寿菊花粉诱导培养方法，其特征在于，所述步骤3）中花蕾消毒的方法为：先用清水清洗花蕾3次，再将其放入由0.1%HgCl₂+0.1%吐温20配成的消毒液中浸泡8~10min，同时用玻璃棒轻轻搅动，然后滤去消毒液，再用无菌水冲洗3次。

8.根据权利要求4所述的一种万寿菊花粉诱导培养方法，其特征在于，所述步骤4）中小孢子密度为1×10⁵~2×10⁵个/ml。