CN109220782A - 一种黄瓜枯萎病抗性育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黄瓜枯萎病抗性育种方法，该育种方法的步骤包括：S1选择育种主干亲本和抗源亲本；S2杂交育种；S3制备粗毒素提取液；S4对黄瓜育种主干亲本和抗源亲本分别进行花药诱导培养；S5确定粗毒素筛选浓度；S6杂种F1代花药培养；S7花培幼苗生根后移栽；S8枯萎病抗性鉴定与后代筛选。本发明将杂交育种和单倍体育种技术结合起来，显著提高了黄瓜枯萎病抗性育种效率，缩短了育种年限，育成的黄瓜枯萎病抗性新品系不仅抗性好，而且农艺性状优良，在保证产量的同时可以减少农药的施用量，降低环境污染，是一种快速选育黄瓜枯萎病抗性新品种的有效途径。

Description

一种黄瓜枯萎病抗性育种方法

技术领域

本发明属于蔬菜遗传育种和病害防治领域，具体涉及一种黄瓜枯萎病抗性育种方法。

背景技术

黄瓜（学名：Cucumis sativus L.）葫芦科一年生蔓生或攀援草本植物，原产于喜马拉雅山南麓的热带雨林地区，现广泛种植于温带和热带地区。黄瓜果实长圆形或圆柱形，熟时黄绿色，表面粗糙，食用口感清脆爽口，富含多种维生素和矿物质，既可以当做水果鲜食，也可以当做蔬菜凉拌、熟食、泡菜以及腌渍，广受人们喜爱。黄瓜是世界性的蔬菜作物，其栽培总面积仅次于番茄、甘蓝和洋葱，而我国黄瓜的栽培面积居世界各国之首，约占全球的三分之一。

随着我国国民经济的快速发展和人民生活水平的提高，黄瓜等蔬菜的市场需求不断扩大。为了满足黄瓜规模化和高产化的需要，生产上普遍存在着高复种指数及多年连作等弊端，并因此极易产生根结线虫、枯萎病、根腐病、白粉病等病虫害，其中枯萎病是黄瓜栽培特别是温室和保护地栽培中发生最普遍、危害性极高的一种土传病害，同时也是世界各国影响黄瓜产量的主要病害之一。

黄瓜枯萎病（Cucumber Fusarium Wit）又叫蔓割病、萎焉病，主要是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Owen）侵染所致，目前发现的病原菌分为4个生理小种，我国的黄瓜枯萎病病原菌为4号小种。有研究表明黄瓜枯萎病病原菌的致病机制是病原菌可以产生一种非特异性毒素，这种毒素可以破坏细胞质膜结构，致使细胞失去防卫机能，活力下降，不能吸收水分，从而造成植株萎蔫。黄瓜枯萎病在黄瓜整个生育期皆可发生，尤以开花结果期最为突出。发病初期多从近地面或根颈部的叶片开始，中午部分叶片萎焉下垂，早晚恢复正常，似缺水状，叶片变淡，渐变及全株最后枯死。病株到后期，茎基部表皮多纵裂，节部及节间出现黄褐色条斑，严重时易腐烂，极易从土中拔出。病菌多从开花雌花侵入、致花瓣腐烂，并长出灰淡褐色的霉层，进而向幼瓜扩展，致脐部呈水渍状，幼花迅速变软、萎缩、腐烂，表面密生霉层。黄瓜枯萎病的发病率一般为10-30%，严重时可达到 80-90%，而且病情来势猛，传播快，一般年份可使黄瓜减产25-35%，发病重的年份甚至造成绝产，给农民造成巨大损失。

黄瓜枯萎病的防治方法种类很多，主要有药剂防治、栽培防治、生物防治以及抗病育种等，我国目前采用的是前两者相结合的防治方法。药剂防治即利用农药来防治枯萎病，可以起到一定的防治效果，常见的药剂有广枯灵、立枯净、扑海因、枯萎灵和甲基托布津等。但是该方法也存在着一些弊端，一方面大量农药的使用不仅会污染环境，破坏生态平衡，而且农药残留问题也日益凸显，随着农药中有毒物质在植物体内的富集，可能对人身安全造成严重影响；另一方面随着农药的长期使用，病菌的抗药性也越来越强，农民不得不加大农药的用量，从而造成一个恶性循环。栽培防治的重要措施是轮作倒茬、水旱结合，但是轮作需要的时间年限较长，不利于满足市场需求。因此，为了减少病害，保证黄瓜的高产、稳产，人们一方面不断加强新型环保农药的研制，另一方面就是注重培育、选育抗病新品种。从理论上来说，进行黄瓜枯萎病抗性育种，培育出抗病新品种才是从根本上遏制枯萎病蔓延，促进黄瓜产业健康可持续发展的有效途径。

目前，抗病育种还没能在我国大面积推广，原因之一是传统的抗病育种方法是通过不断的杂交、自交、侧交、回交等实现基因重组，然后依据作物在田间的表现进行评价和选择，即通过表型间接对基因型进行选择，这要求有大量的育种经验和很长的育种时间，一般育成一个抗病新品种至少需要7年。因此，如何提高育种过程中的选择效率，缩短育种年限，是推广黄瓜抗病育种的关键问题。单倍体育种是现代生物技术育种手段之一，在育种上可以利用F1代杂交种花药、花粉或未受精的子房，通过离体培养获得单倍体材料经染色体加倍产生双单倍体，双单倍体（DH）具有完全纯合同质的特性并且是标准的自交系，因此通过单倍体育种不仅可以克服杂种性状的分离缩短育种年限，而且可以快速培育自交系，从而大大加快育种的进程。花药离体培养是人工诱导单倍体的最常用手段，也是单倍体育种的物质基础。自1974年西贞夫首先对黄瓜花药进行培养以来，国内外有关黄瓜花药培养的研究已有不少报道。在此基础上，本研发团队通过对黄瓜花药培养体系的优化，并结合黄瓜花药愈伤组织在分化过程中对枯萎病病菌粗毒素敏感的特点进行粗毒素筛选，极大地提高了筛选效率，成功开发出一种育种效率高、育种周期短的黄瓜枯萎病抗性育种方法，具有重要的实用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能提高黄瓜枯萎病抗性筛选效率、缩短抗病育种周期，从而加快黄瓜抗病育种进程的黄瓜枯萎病抗性育种方法。

本发明是通过以下技术流程实现的：

一种黄瓜枯萎病抗性育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1选择育种主干亲本和抗源亲本：选择当地主要栽培的农艺和产量性状优良但枯萎病抗性不足的黄瓜品种作为育种主干亲本，选择黄瓜种质资源库中经枯萎病抗性鉴定表现为高抗的黄瓜品种或家系作为枯萎病抗源亲本；正季种植黄瓜育种主干亲本和抗源亲本；

S2杂交育种：将步骤S1正季种植的黄瓜育种主干亲本和抗源亲本杂交，获得杂种F1代；

S3制备粗毒素提取液：将黄瓜枯萎病病原菌菌种转接在SDA培养基上，28℃恒温培养72h，挑取1个单菌落接种到100ml的PD液体培养基中，28℃摇床振荡培养5-7d获得菌培养液；将菌培养液通过双层无菌滤纸过滤除去菌丝体，然后用0.22μm微孔滤膜加压抽滤得无菌滤液，将滤液以6000r/min离心处理20min，取上清液即为粗毒素提取液，保存备用；

S4对黄瓜育种主干亲本和抗源亲本分别进行花药诱导培养：在初花期采集两个亲本进入单核靠边期的花蕾，将花蕾预处理后置于超净工作台上，先用75%酒精灭菌60s，用无菌水冲洗1-2次，再转入0.1% HgCl₂中，震荡处理 10min，用无菌水冲洗3-5次；冲洗干净后将花蕾平摊在干燥无菌的滤纸上吸干花蕾表面水分，用镊子剥取花药（不能携带花丝）接种于愈伤组织诱导培养基中，置于23-27℃的黑暗环境中培养28-35d分别诱导出愈伤组织；

S5确定粗毒素筛选压：预先制备好添加了梯度浓度粗毒素提取液的一系列花药分化培养基，然后将步骤S4中获得的黄瓜育种主干亲本和抗源亲本花药愈伤组织分别转接到上述分化培养基上进行培养，筛选出二者花药愈伤组织分化率均在1.5%-2.5%的分化培养基对应添加的粗毒素浓度，将两个粗毒素浓度的平均值作为黄瓜花药分化培养粗毒素筛选压；

S6杂种F1代花药培养：将杂种F1代的种子正季种植于大田，田间管理采取稀植点播，待植株进入初花期时，选取长势旺盛、健壮无病植株上的花药进行诱导培养，培养方法同步骤S4，将获得的愈伤组织转接到添加了枯萎病粗毒素筛压的分化培养基上进行培养，获得花培幼苗；

S7花培幼苗生根后移栽：待上述花培幼苗株高长至2-4cm后转接到生根培养基上培养26-34d，然后选择生长健壮、根系发育良好的花培苗在培养室内打开瓶口炼苗5-7d，然后移栽到温室中，在适宜的条件下进行常规栽培管理；

S8枯萎病抗性鉴定与后代筛选：将成熟的黄瓜花培苗进行单株收种获得不同花培家系，进一步大田种植，对其抗病性进行接种鉴定，筛选出枯萎病高抗且农艺和产量性状与育种主干亲本相近的单株，再经1-2 代系谱选择即获得黄瓜枯萎病抗性新品系。

所述步骤S3中粗毒素提取液的保存方法为将粗毒素提取液装在密闭容器中，置于冰箱4℃保存。

所述步骤S4中筛选进入单核靠边期花蕾的方法为：采取长度为0.9-1.5cm的闭合花蕾，进一步将花粉用醋酸洋红染色法压片、镜检，筛选出小孢子处于单核靠边期的花蕾。

所述步骤S4中花蕾预处理的方法为：先用自来水冲洗花蕾，再用蒸馏水冲洗2-3次，将其放入铺有湿润滤纸的培养皿上，将培养皿置于4℃冰箱里处理48h；期间每天喷水1次，始终保持花蕾及滤纸湿润。

所述步骤S4中愈伤组织诱导培养基的成分为：N6+半胱氨酸盐酸盐25mg/L+脯氨酸3.6mg/L+复肽核酸0.6mg/L+硝酸镧1.7mg/L+甜菜碱20mg/L+葡萄糖13g/L+硫酸二乙酯2.6mg/L+2，4-D 1.0mg/L+胺新脂0.1mg/L+亚精胺2.7mg/L+黄瓜汁54mL/L+迷迭香提取液33mL/L，pH值为5.8。

所述步骤S4与S6中未添加粗毒素的分化培养基的成分为：KNO₃2200mg/L，NH₄NO₃564mg/L，MgSO₄·7H₂O 280mg/L，NaH₂PO₄ 150mg/L，CaCl₂·2H₂O 255mg/L，MnSO₄·4H₂O22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 5.5mg/L，H₃BO₃ 6.4mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CoCl₂·6H₂O0.025mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L，Fe-Na₂EDTA 33.6mg/L，K₂Cr₂O₇ 0.019mg/L，肌醇85mg/L，烟酸1.4mg/L，甘氨酸2.0mg/L，色氨酸3.4mg/L，牛肉浸膏27mg/L，盐酸硫胺素0.3mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，泛酸1.2mg/L，姜黄素4.9mg/L，L-硒-甲基硒代半胱氨酸0.11mg/L，左旋肉碱5.5mg/L，迷迭香提取液33mL/L，腐殖酸40mg/L，6-BA2.0mg/L，康多酚 0.5mg/L，芸苔素内酯0.2mg/L，苯肽胺酸0.2mg/L，pH值为5.6~6.0；分化培养的条件为：温度23-27℃，光照强度1500-2000Lx，每天光照12-14h。

所述步骤S7中生根培养基的成分为：1/2MS +吲熟酯0.2mg/L+活性炭0.3g/L，pH值为5.6-6.0；生根培养的条件为：温度26-28℃，光照强度2400-2800Lx，每天光照14-16h。

所述步骤S7中适宜的条件是指白天温度控制在20-30℃，夜间温度控制在15-20℃，光照强度控制在2500-5000Lx，湿度控制在60-80%。

所述迷迭香提取液的制备方法为：将迷迭香植株放入蒸馏水中先煮沸0.5h，然后保持水温60-70℃提取2.5h，将汁液过滤除去固体残渣，再用无菌过滤器在超净工作台中过滤制成无菌提取液备用。

本发明的有益效果：

1）本发明通过对影响黄瓜花药培养因素的综合调控提高了黄瓜愈伤组织诱导率，并摸索出一种专门适用于在添加病原菌粗毒素条件下的黄瓜花药分化培养程序。

2）本发明利用黄瓜花药愈伤组织在分化过程中对枯萎病病菌粗毒素敏感的特点，首先采用含有梯度浓度病原菌粗毒素的分化培养基对黄瓜亲本愈伤组织进行粗毒素筛选，确定适宜的粗毒素筛选压，再对杂种F1代获得的花药愈伤组织进行粗毒素筛选压筛选，能极大地提高枯萎病抗性筛选效率，进而提高抗病育种的整体效率。

3）本发明的育种方法结合了单倍体育种技术，杂种F1代通过花药培养获得了纯合的花培家系，再经过进一步的枯萎病抗性鉴定与后代筛选，最终成功获得了黄瓜枯萎病抗性新品系，整个育种周期不到4年，与传统育种方法相比，显著缩短了黄瓜枯萎病抗性育种的周期，对推广黄瓜抗病育种具有重要的意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

实施例1

2011至2014年，按照本发明的技术方案进行黄瓜枯萎病抗性育种，具体包括以下步骤：

S1选择育种主干亲本和抗源亲本：2011年选择山东省寿光市主要栽培的黄瓜品种‘巨丰八号’作为育种主干亲本，‘巨丰八号’植株生长势强，叶片中等大小，以主蔓结瓜为主，结瓜连续性强，瓜条棒形顺直，瓜色深绿有光泽，果肉厚绿色，瓜把短，白刺，刺瘤适中，无棱，瓜长40cm左右，单瓜重200克左右，亩产20000公斤左右，但枯萎病抗性鉴定中表现为感病。选择黄瓜品种‘津联1号’作为枯萎病抗源亲本，该品种由天津亿联特黄瓜种子公司培育，枯萎病抗性鉴定中表现为高抗；正季播种种植黄瓜育种主干亲本和抗源亲本；

S2杂交育种：将步骤S1正季种植的黄瓜育种主干亲本和抗源亲本杂交，获得杂种F1代；

S3制备粗毒素提取液：将黄瓜枯萎病病原菌菌种转接在SDA培养基上，28℃恒温培养72h，挑取1个单菌落接种到100ml的PD液体培养基中，28℃摇床振荡培养5-7d获得菌培养液；将菌培养液通过双层无菌滤纸过滤除去菌丝体，然后用0.22μm微孔滤膜加压抽滤得无菌滤液，将滤液以6000r/min离心处理20min，取上清液即为粗毒素提取液，将粗毒素提取液装在密闭容器中，置于冰箱4℃保存备用；

S4对黄瓜育种主干亲本和抗源亲本分别进行花药诱导培养：在黄瓜初花期采集‘巨丰八号’和‘津联1号’长度为0.9-1.5cm的闭合花蕾，进一步将花粉用醋酸洋红染色法压片、镜检，筛选出小孢子处于单核靠边期的花蕾；将筛选出的花蕾先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗2-3次，将其放入铺有湿润滤纸的培养皿上，将培养皿置于4℃冰箱里预处理48h，期间每天喷水1次，始终保持花蕾及滤纸湿润；将预处理后的花蕾置于超净工作台上，先用75%酒精灭菌60s，用无菌水冲洗1-2次，再转入0.1% HgCl₂中，震荡处理 10min，用无菌水冲洗3-5次；冲洗干净后将花蕾平摊在干燥无菌的滤纸上吸干花蕾表面水分，用镊子剥取花药（不能携带花丝）接种于愈伤组织诱导培养基中（诱导培养基的成分为N6+半胱氨酸盐酸盐25mg/L+脯氨酸3.6mg/L+复肽核酸0.6mg/L+硝酸镧1.7mg/L+甜菜碱20mg/L+葡萄糖13g/L+硫酸二乙酯 2.6mg/L+2，4-D 1.0mg/L+胺新脂 0.1mg/L+亚精胺 2.7mg/L+黄瓜汁54mL/L+迷迭香提取液33mL/L，pH值为5.8），置于25℃的黑暗环境中培养32d，统计愈伤组织诱导率；

愈伤组织诱导培养基中迷迭香提取液的制备方法为：将迷迭香植株放入蒸馏水中先煮沸0.5h，然后保持水温60-70℃提取2.5h，将汁液过滤除去固体残渣，再用无菌过滤器在超净工作台中过滤制成无菌提取液备用；

S5确定粗毒素筛选压：按照以下成分制备分化培养基：KNO₃2200mg/L，NH₄NO₃ 564mg/L，MgSO₄·7H₂O 280mg/L，NaH₂PO₄ 150mg/L，CaCl₂·2H₂O 255mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 5.5mg/L，H₃BO₃ 6.4mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L，Fe-Na₂EDTA 33.6mg/L，K₂Cr₂O₇ 0.019mg/L，肌醇85mg/L，烟酸1.4mg/L，甘氨酸2.0mg/L，色氨酸3.4mg/L，牛肉浸膏27mg/L，盐酸硫胺素0.3mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，泛酸1.2mg/L，姜黄素4.9mg/L，L-硒-甲基硒代半胱氨酸0.11mg/L，迷迭香提取液33mL/L，腐殖酸40mg/L，6-BA2.0mg/L，康多酚 0.5mg/L，芸苔素内酯0.2mg/L，苯肽胺酸0.2mg/L，pH值为5.8，在分化培养基中分别加入浓度为0、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的粗毒素提取液，然后将步骤S2中获得的黄瓜育种主干亲本和抗源亲本花药愈伤组织分别转接到上述分化培养基上，置于温度25℃，光照强度1800Lx，每天光照13h的条件下进行培养，分别筛选出‘巨丰八号’和‘津优30号’花药愈伤组织分化率在1.5%-2.5%的分化培养基对应添加的粗毒素浓度，统计结果如下表2中实施例1；然后将两个粗毒素浓度的平均值6.75%作为黄瓜花药分化培养粗毒素筛选压；

S6杂种F1代花药培养：将杂种F1代的种子正季种植于大田，田间管理采取稀植点播，待植株进入初花期时，选取长势旺盛、健壮无病植株上的花药进行诱导培养，培养方法同步骤S4，将获得的愈伤组织转接到添加了枯萎病粗毒素筛选压的分化培养基上进行培养，获得花培幼苗；

S7花培幼苗生根后移栽：待上述花培幼苗株高长至2-4cm后转接到成分为生根培养基上（该培养基成分为1/2MS+吲熟酯0.2mg/L+活性炭0.3g/L，pH值为5.8），在温度27℃，光照强度2600Lx，每天光15h的条件下培养26-34d，然后选择生长健壮、根系发育良好的花培苗在培养室内打开瓶口炼苗5-7d，然后移栽到温室中，白天温度控制在20-30℃，夜间温度控制在15-20℃，光照强度控制在2500-5000Lx，湿度控制在60-80%，进行常规栽培管理；

S8枯萎病抗性鉴定与后代筛选：将成熟的黄瓜花培苗进行单株收种获得花培家系，进一步大田种植，对其抗病性进行接种鉴定，筛选出枯萎病高抗且农艺和产量性状与育种主干亲本即‘巨丰八号’相近的单株，再经1-2 代系谱选择最终获得黄瓜枯萎病抗性新品系。

实施例2

测试本发明步骤S2中诱导培养基对黄瓜2个亲本花药愈伤组织诱导效果的影响：仅将步骤S2中的诱导培养基替换为B5+0.25mg/L6-BA+1.0mg/L2, 4-D+1.0mg/L AgNO₃（来源于文献《黄瓜花药培养愈伤组织诱导及再生的研究》），统计愈伤组织诱导率，结果见下表1。

由表1结果可以看出，与实施例2相比，使用本发明的诱导培养基对‘巨丰八号’和‘津联1号’2个亲本的花药进行培养，能获得更高的诱导率；首先可能是黄瓜不同基因型间愈伤组织诱导率存在一定的差异，其次是本发明的诱导培养基添加了胺新脂、硝酸镧、硫酸二乙酯、半胱氨酸盐酸盐、甜菜碱、迷迭香提取液等能够提高诱导率以及抑制褐化的物质。

实施例3

测试本发明分化培养基在添加粗毒素的情况下，对黄瓜2个亲本愈伤组织分化效果的影响：仅将步骤S4中的分化培养基替换为B5+0.5mg/LNAA+1.5mg/LKT+1.0 mg/L AgNO₃（来源于文献《黄瓜花药培养愈伤组织诱导及再生的研究》），并添加相同浓度梯度的粗毒素提取液，统计愈伤组织分化率，统计结果与实施例1汇总，整合为下表2。

由表2结果可知，实施例1中‘巨丰八号’的花药愈伤组织分化率在1.5%-2.5%时，其分化培养基添加的粗毒素浓度约为5%，‘津联1号’的花药愈伤分化率在1.5%-2.5%时，其分化培养基添加的粗毒素浓度约为8.5%，取二者的平均值6.75%作为枯萎病粗毒素筛选压使用；实施例2中在添加了相同浓度粗毒素的条件下，‘巨丰八号’和‘津联1号’ 的花药愈伤组织分化率太低，无法满足试验的需求；比较实施例1与2，在没有添加粗毒素的条件下愈伤组织分化率差异不大，而添加了粗毒素后，愈伤组织分化率差异显著，说明本发明的分化培养基更适合于在有粗毒素的条件进行的黄瓜花药分化培养，原因可能是本发明的分化培养基中添加了色氨酸、姜黄素、L-硒-甲基硒代半胱氨酸、左旋肉碱、芸苔素内酯、康多酚、迷迭香提取液等物质，能够增强细胞活性，提高植物组织抗逆性。

实施例1中黄瓜花培苗进行单株收种获得花培家系92个，经过进一步枯萎病抗性鉴定与后代筛选，最终获得3个黄瓜枯萎病抗性新品系，进入后续的生产试验。

对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种黄瓜枯萎病抗性育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1选择育种主干亲本和抗源亲本：选择当地主要栽培的农艺和产量性状优良但枯萎病抗性不足的黄瓜品种作为育种主干亲本，选择黄瓜种质资源库中经枯萎病抗性鉴定表现为高抗的黄瓜品种或家系作为枯萎病抗源亲本；正季种植黄瓜育种主干亲本和抗源亲本；

S2杂交育种：将步骤S1正季种植的黄瓜育种主干亲本和抗源亲本杂交，获得杂种F1代；

S3制备粗毒素提取液：将黄瓜枯萎病病原菌菌种转接在SDA培养基上，28℃恒温培养72h，挑取1个单菌落接种到100ml的PD液体培养基中，28℃摇床振荡培养5-7d获得菌培养液；将菌培养液通过双层无菌滤纸过滤除去菌丝体，然后用0.22μm微孔滤膜加压抽滤得无菌滤液，将滤液以6000r/min离心处理20min，取上清液即为粗毒素提取液，保存备用；

S4对黄瓜育种主干亲本和抗源亲本分别进行花药诱导培养：在初花期采集两个亲本进入单核靠边期的花蕾，将花蕾预处理后置于超净工作台上，先用75%酒精灭菌60s，用无菌水冲洗1-2次，再转入0.1% HgCl₂中，震荡处理 10min，用无菌水冲洗3-5次；冲洗干净后将花蕾平摊在干燥无菌的滤纸上吸干花蕾表面水分，用镊子剥取花药（不能携带花丝）接种于愈伤组织诱导培养基中，置于23-27℃的黑暗环境中培养28-35d分别诱导出愈伤组织；

S5确定粗毒素筛选压：预先制备好添加了梯度浓度粗毒素提取液的一系列花药分化培养基，然后将步骤S4中获得的黄瓜育种主干亲本和抗源亲本花药愈伤组织分别转接到上述分化培养基上进行培养，筛选出二者花药愈伤组织分化率均在1.5%-2.5%的分化培养基对应添加的粗毒素浓度，将两个粗毒素浓度的平均值作为黄瓜花药分化培养粗毒素筛选压；

S6杂种F1代花药培养：将杂种F1代的种子正季种植于大田，田间管理采取稀植点播，待植株进入初花期时，选取长势旺盛、健壮无病植株上的花药进行诱导培养，培养方法同步骤S4，将获得的愈伤组织转接到添加了枯萎病粗毒素筛压的分化培养基上进行培养，获得花培幼苗；

S7花培幼苗生根后移栽：待上述花培幼苗株高长至2-4cm后转接到生根培养基上培养26-34d，然后选择生长健壮、根系发育良好的花培苗在培养室内打开瓶口炼苗5-7d，然后移栽到温室中，在适宜的条件下进行常规栽培管理；

S8枯萎病抗性鉴定与后代筛选：将成熟的黄瓜花培苗进行单株收种获得不同花培家系，进一步大田种植，对其抗病性进行接种鉴定，筛选出枯萎病高抗且农艺和产量性状与育种主干亲本相近的单株，再经1-2 代系谱选择即获得黄瓜枯萎病抗性新品系。

2.根据权利要求1所述的一种黄瓜枯萎病抗性育种方法，其特征在于，所述步骤S3中粗毒素提取液的保存方法为将粗毒素提取液装在密闭容器中，置于冰箱4℃保存。

3.根据权利要求1所述的一种黄瓜枯萎病抗性育种方法，其特征在于，所述步骤S4中筛选进入单核靠边期花蕾的方法为：采取长度为0.9-1.5cm的闭合花蕾，进一步将花粉用醋酸洋红染色法压片、镜检，筛选出小孢子处于单核靠边期的花蕾。

4.根据权利要求1所述的一种黄瓜枯萎病抗性育种方法，其特征在于，所述步骤S4中花蕾预处理的方法为：先用自来水冲洗花蕾，再用蒸馏水冲洗2-3次，将其放入铺有湿润滤纸的培养皿上，将培养皿置于4℃冰箱里处理48h；期间每天喷水1次，始终保持花蕾及滤纸湿润。

5.根据权利要求1所述的一种黄瓜枯萎病抗性育种方法，其特征在于，所述步骤S4中愈伤组织诱导培养基的成分为：N6+半胱氨酸盐酸盐25mg/L+脯氨酸3.6mg/L+复肽核酸0.6mg/L+硝酸镧1.7mg/L+甜菜碱20mg/L+葡萄糖13g/L+硫酸二乙酯2.6mg/L+2，4-D 1.0mg/L+胺新脂0.1mg/L+亚精胺2.7mg/L+黄瓜汁54mL/L+迷迭香提取液33mL/L，pH值为5.8。

6.根据权利要求1所述的一种黄瓜枯萎病抗性育种方法，其特征在于，所述步骤S4与S6中未添加粗毒素的分化培养基的成分为：KNO₃2200mg/L，NH₄NO₃ 564mg/L，MgSO₄·7H₂O280mg/L，NaH₂PO₄ 150mg/L，CaCl₂·2H₂O 255mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O5.5mg/L，H₃BO₃ 6.4mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，CuSO₄·5H₂O0.25mg/L，Fe-Na₂EDTA 33.6mg/L，K₂Cr₂O₇ 0.019mg/L，肌醇85mg/L，烟酸1.4mg/L，甘氨酸2.0mg/L，色氨酸3.4mg/L，牛肉浸膏27mg/L，盐酸硫胺素0.3mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，泛酸1.2mg/L，姜黄素4.9mg/L，L-硒-甲基硒代半胱氨酸0.11mg/L，左旋肉碱5.5mg/L，迷迭香提取液33mL/L，腐殖酸40mg/L，6-BA2.0mg/L，康多酚 0.5mg/L，芸苔素内酯0.2mg/L，苯肽胺酸0.2mg/L，pH值为5.6~6.0；分化培养的条件为：温度23-27℃，光照强度1500-2000Lx，每天光照12-14h。

7.根据权利要求1所述的一种黄瓜枯萎病抗性育种方法，其特征在于，所述步骤S7中生根培养基的成分为：1/2MS +吲熟酯0.2mg/L+活性炭0.3g/L，pH值为5.6-6.0；生根培养的条件为：温度26-28℃，光照强度2400-2800Lx，每天光照14-16h。

8.根据权利要求1所述的一种黄瓜枯萎病抗性育种方法，其特征在于，所述步骤S7中适宜的条件是指白天温度控制在20-30℃，夜间温度控制在15-20℃，光照强度控制在2500-5000Lx，湿度控制在60-80%。

9.根据权利要求5和权利要求6所述的一种黄瓜枯萎病抗性育种方法，其特征在于，所述迷迭香提取液的制备方法为：将迷迭香植株放入蒸馏水中先煮沸0.5h，然后保持水温60-70℃提取2.5h，将汁液过滤除去固体残渣，再用无菌过滤器在超净工作台中过滤制成无菌提取液备用。