CN109168924A - 一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法，该培育方法包括以下步骤：1、选取茶树育种主干亲本和炭疽病抗源亲本；2、育种主干亲本和炭疽病抗源亲本杂交育种；3、对育种主干亲本和炭疽病抗源亲本进行粗毒素耐性浓度的测试；4、杂交F1代花药培养，粗毒素筛选；5、花培幼苗继代生根；6、花培苗炼苗移栽；7、花培苗田间定植后进一步筛选。本发明在茶树杂交育种的基础上对杂交F1代开展花药培养，并利用炭疽病粗毒素进行早期筛选，实现了茶树抗炭疽病定向培育，极大地缩短了茶树抗病育种周期，加速了抗病育种进程，对降低农药使用、保护环境、提升茶叶品质、推进茶树产业的健康发展都具有重要意义。

Description

一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法

技术领域

本发明涉及一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法，属于茶树培育种植领域。

背景技术

茶树 [Camellia sinensis (L.) O.Kuntze] 为多年生木本植物，在植物学分类上属于山茶目、山茶科、山茶属茶树种。中国是茶树的原产地，具体来说是中国的西南地区，包括云南、贵州、四川等山区是茶树的起源中心，因此中国也是世界上最早利用茶树的国家。茶树喜欢温暖湿润气候，平均气温10℃以上时芽开始萌动，最适生长温度为20~25℃，年降水量要在1000毫米以上，喜光耐阴，适于在漫射光下生长。茶树的树龄可达一二百年，其生育期可分为幼苗期、幼年期、成年期和衰老期，但经济年龄一般为成年期的40~50年。

茶树的经济价值主要在于茶树的芽叶可制茶。茶，又称茶叶、茗、荼、腊茶、茶芽、芽茶、细茶，与咖啡、可可并称为世界三大饮料。经过现代科学的分离和鉴定，茶叶中含有机化学成分达四百余种，无机矿物元素达四十多种。其中茶多酚类、植物碱、蛋白质、氨基酸、维生素、果胶素、有机酸、脂多糖、等成分对人体有保健功效，如抗氧化、抗肿瘤、降低血液中胆固醇、降血压、增强免疫力等。茶叶除可鲜用外，一般是经过加工精制备用。我国茶叶根据加工方法不同和品质差异，可分为绿茶、红茶、乌龙茶、白茶等。茶树品种的性状是其遗传特性的具体表现，这些性状会影响制茶品质，即形成茶树品种特有的茶类适制性。通常根据适制性可将茶树品种分为绿茶品种、红茶品种、乌龙茶品种和兼制品种。

由于茶树是多年生的经济作物，会受到各种不利外界环境因素的胁迫，如寒害、旱害、病虫害等，这些环境因子有时单独发生，有时协同作用，对茶树造成很大的伤害，轻则减产降质，重则死亡。茶树炭疽病是茶树的主要病害之一，该病害会影响茶树的生理代谢，造成茶树产量与茶叶品质的下降，各茶树产区常年因该病减产25%~30%，重病区减产可达40%~50%，每年造成的直接经济损失不可估量。茶树炭疽病是由炭疽菌属真菌侵染引起的，炭疽菌属是一类变异快，种类多，种内存在较多生理小种，地理分布和寄主范围均非常广泛的植物病原真菌。而该类病原菌侵害茶树的特点是一般从茶树嫩叶背部茸毛处侵入，菌丝体或分生孢子落在背部上时先粘附在茶叶茸毛上，然后萌发形成芽管侵入叶片组织，在条件恶劣时，有些炭疽菌分生孢子可呈附着状态在叶表面存活5个月左右，待环境适宜时侵入寄主，因此该类病原菌具有潜伏性。茶树炭疽病害的发生与流行受气候、栽培管理和品种抗性等多种因素的影响，其中主要气候原因是温度与空气湿度，温暖多雨的气候适宜炭疽病病原菌的生长与繁殖，因此我国南方的产茶区发病率更高。

在生产上，茶树炭疽病的防治方法主要有化学防治和物理防治。化学防治即使用化学药剂防治炭疽病，如喷施多菌灵、退菌特等抗菌剂，物理防治即在病害发生时，人工剪去发病部位的病枝或者摘除早期病果和病叶等，但这些方法不仅需要大量的人工操作，还会造成一系列如农残超标、抗药性增强及环境污染等问题，也无法从根本上解决茶树炭疽病的防治。利用茶树自身的遗传因素来抵御病害是最根本的方法，而茶树品种的抗病性强弱主要决定于茶树的遗传特性，因此根据炭疽病病害的特点，培育炭疽病抗性强的茶树品种，是有效控制炭疽病的发生与危害，推进茶树产业健康、快速发展的根本途径。

现今，茶树抗病品种的选育手段主要是单株选育，即从大量的群体中选择抗病性状比较突出的单株茶树，但该方法工作量巨大且具有一定的盲目性。其次就是将抗病品种与不抗病品种进行传统杂交育种，但由于茶树是异花授粉植物，长期进行天然杂交，在遗传上是高度杂合的，通过自交手段很难获得纯系，因此育种后代性状特性复杂而不稳定。而且茶树是多年生木本植物，生育周期长，用传统的育种方法选育需要花费很长的时间，并耗费大量的精力。近年来，生物技术育种有了长足的发展，如果在传统育种的基础上，开展茶树生物技术育种和分子水平研究，实现茶树生物技术定向培育高产优质和高抗新品种，将为茶树育种开拓新的研究领域。

在众多生物技术育种手段中，花药培养育种研究较为深入，操作相对简便，并已在多种作物育种上获得成功。花药培养是获得单倍体的主要途径，单倍体经自然或人工加倍后产生的纯合二倍体，在遗传上非常稳定，不发生性状分离，因此，花药培养育种能克服杂种分离现象，及早稳定分离后代、缩短育种年限。常规杂交育种一般要经过6~7个世代的连续自交才能得到相对稳定的后代，而花药培养育种只需将杂交F1代进行花药培养，得到纯合二倍体，即从杂交到得到稳定的纯系，仅相当于常规育种的F3，大大缩短了育种周期。而且花药培养过程中产生的单倍体由于染色体数量减半，可能会对外界的生物或非生物胁迫更加敏感，在此基础上进行早期筛选往往能获得更好的效果。目前，我国学者在茶树花药培养获得再生植株方面已经取得了一些研究成果，在此基础上，我们开展了红绿茶茶树抗炭疽病的育种工作，并成功开发出了一种能显著提高抗病筛选效率、缩短抗病育种周期、加快抗病育种进程的茶树育种方法，具有极大的推广价值。

发明内容

本发明针对现有茶树抗病育种中存在的育种程序复杂、育种周期漫长的缺点，提供了一种能著缩短茶树抗炭疽病育种周期、大大加快茶树抗炭疽病育种速度的茶树抗病育种新技术。

本发明提供了以下的技术方案：

一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法，其特征在于，该培育方法包括以下步骤：

1、选取茶树育种主干亲本和炭疽病抗源亲本

选取经济性状优良但炭疽病抗性不高的红绿茶茶树品种作为育种主干亲本；根据已有的茶树种质资源炭疽病抗性评价，筛选出高抗炭疽病且抗性稳定的茶树品种（系）作为炭疽病抗源亲本；

2、育种主干亲本和炭疽病抗源亲本杂交育种

在育种主干亲本和炭疽病抗源亲本的开花期，采用常规人工授粉的方法将二者进行杂交，结实后收获杂交F1代的种子；将杂交F1代正季播种育苗；

3、对育种主干亲本和炭疽病抗源亲本进行粗毒素耐性浓度的测试

育种主干亲本和炭疽病抗源亲本进入现蕾期后，分别对二者进行花药培养诱导出愈伤组织，当愈伤组织长到1~1.5mm时，将其转接到添加了梯度浓度茶树炭疽病粗毒素的分化培养基上进行分化培养，当育种主干亲本和炭疽病抗源亲本的愈伤组织分化率在1.3%~1.9%之间时，统计其分化培养基对应添加的粗毒素浓度，并取两者的平均值作为杂交F1代花药培养粗毒素筛选压；

4、杂交F1代花药培养，粗毒素筛选

杂交F1代生长发育进入现蕾期后，对其进行花药培养诱导出愈伤组织，当愈伤组织长到1~1.5mm时转接到添加了上述花药培养粗毒素筛选压的分化培养基上进行分化培养，获得茶树花培幼苗；

5、花培幼苗继代生根

待上述茶树花培幼苗长至3~5cm时，转接到生根培养基中，在温度23~27℃、光照强度2500~3000Lux、每天光照15~17h的条件下培养25-30d，获得根系生长旺盛的完整茶树花培苗；

6、花培苗炼苗移栽

待茶树花培苗长出3~4片真叶时，打开瓶口先在培养室内炼苗2~4天，再转移到温度为15~30℃、相对湿度为80~90%的温室中，利用自然光炼苗7~10天，然后将花培苗移栽到栽培基质中，温室常规栽培管理；

7、花培苗田间定植后进一步筛选

将温室栽培4个月左右的花培苗定植到田间，进行常规田间管理，在花培苗生长发育进入成年期的时间里，进一步筛选出炭疽病抗性得到改良并且经济性状优良的红绿茶茶树新品系；

所述步骤3和步骤4中花药培养诱导愈伤组织的过程如下：

1）花蕾采集与预处理：根据不同时期茶树花蕾的形态特征，在晴天上午采集大部分花粉发育时期处于单核中晚期的花蕾，将花蕾用洗涤剂清洗后再用自来水冲洗干净，然后将花蕾放入40g/L的甘露醇溶液中，4℃低温预处理3~5d；

2）花药消毒与接种：将预处理后的花蕾转入超净工作台中进行无菌操作，先将花蕾放入75%乙醇中浸泡60s，用灭菌水冲洗2~3次，再将花蕾放入0.1%氯化汞溶液中浸泡15min，边浸泡边轻轻震荡，再用灭菌水冲洗冲洗5~6次，然后从花蕾中剥离出花药，切去花丝后接种到半固体诱导培养基上进行诱导培养，35~42天后获得花药愈伤组织；

所述半固体诱导培养基的配方为：MS基本培养基+蔗糖25~33g/L+麦芽糖44~50g/L+植物凝胶2~4g/L+硫酸镨0.2~0.3mg/L+亚硫酸氢钠2.2~2.6mg/L+三十烷醇 0.15~0.20mg/L+1.2%多硝酚钾水剂 1.8~2.2mL/L+6-BA 1.0~1.2mg/L+羧甲基纤维素15~22g/L+陈皮素9~15mg/L+大豆异黄酮5.3~6.3mg/L+半胱氨酸盐酸盐22~28mg/L+鼠尾草提取物40~50ml/L，pH调节为5.6~6.0；

所述步骤3和步骤4中分化培养基的配方为：KNO₃ 2560~2680mg/L，KH₂PO₄ 330~350mg/L，(NH₄)₂SO₄ 502~514mg/L，MgSO₄·7H₂O 140~180mg/L，CaCl₂·2H₂O 410~460mg/L，MnSO₄·4H₂O 8.7~9.5mg/L，蛋氨酸锌 6.6~7.2mg/L，H₃BO₃ 5.8~6.4mg/L，KI 0.6~0.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.023~0.027mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.023~0.027mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.20~0.30mg/L，FeSO₄·7H₂O 27~28mg/L，Na₂-EDTA 36~37mg/L，硝普钠0.24~0.28mg/L，肌醇65~75mg/L，酵母氨基酸5.8~6.5mg/L，维生素B6 0.5~0.6mg/L，维生素B1 0.5~0.6mg/L，维生素K 0.3~0.5mg/L，姜黄素1.1~1.5mg/L，萘乙酸钠1.8~2.2mg/L，康多酚0.4~0.6mg/L，柠檬酸钛5.5~6.1mg/L，海藻糖6.1~6.9g/L，茶多酚36~44mg/L，麦芽糖31~35g/L，植物凝胶5~7g/L，pH值为5.6~6.0。

所述步骤1中茶树炭疽病抗源亲本还应满足花期与育种主干亲本一致或比较接近的条件。

所述步骤3中茶树炭疽病粗毒素的提取方法为：大田剪取感染炭疽病的茶树叶片，在无菌条件下挑取叶片上的病菌斑块接种到PDA培养基上，在23℃恒温培养5~7d进行扩繁，然后用直径为 5mm的打孔器取菌丝饼，每6块接种到300mL的Fries培养液中，在28℃黑暗的条件下振荡培养14d，将培养液用双层纱布过滤后，再用3500rpm离心20min收集上清液，50℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/10，然后再采用乙酸乙酯法提取出粗毒素。

所述步骤1）中花粉发育时期处于单核中晚期的茶树花蕾的形态特征为：花蕾未开，花萼全包被花瓣，花蕾横径0.95~1.1cm，花药橘黄色。

所述步骤2）中诱导培养的条件为：温度22~24℃，湿度55~65%，黑暗。

所述步骤3和4中分化培养的条件为：温度24~26℃，湿度55~65%，光照强度1500~2000Lux，每天光照11~13h。

所述步骤5中生根培养基的配方为：WPM培养基+聚蔗糖16~20g/L+胡萝卜泥10~15g/L+4-碘苯氧乙酸 0.4~0.6mg/L+环己酮酸钙0.3~0.5mg/L+硅藻土0.32~0.38g/L+丙三醇13.5~15.5mg/L，pH值为5.0~5.4。

所述诱导培养基的配方中，鼠尾草提取物的制备方法为：称取一定量的鼠尾草叶片，用粉碎机打成粉末，加入30倍体积的40%乙醇后置于60℃恒温萃取45min，双层滤纸过滤后滤渣再用40%乙醇洗涤2次，合并3次滤液并加热蒸发去除乙醇，即得到鼠尾草提取物。

与现有技术相比，本发明存在以下有益效果：

1、本发明针对现有的茶树花药培养中存在的愈伤组织诱导率和分化率较低的问题，通过高效调控茶树花药培养流程，不仅提高了愈伤组织诱导率和分化率，并摸索出一种特别适用于在添加粗毒素的条件下进行的分化培养流程，为利用茶树单倍体对粗毒素敏感的特点开展早期筛选工作提供了保障。

2、本发明在茶树杂交育种的基础上对杂交F1代开展花药培养，并利用炭疽病粗毒素进行早期筛选，实现了茶树抗炭疽病定向育种，8~9年即可获得茶树抗炭疽病性新品系，与茶树常规杂交育种二三十年的育种周期相比，显著缩短了育种年限，大大加快了茶树抗炭疽病改良育种的进程，对推进茶树产业的健康、快速发展具有积极作用。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

采用本发明的技术方案进行抗炭疽病红绿茶茶树的培育工作，具体步骤如下：

1、选取茶树育种主干亲本和炭疽病抗源亲本

根据育种目的，首先选取茶树品种劲峰作为育种主干亲本，劲峰是一个经济性状优良的茶树品种，它由福鼎大白茶和云南大叶种的自然杂交后代经系统选育而成，属小乔木，中叶，早生种，该品种所制炒青绿茶，条索肥壮紧实，绿润显毫，香高持久，滋味鲜浓，是制毛峰类绿茶的优质原料；制成工夫红茶，外形紧细，乌润有毫，香郁味甘；制成红碎茶，品质亦优良。目前该品种已在浙江、广西、安徽、江苏、湖北等地区的产茶区种植，但在生产实践中发现该品种对炭疽病表现为低抗。根据已有的茶树种质资源炭疽病抗性评价，我们筛选出一个高抗炭疽病且花期与劲峰接近，也为早生种的茶树品系云大72-4作为茶树炭疽病抗源亲本。

2、育种主干亲本和炭疽病抗源亲本杂交育种

2008年，在劲峰和云大72-4的开花期，采用常规人工授粉的方法将二者进行杂交，2009年结实后收获杂交F1代的种子；同年将杂交F1代正季播种育苗。

3、对育种主干亲本和炭疽病抗源亲本进行粗毒素耐性浓度的鉴定

2012年，劲峰和云大72-4进入现蕾期后，分别对二者进行花药培养诱导出愈伤组织，具体过程如下：

1）花蕾采集与预处理：根据不同时期茶树花蕾的形态特征，在晴天上午采集花萼全包被花瓣，横径0.95~1.1cm，花药橘黄色的未开花蕾，此时花蕾中大部分花粉发育时期处于单核中晚期，将花蕾用洗涤剂清洗后再用自来水冲洗干净，然后将花蕾放入40g/L的甘露醇溶液中，4℃低温预处理3~5d；

2）花药消毒与接种：将预处理后的花蕾转入超净工作台中进行无菌操作，先将花蕾放入75%乙醇中浸泡60s，用灭菌水冲洗2~3次，再将花蕾放入0.1%氯化汞溶液中浸泡15min，边浸泡边轻轻震荡，再用灭菌水冲洗冲洗5~6次，然后从花蕾中剥离出花药，切去花丝后接种到半固体诱导培养基（该培养基的配方为：MS基本培养基+蔗糖29g/L+麦芽糖47g/L+植物凝胶3g/L+硫酸镨0.25mg/L+甜菜碱2.4mg/L+三十烷醇 0.17mg/L+1.2%多硝酚钾水剂 2.0mL/L+6-BA 1.1mg/L+羧甲基纤维素18.5g/L+陈皮素12mg/L+大豆异黄酮5.8mg/L+半胱氨酸盐酸盐25mg/L+鼠尾草提取物45ml/L，pH调节为5.8；鼠尾草提取物的制备方法为：称取一定量的鼠尾草叶片，用粉碎机打成粉末，加入30倍体积的40%乙醇后置于60℃恒温萃取45min，双层滤纸过滤后滤渣再用40%乙醇洗涤2次，合并3次滤液并加热蒸发去除乙醇即得到鼠尾草提取物）上，在温度23℃、湿度60%、黑暗的条件下进行诱导培养，培养38d时将愈伤组织诱导率统计如下表1；

当愈伤组织长到1~1.5mm时，将其转接到添加了0、0.8%、1.6%、2.4%、3.2%、4.0%、4.8%浓度茶树炭疽病粗毒素（粗毒素的提取方法为：大田剪取感染炭疽病的茶树叶片，在无菌条件下挑取叶片上的病菌斑块接种到PDA培养基上，在23℃恒温培养5~7d进行扩繁，然后用直径为 5mm的打孔器取菌丝饼，每6块接种到300mL的Fries培养液中，在28℃黑暗的条件下振荡培养14d，将培养液用双层纱布过滤后，再用3500rpm离心20min收集上清液，50℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/10，然后再采用乙酸乙酯法提取出粗毒素）的分化培养基上，分化培养基的配方为：KNO₃ 2620mg/L，KH₂PO₄ 340mg/L，(NH₄)₂SO₄ 508mg/L，MgSO₄·7H₂O 160mg/L，CaCl₂·2H₂O 435mg/L，MnSO₄·4H₂O 9.1mg/L，蛋氨酸锌 6.9mg/L，H₃BO₃ 6.1mg/L，KI0.7mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.5mg/L，Na₂-EDTA 36.5mg/L，硝普钠0.26mg/L，肌醇70mg/L，酵母氨基酸6.2mg/L，维生素B6 0.55mg/L，维生素B1 0.55mg/L，维生素K 0.4mg/L，姜黄素1.3mg/L，萘乙酸钠2.0mg/L，康多酚0.5mg/L，柠檬酸钛5.8mg/L，海藻糖6.5g/L，茶树籽油4.0g/L，麦芽糖33g/L，植物凝胶6g/L，pH值为5.8，在温度25℃、湿度60%、光照强度1800Lux、每天光照12h的条件下进行分化培养，将愈伤组织分化率统计如下表2；

根据表2中的结果，当劲峰的愈伤组织分化率在1.3%~1.9%之间时，其分化培养基对应添加的粗毒素浓度为1.6%，当云大72-4的愈伤组织分化率在1.3%~1.9%之间时，其分化培养基对应添加的粗毒素浓度为3.2%，取两者的平均值浓度2.4%作为杂交F1代花药培养粗毒素筛选压。

4、杂交F1代花药培养，粗毒素筛选

2012年，杂交F1代生长发育开始进入现蕾期后，对其进行花药培养诱导出愈伤组织（诱导过程与步骤3相同），当愈伤组织长到1~1.5mm时转接到添加了2.4%粗毒素的分化培养基上进行分化培养（分化培养基配方和培养条件与步骤3相同），获得茶树花培幼苗。

5、花培幼苗继代生根

待上述茶树花培幼苗长至3~5cm时，转接到生根培养基中（生根培养基的配方为：WPM培养基+聚蔗糖18g/L+胡萝卜泥12.5g/L+4-碘苯氧乙酸0.5mg/L+环己酮酸钙0.4mg/L+硅藻土0.35g/L+丙三醇14.5mg/L，pH值为5.2），在温度25℃、光照强度2750Lux、每天光照16h的条件下培养25~30d，获得根系生长旺盛的完整茶树花培苗。

6、花培苗炼苗移栽

待茶树花培苗长出3~4片真叶时，打开瓶口先在培养室内炼苗2~4天，再转移到温度为15~30℃、相对湿度为80~90%的温室中，利用自然光炼苗7~10天，然后将花培苗移栽到栽培基质中，温室常规栽培管理；移栽1个月后统计移栽成活率为73.5%。

7、花培苗田间定植后进一步筛选

2013年，将温室栽培4个月左右的花培苗定植到田间，进行常规田间管理，随后几年在花培苗生长发育进入成年期的时间里，进一步筛选出了炭疽病抗性得到改良并且经济性状优良的2个红绿茶茶树新品系。

实施例2

为了比较不同的诱导培养基对茶树花药愈伤组织诱导率的影响，将实施例1步骤3中采用的诱导培养基替换为SJ-1+2，4-D 0.5mg/L+KT 2.0mg/L+蔗糖10%，该配方出自陈振光、廖惠华《茶树花药培养诱导单倍体植株的研究》，同样在温度23℃、湿度60%、黑暗的条件下进行诱导培养，培养38d时将劲峰和云大72-4的愈伤组织诱导率统计如下表3。

比较表1与表3的结果，表1中劲峰和云大72-4的愈伤组织诱导率分别达到了57.4%和46.9%，显著高于表3的28.5%和17.7%，表明本发明的诱导培养基对劲峰和云大72-4的花药诱导效果更好。原因可能是本发明的诱导培养基除了基本成分以外还添加了硫酸镨、甜菜碱、1.2%多硝酚钾水剂、羧甲基纤维素、陈皮素、大豆异黄酮、半胱氨酸盐酸盐、鼠尾草提取物，能够提高愈伤组织诱导率，降低培养过程中的愈伤组织褐化率。

实施例3

为了比较在添加粗毒素的条件下，不同的分化培养基对茶树愈伤组织分化率的影响，将实施例1步骤3中采用的分化培养基替换为N6+玉米素2.0mg/L+2,4-D 0.5mg/L+谷氨酰胺800mg/L +丝氨酸100 mg/L，该配方出自陈振光、廖惠华《茶树花药培养诱导单倍体植株的研究》，在分化培养基中加入浓度为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的粗毒素，同样在温度25℃、湿度60%、光照强度1800Lux、每天光照12h的条件下进行分化培养，将劲峰和云大72-4的愈伤组织分化率统计如下表4。

比较表2与表4的结果，表2中劲峰和云大72-4在添加不同浓度粗毒素的分化培养基上都有一定的愈伤组织分化率，并且成功得出杂交F1代花药培养的粗毒素筛选压；表4中这两个品种（系）的愈伤组织在添加不同浓度粗毒素的分化培养基上都未分化，未能得出粗毒素筛选压，说明在添加粗毒素的条件下，本发明的分化培养基对愈伤组织进一步分化的效果更好。原因可能是本发明的分化培养基不仅优化了基本培养基的成分，还添加了硝普钠、酵母氨基酸、姜黄素、康多酚0.5mg/L、柠檬酸钛5.8mg/L、海藻糖、茶树籽油，能够有效刺激茶树组织细胞中抗氧化防御系统，维持活性氧动态平衡，保护正常细胞膜结构，最终增强茶树的抗逆性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法，其特征在于，该培育方法包括以下步骤：

1、选取茶树育种主干亲本和炭疽病抗源亲本

选取经济性状优良但炭疽病抗性不高的红绿茶茶树品种作为育种主干亲本；根据已有的茶树种质资源炭疽病抗性评价，筛选出高抗炭疽病且抗性稳定的茶树品种（系）作为炭疽病抗源亲本；

2、育种主干亲本和炭疽病抗源亲本杂交育种

在育种主干亲本和炭疽病抗源亲本的开花期，采用常规人工授粉的方法将二者进行杂交，结实后收获杂交F1代的种子；将杂交F1代正季播种育苗；

3、对育种主干亲本和炭疽病抗源亲本进行粗毒素耐性浓度的测试

育种主干亲本和炭疽病抗源亲本进入现蕾期后，分别对二者进行花药培养诱导出愈伤组织，当愈伤组织长到1~1.5mm时，将其转接到添加了梯度浓度茶树炭疽病粗毒素的分化培养基上进行分化培养，当育种主干亲本和炭疽病抗源亲本的愈伤组织分化率在1.3%~1.9%之间时，统计其分化培养基对应添加的粗毒素浓度，并取两者的平均值作为杂交F1代花药培养粗毒素筛选压；

4、杂交F1代花药培养，粗毒素筛选

杂交F1代生长发育进入现蕾期后，对其进行花药培养诱导出愈伤组织，当愈伤组织长到1~1.5mm时转接到添加了上述花药培养粗毒素筛选压的分化培养基上进行分化培养，获得茶树花培幼苗；

5、花培幼苗继代生根

待上述茶树花培幼苗长至3~5cm时，转接到生根培养基中，在温度23~27℃、光照强度2500~3000Lux、每天光照15~17h的条件下培养25-30d，获得根系生长旺盛的完整茶树花培苗；

6、花培苗炼苗移栽

待茶树花培苗长出3~4片真叶时，打开瓶口先在培养室内炼苗2~4天，再转移到温度为15~30℃、相对湿度为80~90%的温室中，利用自然光炼苗7~10天，然后将花培苗移栽到栽培基质中，温室常规栽培管理；

7、花培苗田间定植后进一步筛选

将温室栽培4个月左右的花培苗定植到田间，进行常规田间管理，在花培苗生长发育进入成年期的时间里，进一步筛选出炭疽病抗性得到改良并且经济性状优良的红绿茶茶树新品系；

所述步骤3和步骤4中花药培养诱导愈伤组织的过程如下：

1）花蕾采集与预处理：根据不同时期茶树花蕾的形态特征，在晴天上午采集大部分花粉发育时期处于单核中晚期的花蕾，将花蕾用洗涤剂清洗后再用自来水冲洗干净，然后将花蕾放入40g/L的甘露醇溶液中，4℃低温预处理3~5d；

2）花药消毒与接种：将预处理后的花蕾转入超净工作台中进行无菌操作，先将花蕾放入75%乙醇中浸泡60s，用灭菌水冲洗2~3次，再将花蕾放入0.1%氯化汞溶液中浸泡15min，边浸泡边轻轻震荡，再用灭菌水冲洗冲洗5~6次，然后从花蕾中剥离出花药，切去花丝后接种到半固体诱导培养基上进行诱导培养，35~42天后获得花药愈伤组织；

所述半固体诱导培养基的配方为：MS基本培养基+蔗糖25~33g/L+麦芽糖44~50g/L+植物凝胶2~4g/L+硫酸镨0.2~0.3mg/L+亚硫酸氢钠2.2~2.6mg/L+三十烷醇 0.15~0.20mg/L+1.2%多硝酚钾水剂 1.8~2.2mL/L+6-BA 1.0~1.2mg/L+羧甲基纤维素15~22g/L+陈皮素9~15mg/L+大豆异黄酮5.3~6.3mg/L+半胱氨酸盐酸盐22~28mg/L+鼠尾草提取物40~50ml/L，pH调节为5.6~6.0；

所述步骤3和步骤4中分化培养基的配方为：KNO₃ 2560~2680mg/L，KH₂PO₄ 330~350mg/L，(NH₄)₂SO₄ 502~514mg/L，MgSO₄·7H₂O 140~180mg/L，CaCl₂·2H₂O 410~460mg/L，MnSO₄·4H₂O 8.7~9.5mg/L，蛋氨酸锌 6.6~7.2mg/L，H₃BO₃ 5.8~6.4mg/L，KI 0.6~0.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.023~0.027mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.023~0.027mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.20~0.30mg/L，FeSO₄·7H₂O 27~28mg/L，Na₂-EDTA 36~37mg/L，硝普钠0.24~0.28mg/L，肌醇65~75mg/L，酵母氨基酸5.8~6.5mg/L，维生素B6 0.5~0.6mg/L，维生素B1 0.5~0.6mg/L，维生素K 0.3~0.5mg/L，姜黄素1.1~1.5mg/L，萘乙酸钠1.8~2.2mg/L，康多酚0.4~0.6mg/L，柠檬酸钛5.5~6.1mg/L，海藻糖6.1~6.9g/L，茶多酚36~44mg/L，麦芽糖31~35g/L，植物凝胶5~7g/L，pH值为5.6~6.0。

2.根据权利要求1所述的一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法，其特征在于，所述步骤1中茶树炭疽病抗源亲本还应满足花期与育种主干亲本一致或比较接近的条件。

3.根据权利要求1所述的一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法，其特征在于，所述步骤3中茶树炭疽病粗毒素的提取方法为：大田剪取感染炭疽病的茶树叶片，在无菌条件下挑取叶片上的病菌斑块接种到PDA培养基上，在23℃恒温培养5~7d进行扩繁，然后用直径为 5mm的打孔器取菌丝饼，每6块接种到300mL的Fries培养液中，在28℃黑暗的条件下振荡培养14d，将培养液用双层纱布过滤后，再用3500rpm离心20min收集上清液，50℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/10，然后再采用乙酸乙酯法提取出粗毒素。

4.根据权利要求1所述的一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法，其特征在于，所述步骤1）中花粉发育时期处于单核中晚期的茶树花蕾的形态特征为：花蕾未开，花萼全包被花瓣，花蕾横径0.95~1.1cm，花药橘黄色。

5.根据权利要求1所述的一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法，其特征在于，所述步骤2）中诱导培养的条件为：温度22~24℃，湿度55~65%，黑暗。

6.根据权利要求1所述的一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法，其特征在于，所述步骤3和4中分化培养的条件为：温度24~26℃，湿度55~65%，光照强度1500~2000Lux，每天光照11~13h。

7.根据权利要求1所述的一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法，其特征在于，所述步骤5中生根培养基的配方为：WPM培养基+聚蔗糖16~20g/L+胡萝卜泥10~15g/L+4-碘苯氧乙酸0.4~0.6mg/L+环己酮酸钙0.3~0.5mg/L+硅藻土0.32~0.38g/L+丙三醇13.5~15.5mg/L，pH值为5.0~5.4。

8.根据权利要求1所述的一种抗炭疽病红绿茶茶树的培育方法，其特征在于，所述诱导培养基的配方中，鼠尾草提取物的制备方法为：称取一定量的鼠尾草叶片，用粉碎机打成粉末，加入30倍体积的40%乙醇后置于60℃恒温萃取45min，双层滤纸过滤后滤渣再用40%乙醇洗涤2次，合并3次滤液并加热蒸发去除乙醇，即得到鼠尾草提取物。