CN109169281A - 一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法 - Google Patents

一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，属于园艺植物种质保存技术领域。该方法包括以下步骤：S1、选种与预处理；S2、外植体灭菌与接种；S3、种质保存材料的获取；S4、试管苗干旱应激处理；S5、试管苗限制生长保存；S6、试管苗恢复生长；S7、试管苗生根；S8、驯化移栽。本发明首次建立了基于组织培养的玫瑰种质保存方法，该方法操作简便，稳定可靠，可重复性强，极大节省了土地、人力和物力，通过限制种质保存材料的生长有效地延长了玫瑰种质的保存时间，种质恢复生长后在增殖、生根、移栽各方面表现良好，是一种切实可行的玫瑰种质资源保存方法，为玫瑰的杂交育种以及商业生产奠定了基础。

Description

一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法
技术领域
本发明属于园艺植物种质保存技术领域，具体的涉及一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法。
背景技术
玫瑰（学名：Rosa rugosa Thunb.），是蔷薇科蔷薇属的落叶灌木，原产于亚洲东部地区，目前在全球范围内广泛种植，多分布于保加利亚、土耳其、摩洛哥、法国、俄罗斯等北半球国家。现在所称的玫瑰其实是一种广义上的玫瑰，是蔷薇属一系列原种、变种或杂交品种的总称。目前普遍将玫瑰分为两大类，即园林玫瑰和野生玫瑰。园林玫瑰是经过长期大量杂交育种而成的栽培品种，根据用途可分为切花和食用两大类。切花玫瑰花型秀美、色彩艳丽、气味芳香、形色俱佳，具有很高的观赏价值；食用玫瑰作为经济作物，其花朵主要用于食品及提炼香精玫瑰油，具有很高的开发价值和广阔的应用前景。
玫瑰在我国有2000多年的栽培历史。在我国古代，就有把玫瑰花用于泡露、熏茶、入药、酿酒、腌酱及做糕点馅料的习惯。《本草正文》中道：“玫瑰花，清而不浊，和而不猛，柔肝醒胃，疏气活血，宣通窒滞而绝无辛温刚燥之弊，断推气分药之中，最有捷效而最驯良，芳香诸品，殆无其匹”。明代卢和在《食物本草》中说：“玫瑰花食之芳香甘美，令人神爽” 。中医认为玫瑰花味甘，性温，气味芳香，药性平和，具有理气和血、排毒养颜、和血散淤、开窍化淤、疏肝醒脾、促进胆汁分泌、帮助消化、调节机理的功效。现代研究表明，玫瑰含有蛋白质、维生素、氨基酸、亚油酸、膳食纤维和微量元素等丰富的营养成分，并且含量远远高于普通水果和蔬菜，具有很高的营养价值。玫瑰的功能性成分包括挥发油、多糖、多酚类和黄酮类化合物，具有增强免疫力、抗氧化、降血糖、抗衰老、预防治疗心血管疾病、抗菌、抗病毒、利胆、解毒的作用。迄今，玫瑰已成为我国经济价值较高的药食同源植物，具有较好地药用价值和保健功能。目前筛选出的用于食用的玫瑰品种主要有：滇红玫瑰、墨红玫瑰、紫枝玫瑰、平阴玫瑰、苦水玫瑰、大马士革玫瑰以及千叶玫瑰。
我国是玫瑰种植大国，拥有丰富的野生玫瑰资源和栽培品种，充分利用我国丰富的种质资源，通过远缘杂交进行驯化育种，培育、筛选适合中国广大地域栽培的高抗性玫瑰新品种群，是我国发展玫瑰产业的当务之急。玫瑰种质资源的收集和保存，是现代玫瑰育种的基础。缺乏好的种质资源，新品种的品性就很难达到优良水平。目前玫瑰种质资源的保存途径主要是采用田间种植保存方法，但是该方法受到外界自然环境的限制，且易感染病毒、病害造成种质资源退化。种质离体保存是近些年来新发展且较为有效的种质保存方法，其中限制生长离体保存法应用最广。该方法以组织培养技术为基础，通过改变试管苗的生长环境，使细胞生长降至最小限度，延长继代间隔时间，减少继代次数，以避免频繁继代造成污染或引发种质变异，从而能有效地保证种质的遗传稳定性，实现植物种质资源的中长期保存目的。
目前种质限制生长离体保存技术已成功地应用于大蒜等多种无性繁殖植物种质资源保存，但未见有关玫瑰离体保存技术的报道。发明人通过研究限制玫瑰种质资源生长的主要影响因素及指标，摸索出了一种稳定可靠的玫瑰种质保存方法，为玫瑰种质资源中长期保存提供理论和实践依据，更为玫瑰的杂交育种以及商业生产工作奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是克服目前田间保存玫瑰种质资源的不足，提供一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，该方法不受自然条件的限制，可实现种质的中长期保存，并且种质保存效果良好，能够达到玫瑰种质资源研究利用的要求。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、选种与预处理
选择健壮无病的大田栽培的玫瑰植株，移入洁净棚内培养6~8天，以去除杂菌；从植株上剪取当年生的枝条用流动水冲洗干净后，浸入装有5~8mg/L的2,4-D溶液中，4℃低温预处理2~3天；
S2、外植体灭菌与接种
将上述枝条用毛刷蘸取洗衣粉水轻轻刷洗后转入超净工作台进行无菌操作，切取带腋芽茎段作为外植体，先用75%乙醇表面灭菌30s，再用0.1%升汞+3滴吐温20灭菌8min，每次灭菌后均用无菌水冲洗4~5次；最后用复合维生素溶液浸泡10min，滤纸吸去多余水分；用解剖刀将灭菌后的外植体两端接触升汞的部位切去，再切割成1~2cm带有1个腋芽的茎段，按其生长方向接种于培养基A中；
S3、种质保存材料的获取
①避光培养，将接好种的培养瓶置于温度为21±2℃的避光环境中培养，培养时间为12~15天；
②光照培养，将经避光培养的培养瓶移入温度为23±2℃培养室进行光照，光照时间10~12h/天，光照强度为1600~20001x，培养时间为3个月左右，将获得的试管苗作为种质保存材料；培养期间每个月对培养室进行消毒处理；
S4、试管苗干旱应激处理
将步骤S3获得的试管苗置于含有聚乙二醇的液体MS培养基中处理24h，模拟干旱逆境以提高试管苗的抗逆性；
S5、试管苗限制生长保存
将上述处理后的试管苗分割成具有1-3株芽苗的小块，转接至培养基B上，并在培养基表面倒入适量的无菌硅油，然后置于低温、弱光的条件下使试管苗缓慢生长，每14个月继代一次，继代次数最多不超过3次；
S6、试管苗恢复生长
当玫瑰种质需要恢复生长时，将步骤S5中存活的试管苗转接到培养基C上，培养条件控制为温度23±2℃，光照强度2000~2600lx，每天光照12~14h，每培养20~25天继代1次，继代2次；
S7、试管苗生根
将恢复生长的试管苗切成单株转接到半固体生根培养基中，生根培养基成分为 1/2MS（无琼脂）+0.3mg/L NAA+10g/L甘薯泥+3g/L植物凝胶，pH值为5.8；生根培养条件为温度25±2℃、光照强度2800~3200lx、每天光照12~14h，培养24~30天；
S8、驯化移栽
将试管苗转移到室外，在自然光照下先不打开瓶盖炼苗3d，再松开瓶口炼苗2天，然后完全打开瓶盖炼苗2d，最后用镊子将试管苗取出，将根部用1000倍50%多菌灵可湿性粉剂稀释液浸泡10~15min，然后移栽入装有栽培基质的穴盘上，正常进行水、肥、药管理；移栽后温度控制在18~30℃，空气相对湿度控制在75~85%。
所述步骤S2中培养基A的成分为MS+0.1mg/LGA3+0.4mg/L激动素+0.3mg/L亚硒酸钠+37mL/L番茄汁+7.8g/L蛋白胨+14g/L香蕉泥+1.5mg/L 天门冬素+0.06 mg/L富马酸糠醇甲酯+2.3mg/L24-表油菜素内酯，pH 值为5.6~6.0。
所述步骤S4中聚乙二醇的规格为PEG-6000，浓度为20%。
所述步骤S5中适量的无菌硅油指无菌硅油能完全覆盖培养基，并且高出培养基表面2~3cm。
所述步骤S5中低温、弱光的条件是指温度6~10℃、光照强度600~800lx、每天光照10~12h。
所述步骤S5中培养基B的成分为：903~925mg/L KNO3，737~750mg/L NH4NO3，210~220mg/L葡萄糖酸钙 ，180~190mg/L MgSO4·7H2O ，93~99mg/L KH2PO4，31~33mg/L MnSO4·4H2O，8.5~9.0mg/L ZnSO4·7H2O，5.9~6.3mg/L H3BO3，0.7~0.8mg/L KI，0.024~0.026mg/LCoCl2·6H2O ，0.23~0.27mg/L Na2MoO4·2H2O，33~35mg/L EDDHA-Fe，80~90mg/L肌醇，4~6mg/L脯氨酸，2~4mg/L甘氨酸，0.3~0.4mg/L 盐酸硫胺素，0.4~0.5mg/L 盐酸吡哆醇，12~15mg/Lε-聚赖氨酸，0.3~0.4mg/L维生素 C，20~24μmol/L嘧啶醇，2.5~2.9mg/L 2-氯-9-羟基芴-9-甲酸甲酯，6.0~6.4mg/L海藻糖，1.4~2.0mg/L改性淀粉，8.6~9.0mg/L亚精胺，44~48g/L蔗糖，15~20mg/L葫芦巴碱，3.3~3.7mg/L纳他霉素，35~40mL/L玫瑰浸提液，10~16g/L大蒜泥，20~25g/L甘薯泥，6~8g/L结冷胶，pH 值为5.6~6.0。
所述步骤S6中培养基C的成分为：MS+18~22mg/L 5'-鸟苷酸二钠+2.5~3.3g/L腐殖酸+0.7~0.9mg/L萘乙酸钠+0.3~0.7mg/L水杨酸+5.1~5.5mg/L氨基寡糖素+1.2~1.4mg/L胺鲜酯+0.9~1.3mg/L亚油酸+0.3~0.5mg/L氰钴胺+5~7g/L结冷胶，pH 值为5.6~6.0。
所述步骤S8中栽培基质由以下重量份原料组成：田园土15-20份、麸皮6-10份、红糖1-2份、草木灰6-10份、腐殖土5-9份、腐熟香蕉皮3-7份、稻壳2-6份、平菇菌渣6-8份。
所述培养基B中，玫瑰浸提液的制备方法为：取新鲜玫瑰花瓣捣碎，加入其5倍质量的纯化水，加热到70℃后保温60min，然后将汁液用200目纱布过滤除去杂质，再用微孔滤膜除菌过滤后加入灭过菌的培养基中。
本发明的有益效果具有以下几点：
（1）对玫瑰植株进行预处理，有利于降低污染，促进茎段萌动，使取材时间不受限制。
（2）在种质保存材料的获取阶段，采用经合理配比制成的培养基，促进玫瑰试管苗的诱导与生长，试管苗在培养瓶中无需再进行转接，减少了操作步骤，降低了人工成本，同时也降低了污染的风险。
（3）将试管苗置于适当的逆境进行胁迫诱导，使其体内产生对环境胁迫的响应以增强试管苗的抗逆性，进而提高试管苗长期保存后的存活率。
（4）对试管苗限制生长保存的关键环节进行了改良，通过降低培养温度、减少光照强度、减少氧气含量改变了保存培养的微环境，优化了培养基组分，使玫瑰试管苗的生长速率降至最小限度，从而延长继代间隔时间，减少继代次数，达到中长期保存玫瑰种质的目的。
（5）本发明技术保存的种质存活率高，经恢复生长后移栽到田间长势健壮，并且能保持培养前的优良性状。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
2012-2016年，以江苏沭阳长景园林苗木场栽培的大马士革玫瑰作为试验材料，按照本发明的技术方案进行以下种质保存试验：
S1、选种与预处理
选择健壮无病的大田栽培的玫瑰植株，移入洁净棚内培养6~8天，以去除杂菌；从植株上剪取当年生的枝条用流动水冲洗干净后，浸入装有6.5mg/L的2,4-D溶液中，4℃低温预处理2~3天；
S2、外植体灭菌与接种
将上述枝条用毛刷蘸取洗衣粉水轻轻刷洗后转入超净工作台进行无菌操作，切取带腋芽茎段作为外植体，先用75%乙醇表面灭菌30s，再用0.1%升汞+3滴吐温20灭菌8min，每次灭菌后均用无菌水冲洗4~5次；最后用复合维生素溶液浸泡10min，滤纸吸去多余水分；用解剖刀将灭菌后的外植体两端接触升汞的部位切去，再切割成1~2cm带有1个腋芽的茎段，按其生长方向接种于培养基A中（培养基A的成分为MS+0.1mg/LGA3+0.4mg/L激动素+0.3mg/L亚硒酸钠+37mL/L番茄汁+7.8g/L蛋白胨+14g/L香蕉泥+1.5mg/L 天门冬素+0.06 mg/L富马酸糠醇甲酯+2.3mg/L24-表油菜素内酯，pH 值为5.8）；
S3、种质保存材料的获取
①避光培养，将接好种的培养瓶置于温度为21℃的避光环境中培养，培养时间为12~15天；
②光照培养，将经避光培养的培养瓶移入温度为23℃培养室进行光照，光照时间11h/天，光照强度为18001x，培养时间为3个月左右，将获得的试管苗作为种质保存材料；培养期间每个月对培养室进行消毒处理；
S4、试管苗干旱应激处理
将步骤S3获得的试管苗置于含有浓度为20%聚乙二醇（规格：PEG-6000）的液体MS培养基中处理24h，模拟干旱逆境以提高试管苗的抗逆性；
S5、试管苗限制生长保存
将上述处理后的试管苗分割成具有1-3株芽苗的小块，转接至培养基B上（培养基B的成分为：914mg/L KNO3，744mg/L NH4NO3，215mg/L葡萄糖酸钙 ，185mg/L MgSO4·7H2O ，96mg/LKH2PO4，32mg/L MnSO4·4H2O，8.8mg/L ZnSO4·7H2O ，6.1mg/L H3BO3，0.75mg/L KI，0.025mg/L CoCl2·6H2O ，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，34mg/L EDDHA-Fe，85mg/L肌醇，5mg/L脯氨酸，3mg/L甘氨酸，0.35mg/L 盐酸硫胺素，0.45mg/L 盐酸吡哆醇，13mg/Lε-聚赖氨酸，0.35mg/L维生素 C，22μmol/L嘧啶醇，2.7mg/L 2-氯-9-羟基芴-9-甲酸甲酯，6.2mg/L海藻糖，1.7mg/L改性淀粉，8.8mg/L亚精胺，46g/L蔗糖，17.5mg/L葫芦巴碱，3.5mg/L纳他霉素，38mL/L玫瑰浸提液，13g/L大蒜泥，23g/L甘薯泥，7g/L结冷胶，pH 值为5.8），并在培养基表面倒入能完全覆盖培养基，并且高出培养基表面2~3cm的无菌硅油，然后置于8℃、光照强度700lx、每天光照12h的条件下使试管苗缓慢生长，每14个月继代一次，继代3次后统计试管苗的存活率；
培养基B中玫瑰浸提液的制备方法为：取新鲜玫瑰花瓣捣碎，加入其5倍质量的纯化水，加热到70℃后保温60min，然后将汁液用200目纱布过滤除去杂质，再用微孔滤膜除菌过滤后加入灭过菌的培养基中；
S6、试管苗恢复生长
将继代3次即保存了3年6个月的玫瑰种质进行恢复生长，将存活的试管苗转接到培养基C（培养基C的成分为：MS+20mg/L 5'-鸟苷酸二钠+2.9g/L腐殖酸+0.8mg/L萘乙酸钠+0.5mg/L水杨酸+5.3mg/L氨基寡糖素+1.3mg/L胺鲜酯+1.1mg/L亚油酸+0.4mg/L氰钴胺+6g/L结冷胶，pH 值为5.9）上，培养条件控制为温度23℃，光照强度2300lx，每天光照13h，每培养20~25天继代1次，继代2次后统计试管苗的增殖倍数；
S7、试管苗生根
将恢复生长的试管苗切成单株转接到半固体生根培养基中，生根培养基成分为 1/2MS（无琼脂）+0.3mg/L NAA+10g/L甘薯泥+3g/L植物凝胶，pH值为5.8；生根培养条件为温度25℃、光照强度3000lx、每天光照13h，培养24~30天后观察试管苗生长情况，统计生根率；
S8、驯化移栽
将试管苗转移到室外，在自然光照下先不打开瓶盖炼苗3d，再松开瓶口炼苗2天，然后完全打开瓶盖炼苗2d，最后用镊子将试管苗取出，将根部用1000倍50%多菌灵可湿性粉剂稀释液浸泡10~15min，然后移栽入装有栽培基质（栽培基质由以下重量份原料组成：田园土18份、麸皮8份、红糖1.5份、草木灰8份、腐殖土7份、腐熟香蕉皮5份、稻壳4份、平菇菌渣7份）的穴盘上，正常进行水、肥、药管理；移栽后温度控制在18~30℃，空气相对湿度控制在75~85%；移栽40d后统计移栽成活率。
实施例2
本实施例只取消了实施例1中步骤S4，来比较试管苗干旱应激处理对种质保存效果的影响。
实施例3
本实施例只将实施例1中试管苗限制生长环节所使用的培养基B替换为MS培养基，来比较本发明的继代培养基对种质保存效果的影响。
实施例4
本实施例只将实施例1中试管苗恢复生长环节所使用的培养基C替换为MS培养基，来比较本发明的恢复培养基对种质保存效果的影响。
结果统计
1、种质保存3年6个月后，将实施例1-4中各项统计数据汇总如下表1。
比较实施例1与实施例2的数据，发现实施例1的试管苗存活率高于实施例2，说明本发明的干旱应激处理，能够通过增强试管苗抗逆性来提高长期保存的存活率，本发明研究发现干旱应激诱导对促进玫瑰试管苗种质保存的进步效果不仅对玫瑰种质保存是重要发现，在植物种质保存领域也属于创新性的发现；比较实施例1与实施例3的数据，发现实施例1的各项数据指标都优于实施例3，说明本发明试管苗限制生长环节所使用的培养基B对玫瑰的种植保存起到了进步性效果，不仅可以提高种质材料的存活率，而且对种质的恢复生长也有重要影响；比较实施例1与实施例4的数据，发现实施例1种质恢复生长后的各项数据指标都优于实施例4，说明本发明试管苗恢复生长环节所使用的培养基C对玫瑰种质长期保存后的恢复生长具有良好效果。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、选种与预处理
选择健壮无病的大田栽培的玫瑰植株，移入洁净棚内培养6~8天，以去除杂菌；从植株上剪取当年生的枝条用流动水冲洗干净后，浸入装有5~8mg/L的2,4-D溶液中，4℃低温预处理2~3天；
S2、外植体灭菌与接种
将上述枝条用毛刷蘸取洗衣粉水轻轻刷洗后转入超净工作台进行无菌操作，切取带腋芽茎段作为外植体，先用75%乙醇表面灭菌30s，再用0.1%升汞+3滴吐温20灭菌8min，每次灭菌后均用无菌水冲洗4~5次；最后用复合维生素溶液浸泡10min，滤纸吸去多余水分；用解剖刀将灭菌后的外植体两端接触升汞的部位切去，再切割成1~2cm带有1个腋芽的茎段，按其生长方向接种于培养基A中；
S3、种质保存材料的获取
①避光培养，将接好种的培养瓶置于温度为21±2℃的避光环境中培养，培养时间为12~15天；
②光照培养，将经避光培养的培养瓶移入温度为23±2℃培养室进行光照，光照时间10~12h/天，光照强度为1600~20001x，培养时间为3个月左右，将获得的试管苗作为种质保存材料；培养期间每个月对培养室进行消毒处理；
S4、试管苗干旱应激处理
将步骤S3获得的试管苗置于含有聚乙二醇的液体MS培养基中处理24h，模拟干旱逆境以提高试管苗的抗逆性；
S5、试管苗限制生长保存
将上述处理后的试管苗分割成具有1-3株芽苗的小块，转接至培养基B上，并在培养基表面倒入适量的无菌硅油，然后置于低温、弱光的条件下使试管苗缓慢生长，每14个月继代一次，继代次数最多不超过3次；
S6、试管苗恢复生长
当玫瑰种质需要恢复生长时，将步骤S5中存活的试管苗转接到培养基C上，培养条件控制为温度23±2℃，光照强度2000~2600lx，每天光照12~14h，每培养20~25天继代1次，继代2次；
S7、试管苗生根
将恢复生长的试管苗切成单株转接到半固体生根培养基中，生根培养基成分为 1/2MS（无琼脂）+0.3mg/L NAA+10g/L甘薯泥+3g/L植物凝胶，pH值为5.8；生根培养条件为温度25±2℃、光照强度2800~3200lx、每天光照12~14h，培养24~30天；
S8、驯化移栽
将试管苗转移到室外，在自然光照下先不打开瓶盖炼苗3d，再松开瓶口炼苗2天，然后完全打开瓶盖炼苗2d，最后用镊子将试管苗取出，将根部用1000倍50%多菌灵可湿性粉剂稀释液浸泡10~15min，然后移栽入装有栽培基质的穴盘上，正常进行水、肥、药管理；移栽后温度控制在18~30℃，空气相对湿度控制在75~85%。
2.根据权利要求1所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述步骤S2中培养基A的成分为MS+0.1mg/LGA3+0.4mg/L激动素+0.3mg/L亚硒酸钠+37mL/L番茄汁+7.8g/L蛋白胨+14g/L香蕉泥+1.5mg/L 天门冬素+0.06 mg/L富马酸糠醇甲酯+2.3mg/L24-表油菜素内酯，pH 值为5.6~6.0。
3.根据权利要求1所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述步骤S4中聚乙二醇的规格为PEG-6000，浓度为20%。
4.根据权利要求1所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述步骤S5中适量的无菌硅油指无菌硅油能完全覆盖培养基，并且高出培养基表面2~3cm。
5.根据权利要求1所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述步骤S5中低温、弱光的条件是指温度6~10℃、光照强度600~800lx、每天光照10~12h。
6.根据权利要求1所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述步骤S5中培养基B的成分为：903~925mg/L KNO3，737~750mg/L NH4NO3，210~220mg/L葡萄糖酸钙 ，180~190mg/L MgSO4·7H2O ，93~99mg/L KH2PO4，31~33mg/L MnSO4·4H2O，8.5~9.0mg/LZnSO4·7H2O，5.9~6.3mg/L H3BO3，0.7~0.8mg/L KI，0.024~0.026mg/L CoCl2·6H2O ，0.23~0.27mg/L Na2MoO4·2H2O，33~35mg/L EDDHA-Fe，80~90mg/L肌醇，4~6mg/L脯氨酸，2~4mg/L甘氨酸，0.3~0.4mg/L 盐酸硫胺素，0.4~0.5mg/L 盐酸吡哆醇，12~15mg/Lε-聚赖氨酸，0.3~0.4mg/L维生素 C，20~24μmol/L嘧啶醇，2.5~2.9mg/L 2-氯-9-羟基芴-9-甲酸甲酯，6.0~6.4mg/L海藻糖，1.4~2.0mg/L改性淀粉，8.6~9.0mg/L亚精胺，44~48g/L蔗糖，15~20mg/L葫芦巴碱，3.3~3.7mg/L纳他霉素，35~40mL/L玫瑰浸提液，10~16g/L大蒜泥，20~25g/L甘薯泥，6~8g/L结冷胶，pH 值为5.6~6.0。
7.根据权利要求1所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述步骤S6中培养基C的成分为：MS+18~22mg/L 5'-鸟苷酸二钠+2.5~3.3g/L腐殖酸+0.7~0.9mg/L萘乙酸钠+0.3~0.7mg/L水杨酸+5.1~5.5mg/L氨基寡糖素+1.2~1.4mg/L胺鲜酯+0.9~1.3mg/L亚油酸+0.3~0.5mg/L氰钴胺+5~7g/L结冷胶，pH 值为5.6~6.0。
8.根据权利要求1所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述步骤S8中栽培基质由以下重量份原料组成：田园土15-20份、麸皮6-10份、红糖1-2份、草木灰6-10份、腐殖土5-9份、腐熟香蕉皮3-7份、稻壳2-6份、平菇菌渣6-8份。
9.根据权利要求6所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述培养基B中，玫瑰浸提液的制备方法为：取新鲜玫瑰花瓣捣碎，加入其5倍质量的纯化水，加热到70℃后保温60min，然后将汁液用200目纱布过滤除去杂质，再用微孔滤膜除菌过滤后加入灭过菌的培养基中。
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