CN113100059B - 一种金线莲长期离体保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金线莲长期离体保存方法，属于园艺植物种质资源保存领域。与组织培养结合，通过对金线莲培养基营养成分进行单一改变——添加淀粉，达到长期离体保存的效果，保存环境在常温下即可满足，且保存时间长，效果稳定，无毒害，是一条经济、简便、有效的金线莲种质资源保存途径，为金线莲的良种培育奠定技术基础。

Description

一种金线莲长期离体保存方法
技术领域
本发明属于园艺植物种质资源保存技术领域，具体涉及一种金线莲长期离体保存方法。
背景技术
种质保存（germplasm conservation）是指利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源，使个体中所含的遗传物质保持其遗传的完整性和较高的活力，并能够通过繁殖将其遗传特性传递下去。金线莲的种植保存容易受气候条件限制，在高温高湿条件下病害高发，且金线莲种子发芽率低，有性繁殖困难，传统的种质资源保存方法不能有效地保存金线莲种质资源；组织培养可将种质活体保存，但在保存过程中需定期对种质材料进行继代，但在频繁的继代过程中可能会发生变异，且到了后期，继代工作量、成本也会逐渐增加。而缓慢生长离体保存可以突破这一屏障，能够有效地保存金线莲种质资源。通过对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株。其最大的优点是可以使保存材料维持不生长，但不死亡或者少量死亡。
近年来，金铁锁、红根草、百合等多种药用植物的种质资源均进行了离体保存实验，并取得了成功，与金线莲同科属的部分兰科植物也进行了离体保存实验。目前，金线莲的研究热点主要是金线莲组织培养和金线莲提取物的研究，关于金线莲种质离体保存方面的研究少见报道。近日陈艺荃通过同时改变培养光照、调节培养基中渗透压和添加生长抑制剂的方法，将花叶金线莲离体保存12个月。而在此方法中需要改变的条件较多，除了需要调整培养基的营养物质和抑制剂，还要同时对培养条件进行光照变化，大大增加了生产过程的工作量和生产成本。
蔗糖作为碳源为植物细胞提供能量来源，利用不同的蔗糖浓度造成的渗透压对组培苗进行处理是比较常用的抑制方式。同样为多糖的淀粉（Starch）则不能被植株直接利用，是高分子碳水化合物，由单一类型的糖单元组成的多糖，在普通条件下很难被水解成葡萄糖，高温高压条件下可部分水解成葡萄糖，因此在植物组织培养中，很少使用淀粉。栗均平利用淀粉的回生作用，将淀粉替代琼脂培养马铃薯脱毒苗，组培苗可以正常生长，认为添加淀粉后可以减少有机物的使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金线莲长期离体保存方法，以期探索一条经济、简便、有效的金线莲种质资源保存途径，为金线莲的良种培育奠定技术基础。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种金线莲长期离体保存方法，包括以下步骤：
（1）培养基准备：在基础增殖培养基MS+2mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA中添加2-8g·L-1淀粉，琼脂7g·L-1，pH5.8~6；
（2）抑制生长处理：选取长势一致、生长健壮的无菌试管苗，在无菌条件下将其切成1±0.1cm的带有一个芽点的茎段，接种到步骤（1）的培养基上，置于温度23±2℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12h/d的条件下保存12个月以上；
（3）恢复生长：将金线莲茎段重新接种至MS+2mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA +0.5g·L-1AC+蔗糖30g·L-1，琼脂7g·L-1，pH5.8~6.4培养基上，在温度23±2℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12h/d条件下恢复生长3个月。
本发明的有益效果在于：
1.延长保存时间，抑制生长效率更高。
2.有效提高金线莲处理苗恢复生长后的成活率，且生长状态良好。
3.采用的食用淀粉价格低廉，获取方便，且对植物和操作人员无毒害性。
4.植株培养环境简单，只需常温下即可，可以降低因多次操作和因素改动造成的成本消耗，是一种更经济实惠的长期种质资源离体保存技术。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
（1）培养基准备：在基础增殖培养基MS+2mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA中添加30g·L-1蔗糖，琼脂7g·L-1，pH5.8~6增殖扩繁培养基为对照，记为CK；在基础增殖培养基MS+2mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA中各添加0、2、5、8g·L-1淀粉，琼脂7g·L-1，pH5.8~6，分别记为S0、S1、S2、S3。
（2）抑制生长处理：选取长势一致、生长健壮的无菌试管苗，在超净工作台的无菌条件下将其切成1cm左右的带有一个芽点的茎段，接种到处理培养基上。每瓶接种3个茎段，每个处理接种15瓶。接种后将其置于温度23±2℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12h/d的条件下保存。
（3）抑制生长观察：12个月后观测金线莲的存活率及生物学性状所得数据如表1，使用 Microsoft Excel 和 SPSS22.0 软件对试验数据进行分析。由表1可知，相对于添加了蔗糖的普通增殖培养基来说，添加了淀粉处理的培养基生长出的小苗其成活率不低于前者；在抑制效果方面，淀粉处理小苗的茎节数略有增加，而株高和平均节间长却低于正常小苗约50%。
通过比较不同浓度淀粉对金线莲组培苗各项指标的影响可得出：淀粉浓度为8g/L抑制效果最为明显。同时不同淀粉浓度处理下的小苗其生物学性状基本小于或与无添加物小苗持平，可认定为营养成分控制有效，基本排除渗透压影响。本方法在金线莲组培苗经过12个月的营养抑制后，抑制效果依旧稳定，目前还在持续保存中。
Figure 132061DEST_PATH_IMAGE002
注：LSD 测验，同一列数据的不同大写字母表示 0.01 水平上的差异显著，不同小写字母表示 0.05 水平上的差异显著，下表均同。
（4）恢复生长：将上述处理的金线莲组培苗，再进行增殖扩繁，均重新接种至MS+2mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA +0.5g·L-1AC+蔗糖30g·L-1，琼脂7g·L-1，pH5.8~6.4培养基上，每瓶接4个茎段，每个处理接15瓶，在温度23±2℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12h/d条件下恢复生长3个月，记录恢复生长的金线莲成活率和生物学性状。所得数据如表2。
（5）恢复生长观察：由表2可知，在恢复生长处理后，处理小苗的成活率为100%，在株高和平均节间长方面略低于正常生长小苗，但总体来说差异不大；恢复生长后的新生小苗的茎节数仍然略高于正常生长小苗。此外，恢复生长后的新生小苗在茎表面颜色、叶片颜色、和网脉色上与正常小苗相差无几，只是在根毛浓密程度上不如正常小苗，但其平均根数多于正常小苗。由上所述可见，处理苗在恢复生长后生长状态较好，与原正常生长小苗相差不大。
Figure 580360DEST_PATH_IMAGE004
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种金线莲长期离体保存方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）培养基准备：培养基为MS+2mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+8g·L-1淀粉+琼脂7g·L-1，pH5.8~6；
（2）抑制生长处理：选取长势一致、生长健壮的无菌试管苗，在无菌条件下将其切成1±0.1cm的带有一个芽点的茎段，接种到步骤（1）的培养基上，置于温度23±2℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12h/d的条件下保存12个月以上。
2.根据权利要求1所述的金线莲长期离体保存方法，其特征在于：长期离体保存后，金线莲恢复生长步骤包括：将金线莲茎段重新接种至MS+2mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA +0.5g·L-1AC+蔗糖30g·L-1+琼脂7g·L-1，pH5.8~6.4培养基上，在温度23±2℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12h/d条件下恢复生长3个月。
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用淀粉代替洋菜在马铃薯组织培养中的应用研究;栗均平等;《陕西农业科学》;20071231(第1期);第2-4节 *
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