CN110089427B - 一种金线莲种质资源的离体保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种金线莲种质资源的离体保存方法，包括以下步骤：外植体的选择和消毒、丛生芽的诱导与增殖、缓慢生长保存种质、保存后恢复再生培养和生根移栽。本发明具有操作简便、保存成本低，实用性强等优点，保存的种质恢复再生能力强、移栽成活率高，能较好地保持种质的优良特性；克服了现有技术中金线莲保存技术操作过程较为繁复、成本高、保存苗恢复再生能力差，移栽成活率低的缺陷。
Description
【技术领域】
本发明具体涉及一种金线莲种质资源的离体保存方法。
【背景技术】
福建金线莲(Anoictochilus roxburghii(Wall.)Lindl.)、台湾开唇兰(A.formosanus)，又称金线莲、金线兰、金不换、鸟人参等，是名贵珍稀中草药，为兰科开唇兰属多年生草本植物，我国主要分布在福建、台湾、浙江、江西、广东和广西等地。金线莲以全草入药，具有清凉退火、凉血固肺、祛伤解毒、滋补强壮等功效，在民间具有广泛药用价值，由于其治疗面广，疗效独特，被民间视为“神药”；近年来，金线莲又被应用于治疗高血压、糖尿病、肝炎及肿瘤等疾病，其药用、食用、观赏等多方面的优良品质日益受到人们的青睐，具有广阔的开发利用前景。随着金线莲产业的发展，野生金线莲资源日益枯竭，因此金线莲种质资源的保存刻不容缓。金线莲同其它兰花资源一样，主要是采用田间种植保存和组织培养保存，但金线莲种植保存过程中易受气候条件限制，尤其高温高湿环境条件下，茎腐病等病害危害严重，使活体保存工作难于开展，而组织培养保存需对种质材料进行频繁继代，工作量大，成本也高且可能会发生变异等问题。因此，研究探索一套符合金线莲特点的种质资源保存方法，是从业人员所迫切希望地。
缓慢生长法保存又称限制生长法保存，是在人为控制条件下，通过调节和改变某种或某几种培养条件，改变试管苗的生长环境，限制保存材料的生长，但又不至于死亡，从而延长继代间隔时间，减少继代次数，以避免频繁继代造成污染或引发种质变异，从而有效地保证种质的遗传稳定性，实现种质资源的中长期保存目的；保存材料可以长期维持缓慢而不断地生长，不受时间和空间限制，打破了生长季节限制，可随时提供材料，方便研究，同时具有节省空间，防止多代繁殖种性退化及病毒感染，保证了种质的优良性和纯洁性。
目前，关于金线莲的研究仅限于组培快繁、药用成分等方面，而国内尚未见采用缓慢生长保存法对金线莲种质进行离体保存的相关报道文献。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种金线莲种质资源的离体保存方法。
本发明是这样实现的：一种金线莲种质资源的离体保存方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：选择健康、无病虫害的金线莲母株为外植体，去除叶片、根系，留下茎段，先用2～3g/L的洗洁精溶液浸泡3～5min，再用自来水冲洗干净，然后将外植体放入无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，接着转入0.1％升汞溶液中进行摇床振荡消毒6～8min，取出并用无菌水冲洗3～5次，再用无菌纸巾吸干水分，切取带节茎段，备用；
(2)丛生芽诱导与增殖：取所述带节茎段，并接种到A培养基中进行初代培养，培养30～45d后诱导获得丛生芽；更换A培养基进行继代增殖培养35～40d，增殖2～3代后获得芽大小为0.5～0.8cm的丛生芽；
(3)缓慢生长保存种质：将所述丛生芽切割成单芽，接种到B培养基中进行缓慢生长保存18～24个月；
(4)保存后恢复再生培养：将(3)保存后的材料切取带节茎段和茎尖接种到A培养基中进行恢复培养45～50d，获得小芽可继续进行缓慢生长保存或生根培养及移栽种植。
进一步地，还包括步骤(5)：
生根移栽：将(4)获得的小芽切割成单芽，并接种于C培养基上进行培养，生根培养70～80d获得健壮生根苗，即可进行移栽种植。
进一步地，所述A培养基的组分为：KNO3 2000mg/L、(NH4)2SO4 270mg/L、NaH2PO4.2H2O 340mg/L、MgSO4·7H2O 500mg/L、CaCl2·2H2O300mg/L、MnSO4·H2O 10.0mg/L、ZnSO4·7H2O 2.0mg/L、H3BO3 3.0mg/L、KI 0.75mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素(VB1)8.0～10.0mg/L、烟酸(VB5)1.0～2.0mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100～150mg/L、(水解乳蛋白)LH 0.5～0.8g/L、白糖25.0～35.0g/L、凝固剂6.0～6.5g/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L、及吲哚丁酸(IBA)0.1～0.2mg/L；
B培养基的组分为：花宝1号1.0～1.2g/L、KNO3 1000mg/L、(NH4)2SO4 270mg/L、NaH2PO4.2H2O 340mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、CaCl2·2H2O150～300mg/L、MnSO4·H2O10.0mg/L、ZnSO4·7H2O 2.0mg/L、H3BO3 3.0mg/L、KI 0.75mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.5～0.8mg/L、烟酸(VB5)1.0mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、甘露醇10.0～20.0g/L、白糖10.0～20.0g/L、凝固剂6.8～7.3g/L；
C培养基的组分为：花宝1号1.3～1.5g/L、KNO3 900～950mg/L、NH4NO3 825～850mg/L、KH2PO4 88～100mg/L、MgSO4·7H2O 200～250mg/L、CaCl2·2H2O 220～330mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素1.0～3.0mg/L、烟酸1.0～2.0mg/L、盐酸吡哆醇5.0～10.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖20.0～25.0g/L、凝固剂7.0～7.5g/L、吲哚丁酸0.3～0.5mg/L、活性炭0.3～0.5g/L、及香蕉泥50.0～80.0g/L。
进一步地，所述步骤(1)中，摇床振荡的转速为120r/min；外植体取材时间为5～7月份。
进一步地，所述A、B、C培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且质量比琼脂粉：卡拉胶＝2：1。
进一步地，所述A、B、C培养基的pH值均为5.6～5.8；且丛生芽诱导与增殖培养、生根培养的培养条件均为如下：
培养温度(24±3)℃，在刚接种时先于自然光照条件下放置5～7d，之后光强1500～2000lx下光照10h/d。
进一步地，所述缓慢生长保存培养条件：培养温度(24±3)℃，光照强度前3个月1500～2000lx，3个月后500～1000lx，光照时间10h/d。
本发明的优点在于：仅需在常规组培室条件下，即可完成无菌系获得、缓慢生长保存、恢复再生培养等种质保存过程，具有操作简便、保存成本低，实用性强等优点，保存的种质恢复再生能力强、移栽成活率高，能较好地保持种质的优良特性，既保护了金线莲这一珍贵的药用资源，又具有重要的产业推广价值；克服了现有技术中金线莲保存技术操作过程较为繁复、成本高、保存苗恢复再生能力差，移栽成活率低的缺陷。
【具体实施方式】
实施例一
(1)外植体的选择与消毒：从福建龙岩市连城县原生境收集野生金线莲，选择健康、无病虫害的金线莲母株为外植体，去除叶片、根系，留下茎段，先用3g/L的洗洁精溶液浸泡5min，再用自来水冲洗干净，然后在超净工作台上将外植体放入无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，接着转入0.1％升汞溶液中进行摇床振荡消毒8min，最后在超净工作台上取出并用无菌水冲洗5次，再用无菌纸巾吸干水分，切取带节茎段，备用。
(2)丛生芽诱导与增殖：切取带节茎段，并接种到A培养基中进行初代培养，培养45d后诱导获得丛生芽；更换A培养基进行继代增殖培养，培养周期40d，增殖3代后获得芽大小为0.5～0.8cm的丛芽团作为缓慢生长保存的材料。
(3)缓慢生长保存种质：将诱导获得丛芽团切割成单芽，接种到B培养基中进行缓慢生长保存，保存周期18个月。
(4)保存后恢复再生培养：将保存后的材料切取带节茎段和茎尖接种到A培养基中进行恢复培养，培养50d，获得小芽进行生根培养及移栽种植。
(5)生根移栽：将上述获得的健壮的丛生芽切割成单芽，并接种于C培养基上进行培养，生根培养70d获得健壮生根苗，即可进行移栽种植。
其中，A培养基的组分为：KNO3 2000mg/L、(NH4)2SO4 270mg/L、NaH2PO4.2H2O340mg/L、MgSO4·7H2O 500mg/L、CaCl2·2H2O300mg/L、MnSO4·H2O 10.0mg/L、ZnSO4·7H2O2.0mg/L、H3BO3 3.0mg/L、KI 0.75mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素(VB1)9.0mg/L、烟酸(VB5)1.5mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇120mg/L、(水解乳蛋白)LH 0.6g/L、白糖30.0g/L、凝固剂6.3g/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L、及吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L；
B培养基的组分为：花宝1号1.1g/L、KNO3 1000mg/L、(NH4)2SO4 270mg/L、NaH2PO4.2H2O 340mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、CaCl2·2H2O 200mg/L、MnSO4·H2O 10.0mg/L、ZnSO4·7H2O 2.0mg/L、H3BO3 3.0mg/L、KI 0.75mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.5～0.8mg/L、烟酸(VB5)1.0mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、甘露醇15.0g/L、白糖15.0g/L、凝固剂7.1g/L；
C培养基的组分为：花宝1号1.4g/L、KNO3 920mg/L、NH4NO3 835mg/L、KH2PO4 90mg/L、MgSO4·7H2O 225mg/L、CaCl2·2H2O300mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素1.5mg/L、烟酸1.5mg/L、盐酸吡哆醇8.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖22.0g/L、凝固剂7.3g/L、吲哚丁酸0.4mg/L、活性炭0.4g/L、及香蕉泥60.0g/L。
实施例二
(1)外植体的选择与消毒：选择健康、无病虫害的台湾金线莲母株为外植体，去除叶片、根系，留下茎段，先用3g/L的洗洁精溶液浸泡5min，再用自来水冲洗干净，然后在超净工作台上将外植体放入无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，接着转入0.1％升汞溶液中进行摇床振荡消毒7min，最后在超净工作台上取出并用无菌水冲洗3次，再用无菌纸巾吸干水分，切取带节茎段，备用。
(2)丛生芽的诱导与增殖：切取带节茎段，并接种到A培养基中进行初代培养，培养40d后诱导获得丛生芽；更换A培养基进行继代增殖培养，培养周期38d，增殖3代后获得芽大小为0.5～0.8cm的丛芽团作为缓慢生长保存的材料。
(3)缓慢生长保存种质：将诱导获得丛生芽切割成单芽，接种到B培养基中进行缓慢生长保存，保存周期21个月。
(4)保存后恢复再生培养：将保存后的材料切取带节茎段和茎尖接种到A培养基中进行恢复培养，培养45d，获得小芽进行生根培养及移栽种植。
(5)生根移栽：将上述获得的健壮的丛生芽切割成单芽，并接种于C培养基上进行培养，生根培养75d获得健壮生根苗，即可进行移栽种植。
其中，A培养基的组分为：KNO3 2000mg/L、(NH4)2SO4 270mg/L、NaH2PO4.2H2O340mg/L、MgSO4·7H2O 500mg/L、CaCl2·2H2O300mg/L、MnSO4·H2O 10.0mg/L、ZnSO4·7H2O2.0mg/L、H3BO3 3.0mg/L、KI 0.75mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素(VB1)8.0mg/L、烟酸(VB5)1.0mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、(水解乳蛋白)LH 0.5g/L、白糖25.0g/L、凝固剂6.0g/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L、及吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L；
B培养基的组分为：花宝1号1.0g/L、KNO3 1000mg/L、(NH4)2SO4 270mg/L、NaH2PO4.2H2O 340mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、CaCl2·2H2O150mg/L、MnSO4·H2O 10.0mg/L、ZnSO4·7H2O 2.0mg/L、H3BO3 3.0mg/L、KI 0.75mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.5mg/L、烟酸(VB5)1.0mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、甘露醇10.0g/L、白糖10.0g/L、凝固剂6.8g/L；
C培养基的组分为：花宝1号1.3g/L、KNO3 900mg/L、NH4NO3 825mg/L、KH2PO4 88mg/L、MgSO4·7H2O 200mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇5.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖20.0g/L、凝固剂7.0g/L、吲哚丁酸0.3mg/L、活性炭0.3g/L、及香蕉泥50.0g/L。
实施例三
(1)外植体的选择与消毒：选择健康、无病虫害的花叶金线莲(自主选育的金线莲新品种)母株为外植体，去除叶片、根系，留下茎段，先用3g/L的洗洁精溶液浸泡5min，再用自来水冲洗干净，然后在超净工作台上将外植体放入无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，接着转入0.1％升汞溶液中进行摇床振荡消毒8min，最后在超净工作台上取出并用无菌水冲洗4次，再用无菌纸巾吸干水分，切取带节茎段，备用。
(2)丛生芽诱导与增殖：切取带节茎段，并接种到A培养基中进行初代培养，培养45d后诱导获得丛生芽；更换A培养基进行继代增殖培养，培养周期40d，增殖3代后获得芽大小为0.5～0.8cm的丛芽团作为缓慢生长保存的材料。
(3)缓慢生长保存种质：将诱导获得丛生芽切割成单芽，接种到B培养基中进行缓慢生长保存，保存周期24个月。
(4)保存后恢复再生培养：将保存后的材料切取带节茎段和茎尖接种到A培养基中进行恢复培养，培养50d，获得小芽进行生根培养及移栽种植。
(5)生根移栽：将上述获得的健壮的丛生芽切割成单芽，并接种于C培养基上进行培养，生根培养80d获得健壮生根苗，即可进行移栽种植。
其中，A培养基的组分为：KNO3 2000mg/L、(NH4)2SO4 270mg/L、NaH2PO4.2H2O340mg/L、MgSO4·7H2O 500mg/L、CaCl2·2H2O300mg/L、MnSO4·H2O 10.0mg/L、ZnSO4·7H2O2.0mg/L、H3BO3 3.0mg/L、KI 0.75mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素(VB1)10.0mg/L、烟酸(VB5)2.0mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇150mg/L、(水解乳蛋白)LH 0.8g/L、白糖35.0g/L、凝固剂6.5g/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA)2.0mg/L、及吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L；
B培养基的组分为：花宝1号1.2g/L、KNO3 1000mg/L、(NH4)2SO4 270mg/L、NaH2PO4.2H2O 340mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、CaCl2·2H2O 300mg/L、MnSO4·H2O 10.0mg/L、ZnSO4·7H2O 2.0mg/L、H3BO3 3.0mg/L、KI 0.75mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.8mg/L、烟酸(VB5)1.0mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、甘露醇20.0g/L、白糖20.0g/L、凝固剂7.3g/L；
C培养基的组分为：花宝1号1.5g/L、KNO3 950mg/L、NH4NO3 850mg/L、KH2PO4 100mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、CaCl2·2H2O 330mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素3.0mg/L、烟酸2.0mg/L、盐酸吡哆醇10.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖25.0g/L、凝固剂7.5g/L、吲哚丁酸0.5mg/L、活性炭0.5g/L、及香蕉泥80.0g/L。
另外，需要说明的是，在无特殊说明的情况下，本发明中的百分数均为质量百分数，且本发明中，花宝1号产地美国，其N、P、K质量比为7：6：19；琼脂粉、卡拉胶产地日本，强度分别为1400g/cm2、1500g/cm2；白糖为市售质量等级一级的袋装白砂糖。
本发明仅需在常规组培室条件下，即可完成无菌系获得、缓慢生长保存、恢复再生培养等种质保存过程，具有操作简便、保存成本低，实用性强等优点，保存的种质恢复再生能力强、移栽成活率高，能较好地保持种质的优良特性，既保护了金线莲这一珍贵的药用资源，又具有重要的产业推广价值；克服了现有技术中金线莲保存技术操作过程较为繁复、成本高、保存苗恢复再生能力差，移栽成活率低的缺陷。
Claims (6)
1.一种金线莲种质资源的离体保存方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：选择健康、无病虫害的金线莲母株为外植体，去除叶片、根系，留下茎段，先用2～3g/L的洗洁精溶液浸泡3～5min，再用自来水冲洗干净，然后将外植体放入无菌容器中，先用75％的酒精浸泡60s，接着转入0.1％升汞溶液中进行摇床振荡消毒6～8min，取出并用无菌水冲洗3～5次，再用无菌纸巾吸干水分，切取带节茎段，备用；
(2)丛生芽诱导与增殖：取所述带节茎段，并接种到A培养基中进行初代培养，培养30～45d后诱导获得丛生芽；更换A培养基进行继代增殖培养35～40d，增殖2～3代后获得芽大小为0.5～0.8cm的丛生芽；
(3)缓慢生长保存种质：将所述丛生芽切割成单芽，接种到B培养基中进行缓慢生长保存18～24个月；
(4)保存后恢复再生培养：将(3)保存后的材料切取带节茎段和茎尖接种到A培养基中进行恢复培养45～50d，获得小芽可继续进行缓慢生长保存或生根培养及移栽种植；
所述A培养基的组分为：KNO32000mg/L、(NH4)2SO4270 mg/L、NaH2PO4 · 2H2O 340mg/L、MgSO4·7H2O 500mg/L、CaCl2·2H2O300 mg/L、MnSO4·H2O 10.0mg/L、ZnSO4·7H2O 2.0mg/L、H3BO33.0mg/L、KI 0.75mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3 mg/L、盐酸硫胺素(VB1)8.0～10.0mg/L、烟酸(VB5)1.0～2.0mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100～150mg/L、水解乳蛋白(LH)0.5～0.8g/L、白糖25.0～35.0g/L、凝固剂6.0～6.5g/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L及吲哚丁酸(IBA)0.1～0.2mg/L；
B培养基的组分为：花宝1号1.0～1.2g/L、KNO31000mg/L、(NH4)2SO4270mg/L、NaH2PO4·2H2O 340mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、CaCl2·2H2O150～300mg/L、MnSO4·H2O 10.0mg/L、ZnSO4·7H2O 2.0mg/L、H3BO33.0mg/L、KI 0.75mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA 37.3mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.5～0.8mg/L、烟酸(VB5)1.0mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、甘露醇10.0～20.0g/L、白糖10.0～20.0g/L、凝固剂6.8～7.3g/L。
2.如权利要求1所述的一种金线莲种质资源的离体保存方法，其特征在于：还包括步骤(5)：
生根移栽：将(4)获得的小芽切割成单芽，并接种于C培养基上进行培养，生根培养70～80d获得健壮生根苗，即可进行移栽种植；
C培养基的组分为：花宝1号1.3～1.5g/L、KNO3900～950mg/L、NH4NO3825～850mg/L、KH2PO488～100mg/L、MgSO4·7H2O 200～250mg/L、CaCl2·2H2O 220～330mg/L、MnSO4·H2O16.9mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO36.2 mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、盐酸硫胺素1.0～3.0mg/L、烟酸1.0～2.0mg/L、盐酸吡哆醇5.0～10.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、白糖20.0～25.0g/L、凝固剂7.0～7.5g/L、吲哚丁酸0.3～0.5mg/L、活性炭0.3～0.5g/L及香蕉泥50.0～80.0g/L。
3.如权利要求1所述的一种金线莲种质资源的离体保存方法，其特征在于：所述步骤(1)中，摇床振荡的转速为120r/min；外植体取材时间为5～7月份。
4.如权利要求2所述的一种金线莲种质资源的离体保存方法，其特征在于：所述A、B、C培养基中的凝固剂均为琼脂粉与卡拉胶的混合物，且质量比琼脂粉：卡拉胶＝2：1。
5.如权利要求2所述的一种金线莲种质资源的离体保存方法，其特征在于：所述A、B、C培养基的pH值均为5.6～5.8；且丛生芽诱导与增殖培养、生根培养的培养条件均为如下：
培养温度(24±3)℃，在刚接种时先于自然光照条件下放置5～7d，之后光强1500～2000lx下光照10h/d。
6.如权利要求1所述的一种金线莲种质资源的离体保存方法，其特征在于：所述缓慢生长保存培养条件：培养温度(24±3)℃，光照强度前3个月1500～2000lx，3个月后500～1000lx，光照时间10h/d。
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