CN107593440A - 一种广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，包括以下步骤：(1)采集野生金线莲作为种苗；(2)对种苗进行初步高温钝化；(3)切去种苗的带2个节的带叶茎段后进行二次高温钝化；(4)取茎尖或茎段进行灭菌处理，然后切取部分茎尖或茎段作为外植体进行初代培养；(5)待外植体出现白色生长点时，切取白色生长点并转入初代培养基中进行初代培养；(6)待白色生长点长大成丛生芽后，转入继代培养基中进行继代培养；(7)待丛生芽增殖并长大成苗株且株高达5‑6cm时，转入诱导生根培养基中进行诱导生根，获得试管苗；(8)试管苗移至室外进行炼苗，获得合格的脱毒试管苗；(9)移植至室外环境下种植。该方法能有效地避免组培苗感染病毒，为大规模种植提供可靠保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法。
背景技术
金线莲别名金线兰、金丝草，为兰科开唇植物花叶兰属多年生珍稀中草药。它在民间使用范围较广，素有“药王”等美称。经有关部门测定发现，金线莲中氨基酸组成、成分、含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于国产和野生西洋参。其性凉味甘，有滋补、清热、解毒、降压、凉血、平肝等功效。民间用于治疗肺结核、肺热咳嗽、风湿性关节炎、小儿惊风、跌打损伤、蛇伤等多种疾病，均有很好的疗效。近年来，金线莲用于治疗高血压、糖尿病及肿瘤等疑难病症。金线莲不仅可加工成中药，而且可加工成饮料、口服液等金线莲系列保健食品。具有较高的药用价值及健身功用，符合当今人们日益增强的卫生保健意识，适应国内外市场需求，国内外有关方面正在推动的一系列农业生物科技研发计划，将金线莲植物列为保健食品研发重点，具有诱人的市场前景。
近几十年来，由于该药具有神奇的疗效，鲜品价格不菲，药农、村民在原生地过筛样滥采，野生资源已近枯竭。由于金线莲种子胚高度发育不全，自繁能力极低，该物种濒临灭绝。那么，如何在保护该物种与挖掘该药潜藏着巨大的经济价值之间达到最佳平衡点呢？在实验室进行组织培养并快速繁殖是较为常用的一种方法。
金线莲性喜荫凉，对环境要求较高，宜生环境狭窄。主要分布在广西、福建和台湾等省区，其中，以广西产的叶大而厚，金丝明显，有效成分高，质量最优；与福建和台湾省产的叶带青色的品种有明显差别。
目前，福建和台湾省产的金线莲通过植物组织培养进行快速增殖，人工种植形成了一定的规模。而广西金线莲种质资源组培苗尚不能规模种植，原因在于种植3个月后，易感染病毒而干枯死亡。现有技术采用切取茎尖作为外植体，存在过大带有病毒，过小不易操作的缺点；同时没有明确种苗采集季节及植株的初步处理。另一方面存在对初代培养基、继代培养基等的设计不够合理的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，该方法能有效地避免组培苗感染病毒，为大规模种植提供可靠保障。
为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：一种广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，包括以下步骤：
(1)采集野生金线莲，作为种苗；
(2)将所述的种苗置于烧杯中并加清水至浸没种苗根部，然后置于35-41℃的恒温箱中进行初步高温钝化；
(3)切去经过步骤(2)处理的种苗的带2个节的带叶茎段，然后进行对种苗进行清洗及灭菌处理，之后置于恒温箱中在37-42℃温度下进行二次高温钝化；
(4)于无菌工作台中取所述种苗茎尖或茎段进行灭菌处理，然后切取部分茎尖或茎段作为外植体转入初代培养基中进行初代培养；
(5)待外植体出现白色生长点时，切取白色生长点并转入初代培养基中进行初代培养；
(6)待所述白色生长点长大成芽丛后，转入继代培养基中进行继代培养；
(7)待所述芽丛增殖并长大成苗株且株高达5-6cm时，转入诱导生根培养基中进行诱导生根，获得试管苗；
(8)所述试管苗移至室外进行炼苗，获得合格的脱毒试管苗；
(9)将所述的脱毒试管苗移植至室外环境下种植。
所述步骤(1)中，优选地在每年10-11月进行野生金线莲采集。广西属于亚热带季风气候，春夏季节雨多湿度大，植株感染杂菌多，而选择10至11月份则雨水较少、干燥和紫外线强，这个季节的金线莲正好由营养生长向生殖生长过渡，活力最强，病毒感染少，抓住这一时间节点，可选取生长健壮无病害的植株作为种苗，这样从开始就能大大地降低组培苗的病毒感染。
所述步骤(2)中，所述初步高温钝化时间为72-96h，在处理过程中需要定时观察，及时添加清水，避免种苗被烘干。
作为本发明的一个实施例，所述步骤(3)中，采用灭菌洗衣粉溶液对种苗进行清洗及灭菌处理，其中灭菌洗衣粉溶液需浸没种苗，并振荡1-2min及静置1-2h，之后取出清洗干净再进行二次高温钝化。所述二次高温钝化时间为3-4h。
优选地，本发明所述的初代培养基含有以下成分：
MS+2.0-4.0mg/L6-BA+0.4-1.0mg/LZT+0.5-1.5mg/LNAA+3.0-4.0％蔗糖+0.57-0.6％琼脂PH5.5-5.8。
优选地，本发明所述的继代培养基含有以下成分：
MS+1.5-3.5mg/L6-BA+0.3-0.8mg/LZT+0.4-1.0mg/LNAA+3.0-4.0％蔗糖+0.57-0.6％琼脂PH5.5-5.8。
优选地，本发明所述的诱导生根培养基含有以下成分：
1/2MS+1.0-2.0mg/L6-BA+0.1-0.3mg/LZT+0.1-0.5mg/LIBA+3.0-4.0％蔗糖+0.57-0.6％琼脂PH5.5-5.8。
在本发明中，所述步骤(4)和(5)的初代培养、步骤(6)的继代培养和步骤(7)的诱导生根培养都在培养室中进行，培养条件为：温度23-28℃，光照2200-2800Lux，相对湿度80-85％。
本发明所述步骤(6)中，继代培养应不超过10代。
所述步骤(8)的炼苗过程中，是将苗株连同培养瓶一起移至室外环境中放置3-4天，使苗株逐步适应室外环境，而后打开瓶盖1天，过程中应注意在干燥时雾喷清水保湿。
本发明具有以下优点：
1.本发明通过对植株、外植体进行的二次高温钝化及一次细胞群的分离从而很好地达到了脱毒的目的。其一，在高温环境下，病毒分子的增殖受到强烈的抑制，处于钝化状态。而本发明采用的钝化温度对金线莲细胞来说是属于耐受温度范围，且时间把握得当，不会对植株造成伤害。其二，在外植体脱分化后，及时切取无病毒感染的细胞群，与原带病毒的母体及时分离，即病毒没有来得及增殖，外植体脱分化后形成的细胞群已及时分离，从而减少了感染病毒的风险。
2.通过对金线莲初代培养基、继代培养基与诱导生根培养基科学合理的设计，缩短了脱分化、再分化的时间，增殖系数达到5-6倍以上。
3.本发明根据金线莲的生长规律，在其金线莲活力最强的季节采集种苗，大大减少了病毒的感染。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围内所做的有限修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。
实施例1
(1)在每年10-11月进行野生金线莲采集。广西属于亚热带季风气候，春夏季节雨多湿度大，植株感染杂菌多，而选择10至11月份则雨水较少、干燥和紫外线强，这个季节的金线莲正好由营养生长向生殖生长过渡，活力最强，病毒感染少，抓住这一时间节点，可选取生长健壮无病害的金线莲植株作为种苗，这样从开始就能大大地降低组培苗的病毒感染。
(2)将采回多株金线莲分别置于250ml的烧杯中，加清水1cm浸过根部，再置于35℃的恒温箱中高温钝化，连续96h高温处理，定时观察，水干及时加清水。
(3)取出经步骤(2)处理后的金线莲，用剪刀切下带2个节的带叶茎段，然后用自来水冲洗干净，放进250ml的烧杯中，再加200ml清水及少量的灭菌洗衣粉浸泡过金线莲植株，振荡1分钟，静置1-2h，用镊子取出用自来水冲洗干净，再置于干净的接种碟中，接着送入恒温箱中再次高温钝化脱毒，温度37℃，时间为4h。
(4)取出经步骤(3)处理后的金线莲，在无菌工作台中，切去叶片，取茎尖或茎段进行灭菌处理，后在接种碟中切取茎尖部分作为外植体转入初代培养基中，进行初代培养。初代培养基是在MS培养基的基础上还含有以下成分：2.0mg/L 6-BA+0.4mg/L ZT+0.5mg/LNAA+3.0％蔗糖+0.57％琼脂，pH5.5-5.8。培养条件为：温度23-28℃，光照2200-2800Lux，相对湿度80-85％。
(5)初代培养7-10d左右后，外植体出现白色的生长点，此部分为无病毒的细胞群，切取该生长点转入初代培养基中进行初代培养。
(6)开始时生长点生长缓慢，基部逐渐长大，并分化出白色尖状小突起，经培养6个月左右，逐渐长大成芽丛，此时，可以进行第一次继代，以后每30天继代一次，一般继代培养不宜超过10代，以防发生变异。继代培养基是在MS培养基的基础上还含有以下成分：1.5mg/L 6-BA+0.3mg/LZT+0.4mg/LNAA+3.0％蔗糖+0.57％琼脂，pH5.5-5.8。培养条件为：温度23-28℃，光照2200-2800Lux，相对湿度80-85％。
(7)经多次继代培养后，芽丛长大成苗株且增殖达5-6倍。待株高达5-6cm时，转入诱导生根培养基中进行诱导生根，获得试管苗。诱导生根培养基是在1/2MS培养基的基础上还含有以下成分：2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L ZT+0.1mg/L IBA+3.0％蔗糖+0.57％琼脂，pH5.5-5.8。培养条件为：温度23-28℃，光照2200-2800Lux，相对湿度80-85％。
(8)将苗株连同培养瓶一起移至室外环境中放置3-4天，使苗株逐步适应室外环境，而后打开瓶盖1天完成炼苗，获得合格的脱毒试管苗。过程中应注意在干燥时雾喷清水保湿。
(9)将合格的脱毒试管苗夹出用清水冲洗干净根部的培养基，摆到有网格的篮子里荫干植表的水份，即可移植大棚及模拟人工野外生境种植。而在大棚及模拟人工野外生境种植过程中未发现植株有感染病毒干枯而死。
实施例2
(1)在每年10-11月进行野生金线莲采集。广西属于亚热带季风气候，春夏季节雨多湿度大，植株感染杂菌多，而选择10至11月份则雨水较少、干燥和紫外线强，这个季节的金线莲正好由营养生长向生殖生长过渡，活力最强，病毒感染少，抓住这一时间节点，可选取生长健壮无病害的金线莲植株作为种苗，这样从开始就能大大地降低组培苗的病毒感染。
(2)将采回多株金线莲分别置于250ml的烧杯中，加清水1cm浸过根部，再置于41℃的恒温箱中高温钝化，连续72h高温处理,定时观察，水干及时加清水。
(3)取出经步骤(2)处理后的金线莲，用剪刀切下带2个节的带叶茎段，然后用自来水冲洗干净，放进250ml的烧杯中，再加200ml清水及少量的灭菌洗衣粉浸泡过金线莲植株，振荡1分钟，静置1-2h，用镊子取出用自来水冲洗干净，再置于干净的接种碟中，接着送入恒温箱中再次高温钝化脱毒，温度42℃，时间为3h。
(4)取出经步骤(3)处理后的金线莲，在无菌工作台中，切去叶片，取茎尖或茎段进行灭菌处理，后在接种碟中切取茎尖部分作为外植体转入初代培养基中，进行初代培养。初代培养基是在MS培养基的基础上还含有以下成分：4.0mg/L 6-BA+1.0mg/L ZT+1.5mg/LNAA+3.0-4.0％蔗糖+0.57-0.6％琼脂，pH5.5-5.8。培养条件为：温度23-28℃，光照2200-2800Lux，相对湿度80-85％。
(5)初代培养7-10d左右后，外植体出现白色的生长点，此部分为无病毒的细胞群，切取该生长点转入初代培养基中进行初代培养。
(6)开始时生长点生长缓慢，基部逐渐长大，并分化出白色尖状小突起，经培养6个月左右，逐渐长大成芽丛，此时，可以进行第一次继代，以后每30-45d继代一次，一般继代培养不宜超过10代，以防发生变异。继代培养基是在MS培养基的基础上还含有以下成分：3.5mg/L 6-BA+0.8mg/L ZT+1.0mg/LNAA+4.0％蔗糖+0.6％琼脂，pH5.5-5.8。培养条件为：温度23-28℃，光照2200-2800Lux，相对湿度80-85％。
(7)经多次继代培养后，芽丛长大成苗株且增殖达5-6倍。待株高达5-6cm时，转入诱导生根培养基中进行诱导生根，获得试管苗。诱导生根培养基是在1/2MS培养基的基础上还含有以下成分：2.0mg/L 6-BA+0.3mg/LZT+0.5mg/L IBA+4.0％蔗糖+0.6％琼脂，pH5.5-5.8。
(8)将苗株连同培养瓶一起移至室外环境中放置3-4天，使苗株逐步适应室外环境，而后打开瓶盖1天完成炼苗，获得合格的脱毒试管苗。过程中应注意在干燥时雾喷清水保湿。
(9)将合格的脱毒试管苗夹出用清水冲洗干净根部的培养基，摆到有网格的篮子里荫干植表的水份，即可移植大棚及模拟人工野外生境种植。而在大棚及模拟人工野外生境种植过程中未发现植株有感染病毒干枯而死。
实施例3
(1)在每年10-11月进行野生金线莲采集。广西属于亚热带季风气候，春夏季节雨多湿度大，植株感染杂菌多，而选择10至11月份则雨水较少、干燥和紫外线强，这个季节的金线莲正好由营养生长向生殖生长过渡，活力最强，病毒感染少，抓住这一时间节点，可选取生长健壮无病害的金线莲植株作为种苗，这样从开始就能大大地降低组培苗的病毒感染。
(2)将采回多株金线莲分别置于250ml的烧杯中，加清水1cm浸过根部，再置于35-41℃的恒温箱中高温钝化，连续72-96h高温处理,定时观察，水干及时加清水。
(3)取出经步骤(2)处理后的金线莲，用剪刀切下带2个节的带叶茎段，然后用自来水冲洗干净，放进250ml的烧杯中，再加200ml清水及少量的灭菌洗衣粉浸泡过金线莲植株，振荡1分钟，静置1-2h，用镊子取出用自来水冲洗干净，再置于干净的接种碟中，接着送入恒温箱中再次高温钝化脱毒，温度37-42℃，时间为3-4h。
(4)取出经步骤(3)处理后的金线莲，在无菌工作台中，切去叶片，取茎尖或茎段进行灭菌处理，后在接种碟中切取茎尖部分作为外植体转入初代培养基中，进行初代培养。初代培养基是在MS培养基的基础上还含有以下成分：3.0mg/L 6-BA+0.8mg/L ZT+1.0mg/LNAA+3.5％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.5-5.8。培养条件为：温度23-28℃，光照2200-2800Lux，相对湿度80-85％。
(5)初代培养7-10d左右后，外植体出现白色的生长点，此部分为无病毒的细胞群，切取该生长点转入初代培养基中进行初代培养。
(6)开始时生长点生长缓慢，基部逐渐长大，并分化出白色尖状小突起，经培养6个月左右，逐渐长大成芽丛，此时，可以进行第一次继代，以后每30-45d继代一次，一般继代培养不宜超过10代，以防发生变异。继代培养基是在MS培养基的基础上还含有以下成分：2.0mg/L 6-BA+0.6mg/L ZT+0.8mg/LNAA+3.5％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.5-5.8。培养条件为：温度23-28℃，光照2200-2800Lux，相对湿度80-85％。
(7)经多次继代培养后，芽丛长大成苗株且增殖达5-6倍。待株高达5-6cm时，转入诱导生根培养基中进行诱导生根，获得试管苗。诱导生根培养基是在1/2MS培养基的基础上还含有以下成分：1.5mg/L 6-BA+0.2mg/LZT+0.25mg/L IBA+3.5％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.5-5.8。培养条件为：温度23-28℃，光照2200-2800Lux，相对湿度80-85％。
(8)将苗株连同培养瓶一起移至室外环境中放置3-4天，使苗株逐步适应室外环境，而后打开瓶盖1天完成炼苗，获得合格的脱毒试管苗。过程中应注意在干燥时雾喷清水保湿。
(9)将合格的脱毒试管苗夹出用清水冲洗干净根部的培养基，摆到有网格的篮子里荫干植表的水份，即可移植大棚及模拟人工野外生境种植。而在大棚及模拟人工野外生境种植过程中未发现植株有感染病毒干枯而死。
Claims (10)
1.一种广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)采集野生金线莲，作为种苗；
(2)将所述的种苗置于烧杯中并加清水至浸没种苗根部，然后置于35-41℃的恒温箱中进行初步高温钝化；
(3)切去种苗的带2个节的带叶茎段，然后进行对种苗进行清洗及灭菌处理，之后置于恒温箱中在37-42℃温度下进行二次高温钝化；
(4)于无菌工作台中取所述种苗茎尖或茎段进行灭菌处理，然后切取部分茎尖或茎段作为外植体转入初代培养基中进行初代培养；
(5)待所述外植体出现白色生长点时，切取白色生长点并转入初代培养基中进行初代培养；
(6)待所述白色生长点长大成丛生芽后，转入继代培养基中进行继代培养；
(7)待所述丛生芽增殖并长大成苗株且株高达5-6cm时，转入诱导生根培养基中进行诱导生根，获得试管苗；
(8)所述试管苗移至室外进行炼苗，获得合格的脱毒试管苗；
(9)将所述脱毒试管苗移植至室外环境下种植。
2.根据权利要求1所述广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，其特征是，所述步骤(1)中，在每年10-11月进行野生金线莲采集。
3.根据权利要求1所述广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，其特征是，所述步骤(2)中，所述初步高温钝化时间为72-96h，在处理过程中需要定时观察，及时添加清水，避免种苗被烘干。
4.根据权利要求1所述广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，其特征是，所述步骤(3)中，采用灭菌洗衣粉溶液对种苗进行清洗及灭菌处理，其中所述灭菌洗衣粉溶液需浸没种苗，并振荡1-2min及静置1-2h，之后取出清洗干净再进行二次高温钝化；所述二次高温钝化时间为3-4h。
5.根据权利要求1所述广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，其特征是，所述步骤(4)和(5)的初代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：
2.0-4.0mg/L6-BA+0.4-1.0mg/LZT+0.5-1.5mg/LNAA+3.0-4.0％蔗糖+0.57-0.6％琼脂，pH5.5-5.8。
6.根据权利要求1所述广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，其特征是，所述步骤(6)的继代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：
1.5-3.5mg/L6-BA+0.3-0.8mg/LZT+0.4-1.0mg/LNAA+3.0-4.0％蔗糖+0.57-0.6％琼脂，pH5.5-5.8。
7.根据权利要求1所述广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，其特征是，所述步骤(6)的诱导生根培养基在1/2MS培养基的基础上含有以下成分：
1.0-2.0mg/L6-BA+0.1-0.3mg/LZT+0.1-0.5mg/LIBA+3.0-4.0％蔗糖+0.57-0.6％琼脂，pH5.5-5.8。
8.根据权利要求1-7任一项所述广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，其特征是，所述步骤(4)和(5)的初代培养、步骤(6)的继代培养和步骤(7)的诱导生根培养都在培养室中进行，培养条件为：温度23-28℃，光照2200-2800Lux，相对湿度80-85％。
9.根据权利要求1所述广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，其特征是，所述步骤(6)中，继代培养应不超过10代。
10.根据权利要求1所述广西金线莲种质资源组培苗的脱毒方法，其特征是，所述步骤(8)的炼苗过程中，将苗株连同培养瓶一起移至室外环境中放置3-4天，使苗株逐步适应室外环境，而后打开瓶盖1天，过程中应注意在干燥时雾喷清水保湿。
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